使用电脉冲的血小板活化和生长因子释放的制作方法
【专利摘要】本申请公开了用于释放生长因子的方法和系统。在某些实施方案中，将血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列以触发样品中的生长因子释放。在某些实施方案中，生长因子释放不伴随血液样品凝固。
【专利说明】使用电脉冲的血小板活化和生长因子释放
[0001 ]发明背景
本文所公开的主题一般地涉及多种医学应用中使用的血小板治疗，例如手术或创伤治疗。具体地，所描述的实施方案涉及富血小板血浆中的血小板活化和生长因子释放。
[0002]血小板治疗为用于许多类型的损伤和病况的伤口愈合治疗，所述损伤和病况例如神经损伤、腱炎、骨关节炎、心肌损伤以及骨修复和再生。血小板治疗还可用于加速手术后的伤口愈合。
[0003]—般而言，医生可从患者抽血;然后将血液离心以产生富血小板血浆(PRP)。对于体内血小板活化，医生可将PRP施用到部位而不需加入血小板激活剂。血小板活化，其包括生长因子释放和凝固，常常由结缔组织中的胶原诱导。对于离体血小板活化，医生可通过加入典型的激活剂，例如凝血酶，触发PRP中的血小板活化，然后将活化的PRP施用到部位。
[0004]对于这样的离体应用，牛凝血酶可用于诱导血小板活化。然而，使用基于动物的凝血酶可引起过敏反应(allergic react1n)或可能的PRP被传染剂污染。基于动物的凝血酶的替代物往往昂贵并且可能仍引起过敏反应。
[0005]此外，存在其中期需生长因子释放但不期需后续凝固的一些伤口愈合应用。例如，医生可能希望向部位中注射具有释放的生长因子的PRP，这为关节损伤的常见治疗。将PRP样品暴露于多种类型的光(例如，红外线)可触发生长因子释放而无后续凝固。然而，该实验装置复杂，这在实验室安装可能昂贵并且耗时。另外，样品的光暴露时间可能很长，这随后将增加治疗的总时间。
[0006]发明概述
下文概述了与最初要求的发明在范围上相称的某些实施方案。这些实施方案不意在限制所要求发明的范围，而是这些实施方案仅意在提供本发明的可能形式的简要概述。事实上，本发明可包括可能与下文所阐述的实施方案相似或不同的多种形式。
[0007]在第一个实施方案中，用于诱导血液样品中的腺苷二磷酸(ADP)释放的方法包括将血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列以触发血液样品中的ADP释放。ADP的释放触发血小板活化和血液样品凝固。
[0008]在第二个实施方案中，用于释放生长因子的方法包括将血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列以触发血液样品中的生长因子释放。生长因子释放不伴随血液样品凝固。
[0009]在第三个实施方案中，用于治疗创伤的方法包括从患者收集血液样品。然后将血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列以触发血液样品中的生长因子释放而不伴随凝固。然后收集生长因子并用于治疗患者。
[0010]在第四个实施方案中，一种系统包括储存一个或多个处理器可执行程序的非-暂时性计算机-可读存储器。当执行时，所述处理器可执行程序可引起待应用于血液样品的一个或多个电脉冲序列。这可触发血液样品中的腺苷二磷酸(ADP)释放，其继而触发血小板活化和血液样品凝固。所述系统还包括配置以访问和执行在计算机-可读存储器中储存的一个或多个处理器可执行程序的处理器。
[0011]在第五个实施方案中，一种系统包括储存一个或多个处理器可执行程序的非-暂时性计算机-可读存储器。当执行时，所述处理器可执行程序引起待应用于血液样品的一个或多个电脉冲序列以触发血液样品中的生长因子释放。所述一个或多个电脉冲序列不引起与生长因子释放同时发生的血液样品凝固。所述系统还包括配置以访问和执行在计算机-可读存储器中储存的一个或多个处理器可执行程序的处理器。
[0012]附图
当参考附图阅读下列详述时本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，在所述附图中相似的字符代表整个图中的相似部分，其中:
图1为依照本方法的一个实施方案的脉冲发生系统的示意图；
图2为依照本方法的一个实施方案说明用于离体血小板活化的方法的流程图；
图3为依照本方法的一个实施方案说明用于离体生长因子释放的方法的流程图；
图4为依照本方法的另一个实施方案说明用于离体生长因子释放的方法的流程图；
图5说明使用牛凝血酶活化的富血小板血浆样品(左手侧)和暴露于电脉冲之后的富血小板血浆样品(右手侧)，其中生长因子释放在不凝固的情况下发生；
图6为显示图5中所说明的富血小板血浆样品中使用多种方法，包括本文所讨论的方法，释放的血小板衍生生长因子(PDGF)的量的图；
图7描绘暴露于脉冲电场的两个富血小板血浆样品，如关于某些实施方案所讨论的;和图8为显示图7中所说明的富血小板血浆样品中使用多种方法，包括本文所讨论的方法，释放的血小板衍生生长因子(PDGF)的量的图。
[0013]发明详述
本主题的一个或多个具体实施方案将在下文描述。为了提供这些实施方案的简明描述，说明书中可能不描述实际执行的所有特征。应理解的是在任何这些实际执行的开发中，如在任何工程或设计项目中，必须作出许多执行-特异性决定以取得开发者的特定目标，例如顺从系统相关的和业务相关的约束，这些约束可能随执行的不同而有所不同。此外，应理解这样的开发努力可能为复杂和耗时的，但对于受益于本公开内容的普通技术人员仍将是设计、制造和生产的常规工作。
[0014]当介绍本发明各个实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“所述(the)”和“所述”意在指存在一个或多个该要素。术语“包括”、“包含”和“具有”意在为包括在内的并且意指可存在所列要素之外的额外要素。
[0015]血小板活化和/或聚集可用于在体内和/或离体治疗创伤。常规过程期间，血液中的血小板暴露于血小板激活化合物，例如凝血酶，其诱导生长因子(例如，血小板衍生生长因子(PDGF))释放和凝固二者。对于体内血小板活化，在损伤部位施用或注射非活化的PRP。通常，结缔组织中的胶原触发血小板活化、生长因子释放和凝固。对于离体血小板活化，医生可从患者抽血，并离心血液样品以产生富血小板血浆(PRP)样品。可向PRP样品中加入氯化钙(CaCl2)和血小板激活化合物，例如凝血酶，以触发血小板活化和形成凝胶，然后将所述凝胶施用到伤口。然而，在血小板活化中使用基于动物的凝血酶可引起过敏反应或可能的PRP的样品污染。此外，基于动物的凝血酶的替代物往往昂贵，并且仍可能引起过敏反应。
[0016]本发明实施方案涉及离体血小板活化和生长因子释放，其包括用于释放生长因子而不引起通常与血小板活化相关的凝固事件的方法。特定的伤口愈合应用可涉及处理血液样品(包括PRP样品)，以释放生长因子而不凝固。本文所讨论的用于离体血小板活化的方法可包括将血液样品，例如PRP样品，暴露于电脉冲以触发血小板活化。在某些执行中腺苷二磷酸(ADP)的释放可作为响应脉冲电场的血小板活化释放的一部分观察到。用于离体生长因子释放的方法可能或可能不涉及在电刺激之前向血液样品中加入化学药品，如本文所讨论的。
[0017]考虑上述，图1示意性地显示了用于离体血小板活化和生长因子释放的脉冲发生系统10。所述系统10可包括脉冲发生线路12和电极组(或电极阵列)14和16。在所描绘的实施方案中，电极14和16在容器18的相对侧上间隔开。即，容器18放置在电极之间并且电极14和16经由触点20与脉冲发生线路连接(couple)。容器18配置为容纳含有血小板的样品22。在某些实施方案中，容器18可为一次性的并且可从包含电极14和16的样品支持物24取出。相应地，容器18的插入以及电极14和16与触点20的接触允许脉冲发生线路产生电脉冲，并且容器18中的样品22暴露于脉冲。如应理解的，容器18仅为样品容器的一个实例，任何配置为容纳样品22、接触电极14和16以及传导电脉冲的适当容器均可联合系统10使用。电极14和16之间的间隔可影响脉冲电场的强度，所述脉冲电场的强度定义为所应用的电压和容器间隙距离的比率。例如，将I cm宽的容器暴露于I kV脉冲产生I kV/cm的场强。
[0018]在某些实施方案中，所述系统可包括合适的控制和输入线路并且可在专用框架(dedicated housing)中执行或可与计算机或其它基于处理器的控制系统连接。系统10可包括控制脉冲发生线路12的处理器26或者与其通信。系统10的额外组件可包括储存由处理器26执行的指令的存储器28。这样的指令可包括用于脉冲发生线路12产生电脉冲的方案和/或参数。处理器26可包括，例如，多用途(general-purpose)单或多芯片微处理器。另外，处理器26可为任何常规专用处理器，例如应用-特异性的处理器或线路。存储器28可为任何合适的非暂时性计算机可读介质例如随机访问存储器、大容量存储装置、闪速存储装置或移动存储器。另外，显示器30可向操作者提供系统10操作相关的指示。系统10可包括用于激活脉冲发生线路12和/或选择适当参数的用户输入装置32 (例如，键盘、鼠标、触屏、轨迹球、手持装置例如PDA或智能电话或其任何组合)。
[0019]如本文所提供的脉冲发生系统10可作为用于血小板活化的单用装置或作为可用于除血小板活化之外的其它电场暴露应用，例如电穿孔的多用装置来实现，如本文所讨论的。此外，系统10可配置为根据一个或多个方案产生电脉冲。所述方案可通过用户输入生成和/或可储存在存储器28中以让用户选择。在一个实施方案中，脉冲发生线路12可在处理器26控制下操作以执行指定预设电场强度、脉冲长度和/或总暴露时间的方案。这样的方案可通过实验或理论研究确定。在其它实施方案中，系统10可配置为接收与电场强度、脉冲长度和/或总暴露时间相关的用户输入，即，用户可指定一个或多个这些操作参数。此外，系统10可配置为根据用户输入和/或储存的方案设置产生特定的脉冲形状或产生彼此可能互不相同的一系列脉冲。
[0020]在某些实施方案中，根据应用，系统10所产生的脉冲可具有约I纳秒-约100微秒的持续时间，和约0.1 kV/cm-约350 kV/cm的电场强度。如上文所提及的，脉冲的电场强度为应用的电压除以电极14和16之间的距离。尽管系统10所产生的脉冲具有至少0.1 kV/cm的电场强度，其不应超过包含细胞的悬浮液的击穿场(breakdown field)。
[0021]在一些实施方案中，脉冲发生系统10包括传感功能。即，脉冲发生系统10可配置为将样品22暴露于传感信号，该传感信号可为具有在用于血小板活化的电脉冲的电场强度之下的电场强度的电脉冲。脉冲发生系统10可，如图1所描绘的，包括电流传感线路34，其可采集和/或处理传感信号以估计样品22的一些电性能，所述电性能包括，但不限于电导率和电容率。电流传感线路34可与处理器26连接，所述处理器26可控制传感信号的产生和处理并且，在一些实施方案中，可实施部分处理。在其它实施方案中，电流传感线路34可包括专用的处理器以控制传感信号的处理并且可与处理器26通信以报告结果。或者，电流传感线路34可与脉冲发生线路12集成在一起(integral)。在又其它的实施方案中，传感信号的处理可通过如上所描述的专用处理器或处理器26进行。
[0022]用于使用离体血小板活化治疗损伤的方法40，如图2所说明的，可联合系统10使用。应理解的是方法40的某些步骤可由操作者实施，而该方法的其它步骤可通过系统10实施。在步骤42中，工作人员(例如，医生或护士)从患者抽血。在某些实施方案中，抽取的血液可在步骤44中经处理产生PRP样品。可使用多种适于血小板分离的技术，例如离心或过滤，以产生PRP样品。在这样的实施方案中，步骤46-54可使用PRP样品进行。或者，可跳过步骤44，并且方法40中的其余步骤可使用全血样品进行。在所描绘的实施中，在步骤46中向样品加入CaCl2,然后在步骤48期间经由系统10暴露于一个或多个脉冲。向样品加入CaCl2增加血小板之中的钙动员的可能性和量，其促进血小板活化。步骤48的电刺激在步骤50中触发样品中的ADP释放，其然后，联合CaCl2,在步骤52中触发血小板活化。在步骤54，具有活化的血小板的样品可然后施用到患者上的损伤部位。
[0023]如上文所提及的，血小板活化为在某些活化方法中涉及生长因子释放和凝固二者的过程。然而，在某些情况下，如果可能避免凝固活动可为期需的。如上文所讨论的，这可使用如本文所讨论的脉冲电场完成。
[0024]例如，转至图3，描述了用于触发生长因子释放而不凝固的方法60。方法60使用电脉冲，与血小板活化方法40类似，并且同样，可部分上通过系统10实施。在步骤62中，工作人员从患者抽血。在某些实施方案中，来自步骤62的血液样品可在步骤64中经处理产生PRP样品，如上文所指出的。在其它实施方案中，如上文所提及的，方法60的步骤66-70可使用全血样品进行。在步骤66中，样品经由系统10暴露于一个或多个脉冲，其在步骤68中触发生长因子释放。在该实施例中，暴露于脉冲电场之前或期间不添加CaCl2。然后可在步骤70中收集并储存释放的生长因子。
[0025]如所描述的，方法60与方法40类似，不同之处在于在电刺激之前向样品加入CaCl2。然而，该差异产生不同的结果，尽管仍然释放生长因子，但在样品中不发生凝固。因此，实施方案的执行后容器18包含仅有的和任何的所释放的生长因子。
[0026]图4说明了用于触发生长因子释放而不凝固的替代方法80。在步骤82中工作人员从患者抽血，然后可在步骤84中处理所述血液以产生PRP样品。或者，方法80的步骤86-9 2可使用全血样品进行。然后在步骤86中向样品加入CaCl2和ADP阻断化学药品(例如，腺苷三磷酸双磷酸酶)。在步骤88，经由系统1将样品暴露于一个或多个电脉冲，其在步骤90中触发生长因子释放。然后在步骤92中收集并储存释放的生长因子。在该实施例中，ADP阻断化学药品起作用以结合由于样品中CaCl2的存在而释放的任何ADP，未观察到凝固。
实施例
[0027]电刺激之前加入或不加入氯化钙和ADP阻断剂的富血小板血浆样品考虑前述讨论，图5说明两个3.7x浓缩的富血小板血浆(PRP)的样品。图5说明使用牛凝血酶活化的富血小板血浆样品(左手侧)，其中血小板活化伴随生长因子释放和凝固，如PRP不流向管底所表明的。相反，在右侧所示，描绘了暴露于电脉冲(如本文所讨论的)之后的富血小板血浆样品，其中发生生长因子释放但不凝固，如PRP流向管底所显示的。电脉冲刺激之前向右侧管中的PRP样品加入氯化钙和腺苷三磷酸双磷酸酶(一种腺苷二磷酸(ADP)阻断化学药品)。使用牛凝血酶活化血小板之前向左侧样品中加入氯化钙和腺苷三磷酸双磷酸酶。
[0028]如所说明的，和上文所指出的，使用牛凝血酶活化的样品一般保留在管尖端，这表明其已经凝固。因此，如可从本研究理解的，当使用凝血酶活化时ADP阻断不影响凝固级联，因此导致凝固。相反，右侧样品未显示另一样品中所观察到的凝固，因此更自由地向管底流动。由这些结果看来，认为当暴露于氯化钙和电脉冲二者时ADP阻断化学药品起作用以阻断从样品释放的ADP。随着ADP阻断，甚至在CaCl2存在时也未观察到凝固。如所描绘的，此为与使用牛凝血酶的情况的显著差异，得出当使用电刺激时ADP阻断影响凝固级联这一结论。因此，右侧样品与根据图4的方法80制备的样品相对应。
[0029]图6比较未活化的PRP样品、加入氯化钙和腺苷三磷酸双磷酸酶并用牛凝血酶活化的PRP样品以及加入氯化钙和腺苷三磷酸双磷酸酶并暴露于电脉冲的PRP样品所释放的血小板衍生生长因子(PDGF)的量。凝固在用牛凝血酶活化的PRP样品中发生，但不在暴露于电脉冲的PRP样品中发生。具体地，图6为显示图5中所说明的富血小板血浆样品中使用多种方法，包括本文所讨论的方法，释放的血小板衍生生长因子(PDGF)的量的图。如所显示的，脉冲电场可从血小板释放生长因子而不凝固。此外，暴露于电脉冲的PRP样品中释放的TOGF的量与用牛凝血酶活化的PRP样品中释放的PDGF的量相当。如上文所指出的，在暴露于电脉冲的PRP样品中无凝固发生。
[0030]电刺激之前加入或不加入氯化钙的富血小板血浆样品
将两个3.7x浓缩的PRP样品暴露于电脉冲。所得的样品管在图7中示出。具体地，图7描绘暴露于脉冲电场(在相同的电条件下)的两个富血小板血浆样品。右侧样品完全活化并凝固，如PRP不流向管底所证明的，并释放生长因子。左侧样品不凝固，如PRP流向管底所显示的;然而，仍发生生长因子释放，如图8中的数据所例示的(下文讨论)。
[0031]电刺激之前向右侧管中的PRP样品加入氯化钙，但不向左侧样品添加。即，右侧样品根据图2的方法40处理，而左侧样品根据图3的方法60处理。如所说明的，右侧管中的样品凝固并保留在管尖端，甚至当倒置时。相反，左侧样品不凝固并且当倒置时相对于管尖端向下流动。
[0032]图8描绘比较未暴露于电脉冲的PRP样品、暴露于脉冲电场而无氯化钙的PRP样品以及在氯化钙存在下暴露于脉冲电场的PRP样品所释放的血小板衍生生长因子(PDGF)的量的图表。凝固在包含氯化钙的PRP样品中发生，但不在无氯化钙且暴露于电脉冲的PRP样品中发生。具体地，图8为显示图7中所说明的富血小板血浆样品中使用多种方法，包括本文所讨论的方法，释放的血小板衍生生长因子(PDGF)的量的图。该图显示生长因子可在凝固或不凝固的情况下释放。无氯化钙的PRP样品中所释放的TOGF的量与具有氯化钙的PRP样品中所释放的PDGF的量相当。此外，无氯化钙的PRP样品中无凝固发生。
[0033]—个或多个所公开的实施方案，单独或组合，可提供对用于离体血小板活化和生长因子释放的医学技术有用的一个或多个技术效果。用于离体血小板活化的本发明技术使用电刺激以释放生长因子，例如血小板衍生生长因子。某些实施方案可允许操作者从血小板提取生长因子而不诱导凝固。此外，用于离体生长因子释放的本发明技术可部分上使用已经在许多医学实验室中存在的医学设备进行。说明书中描述的技术效果和技术问题仅作为实例提供并且不意在限制。应指出的是说明书中所描述的实施方案可具有其它技术效果并且可解决其它技术问题。
[0034]尽管本文仅说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域技术人员会想到许多修饰和变化。因此，应理解的是所附权利要求意在涵盖所有这些落入本发明真实精神内的修饰和变化。一些实施方案可用于体内血小板活化工作流。可通过电刺激触发PRP中的生长因子释放而不凝固，并在损伤部位注射该PRP。由此释放的生长因子可用于损伤部位的伤口愈合。此外，在某些实施方案中，血小板还可通过结缔组织中的胶原完全活化。
【主权项】
1.用于诱导血液样品中的腺苷二磷酸(ADP)释放的方法，包括: 将血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列中以触发血液样品中的ADP释放，其中所述ADP的释放触发血小板活化和血液样品凝固。2.权利要求1的方法，进一步包括在将所述血液样品暴露于所述一个或多个电脉冲序列之前向所述血液样品中加入CaCl2。3.权利要求1的方法，其中所述血液样品在暴露于所述一个或多个电脉冲序列之后包含释放的生长因子。4.权利要求3的方法，进一步包括使用所述释放的生长因子治疗患者。5.权利要求3的方法，其中所述生长因子包括血小板衍生生长因子。6.权利要求1的方法，其中所述一个或多个电脉冲具有约0.1 kV/cm-约350 kV/cm的电场强度。7.权利要求1的方法，其中所述一个或多个电脉冲具有约I纳秒-约100微秒的脉冲持续时间。8.权利要求1的方法，其中所述血液样品为全血样品或富血小板血浆。9.用于释放生长因子的方法，包括: 将血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列以触发所述血液样品中的生长因子释放，其中所述生长因子释放不伴随血液样品凝固。10.权利要求9的方法，进一步包括: 收集所述生长因子;和 用所述生长因子治疗患者，其中所述血液样品从所述患者获得。11.权利要求9的方法，其中在将所述血液样品暴露于所述一个或多个电脉冲序列之前不向所述血液样品添加氯化钙(CaCl2)。12.权利要求11的方法，其中所述方法进一步包括在将所述血液样品暴露于所述一个或多个电脉冲序列之前向所述血液样品中加入ADP阻断剂。13.权利要求9的方法，其中所述ADP阻断化学药品包括腺苷三磷酸双磷酸酶。14.权利要求9的方法，其中所述一个或多个电脉冲具有约0.1 kV/cm-约350 kV/cm的电场强度。15.权利要求9的方法，其中所述一个或多个电脉冲具有约I纳秒-100微秒的脉冲持续时间。16.权利要求9的方法，其中所述生长因子包括血小板衍生生长因子。17.权利要求9的方法，其中所述血液样品为全血样品或富血小板血浆。18.用于治疗创伤的方法，包括: 从患者收集血液样品； 将所述血液样品暴露于一个或多个电脉冲序列以触发所述血液样品中的生长因子释放而不凝固所述血液样品； 收集所述生长因子;和 用所述生长因子治疗所述患者。19.权利要求18的方法，其中所述生长因子包括血小板衍生生长因子。20.权利要求18的方法，其中所述一个或多个电脉冲具有约0.1 kV/cm-约350 kV/cm的电场强度。21.权利要求18的方法，其中所述一个或多个脉冲电场具有约I纳秒-约10微秒的脉冲持续时间。22.权利要求18的方法，其中将所述血液样品暴露于所述一个或多个电脉冲序列之前不向所述血液样品添加氯化钙(CaCl2)。23.权利要求18的方法，其中所述血液样品为全血样品或富血小板血浆。24.—种系统，包括: 储存一个或多个处理器可执行程序的非-暂时性计算机-可读存储器，其中当执行时，所述处理器可执行程序引起待应用于血液样品的一个或多个电脉冲序列以触发所述血液样品中的腺苷二磷酸(ADP)释放，其中所述ADP的释放触发血小板活化和所述血液样品凝固；和 配置以访问和执行计算机-可读存储器中储存的一个或多个处理器可执行程序的处理器。25.权利要求24的系统，其中所述血液样品在应用所述一个或多个电脉冲序列之前包含氯化钙(CaCl2 )。26.权利要求24的系统，其中所述血液样品为全血样品或富血小板血浆。27.权利要求24的系统，进一步包括配置以测定所述血液样品的一个或多个电性能的估计量的电流传感线路，并且其中所述一个或多个处理器可执行程序进一步包括当执行时引起待应用于所述血液样品的电脉冲的处理器可执行程序，其中所述电脉冲通过所述电流传感线路处理。28.—种系统，包括: 储存一个或多个处理器可执行程序的非-暂时性计算机-可读存储器，其中当执行时，所述处理器可执行程序引起待应用于血液样品的一个或多个电脉冲序列以触发所述血液样品中的生长因子释放，其中所述一个或多个电脉冲序列不引起与所述生长因子释放同时发生的所述血液样品凝固；和 配置以访问和执行在所述计算机-可读存储器中储存的一个或多个处理器可执行程序的处理器。29.权利要求28的系统，其中所述血液样品在应用所述一个或多个电脉冲序列之前不包含氯化钙(CaCl2 )。30.权利要求28的系统，其中所述生长因子包括血小板衍生生长因子。31.权利要求28的系统，其中所述血液样品为全血样品或富血小板血浆。32.权利要求28的系统，进一步包括配置以测定所述血液样品的一个或多个电性能的估计量的电流传感线路，并且其中所述一个或多个处理器可执行程序进一步包括当执行时引起待应用于所述血液样品的电脉冲的处理器可执行程序，其中所述电脉冲通过所述电流传感线路处理。
【文档编号】A61B18/12GK105899949SQ201580004722
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】V.B.內库莱斯, A.S.托雷斯, A.凯亚法, B.D-L.李, A.L.加纳
【申请人】通用电气公司