一种甲醛-dna加合物的测定方法
【专利摘要】一种甲醛?DNA加合物的测定方法，即DNA中HOMe?dA、HOMe?dG的测定方法，包括采用甲醛溶液暴露小牛胸腺DNA，DNA溶液进行酶水解并依次加入还原剂NaBH3CN、稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata?X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于100μL的30%甲醇水溶液，引入LC?MS/MS系统分析，可准确检测出Me?dA和Me?dG含量水平。本发明采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。
【专利说明】
一种甲醛-DNA加合物的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于DNA样本的理化检验技术领域，主要涉及DNA中N6-羟甲基-腺嘌呤 (HOMe-dA)和N 2-羟甲基-鸟嘌呤(HOMe-dG)加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相 色谱串联质谱仪(LC -MS/MS)测定DNA中甲醛-DNA加合物的方法。
【背景技术】
[0002] 甲醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物，如工业生产、机动车尾气和室内装 潢等；甲醛具有人类遗传毒性，被国际癌症研究机构（IARC)列为一类致癌物。活泼的醛基可 以进攻DNA上的亲核基团，形成DNA加合物，其中N 6-羟甲基-腺嘌呤(HOMe-dA)和N2-羟甲基-鸟嘌呤(HOMe-dG)是主要的甲醛-DNA加合物。这两种结构形式在单核苷状态下不稳定，用还 原剂转化为N 6-甲基-腺嘌呤(Me-dA)和N2-甲基-鸟嘌呤(Me-dG)才能被检出。
[0003] 目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有32P-后标记技术、酶联免 疫技术(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 技术建立的甲醛-DNA加合物(HOMe-dA和HOMe-dG)的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏 度高等特点，可用于DNA中甲醛-DNA加合物的定性定量分析。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种甲醛-DNA加合物的测定方法，即HOMe-dA和HOMe-dG的测定方法，包括以下具体步 骤： a、甲醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的甲醛溶液（甲醛溶液用 0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM)，对照组加入同等体积的roS溶液。将上述溶液放入 37 °C恒温培养箱中24 h;使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用 70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 yL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA-个吸收单位(0D)相当于 50 yg/mL〇
[0006] b、DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500 yL的10 mM PIPES/5 mM MgCl2缓 冲液(pH=7)中，向DNA溶液中加入30 mg NaBH3CN、20 yL混合内标和60U脱氧核糖核酸酶I， 在37°C中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U碱性磷酸酶在37°C中继续孵育2h。水 解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 iiL 30%甲醇水溶液，即为样 品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩 纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为10 ng/mL的[15N5]Me-dA和10 ng/mL的 [13Ci015N5]Me-dG。
[0007] c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的Me-dA和Me-dG标准工作溶液。
[0008] d、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶 液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰 面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
[0009] 色谱条件：Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色谱柱（4 ? 6 X 150 mm，3 Mi)，流动相体系选取A:甲醇和B:纯水，洗脱条件为等度洗脱:0-8 min: 50% A;流速为0.5 mL/min，进样量为5 uL〇
[0010] 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V， 离子源温度：550°C，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能:9 eV，驻留时间：200 ms。监测离子对为Me-dA: 266.1 - 150.2 定量离子对，266? 1 - 117? 2定性离子对；内标[15N5]Me-dA为271 ? 2-155? 2;Me-dG: 282? 2- 166.2定量离子对，282.2-117.1定性离子对；内标[13Ci015N5]Me-dG为297.2-176.2。
[0011 ] 各分析物及内标的MRM参数见表1。分析过程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1软件来控制。
[0012] 表1多反应监测模式下分析物及其内标的MRM参数
*为定量离子 本发明方法的线性范围和检出限： 将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程以及相关系数。 1^-(^和]\^-(16标准曲线的点为0.02,0.05,0.1，0.2,0.5，1.0，1.5和2.0 1^/11^，两种内标 [15N5]Me-dA和[13Ci015N5]Me-dG浓度为2 ng/mL。目标物的线性良好，相关系数均大于 0.9999。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量 限，三倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲线及定量限和检出限见表2。
[0013] 表2分析物的标准工作曲线及L0D和L0Q
本发明方法加标回收率和重复性： 采取小牛胸腺DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水 平，每个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表3。目标物的回收 率在91.8%-107.0%之间，RSD小于5%，证明方法的准确性和重复性结果较好。
[0014] 表3分析物的加标回收率和重复性
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对DNA中甲醛-DNA加合物的色 谱条件进行了优化，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发明方 法具有如下优良效果： ①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提 高，有利于DNA中低含量的甲醛-DNA加合物的测定。
[0015] ②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
[0016] ③本发明方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中 引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及 洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机 溶剂的消耗量。
【附图说明】
[0017] 图1甲醛-DNA加合物的总离子流图。
[0018] 图2不同甲醛暴露剂量下，小牛胸腺DNA中Me-dA和Me-dG的含量。
【具体实施方式】
[0019] 本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0020] 一种DNA中甲醛-DNA加合物的测定方法，其测试过程是用甲醛溶液对小牛胸腺DNA 进行暴露，对DNA溶液进行酶水解并加入还原剂、稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经 Strata-X小柱固相萃取，收集洗脱液氮吹浓缩，引入LC-MS/MS系统分析。
[0021] 实例 1: 1.仪器与试剂： AB SCIEX三重四级杆串联质谱仪(美国加州应用生物系统公司），Agilent 1200高效 液相色谱(美国安捷伦公司），NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国赛默飞科技公司），恒 温培养箱(美国赛默飞科技公司），Milli-Q水纯化系统(德国默克集团），Analyst 1.5.1数 据采集与处理软件。
[0022] 脱氧核糖核酸酶I、碱性磷酸酶(美国纽英伦生物技术公司），磷酸二酯酶I和小牛 胸腺DNA (美国西格玛公司），甲醇（韩国德山试剂公司），NaBH3 CN (上海阿拉丁试剂公司）， Strata-X聚合物小柱(33 wn，30 mg/lmL，广东菲罗门科学仪器有限公司）。标准品Me-dA、 Me-dG 和内标物[15N5 ]Me-dA、[ 13C1Q15N5 ]Me-dG。试剂均为色谱纯。
[0023] 2 ?样品处理： 甲醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同浓度的甲醛溶液(0.001， 0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM)，对照组加入同等体积的PBS溶液。将上述溶液放入37 °C恒温 培养箱中24 h;使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇 水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 yL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分 光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA-个吸收单位相当于50 yg/mL。
[0024] DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500 yL的10 mM PIPES/5 mM MgCl2缓冲 液(pH=7)中，加入20此混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，随后加入 0.008U磷酸二酯酶I和30U碱性磷酸酶在37°C中继续孵育2h。水解液经1 mL甲醇活化和1 mL 纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100此30%甲醇水溶液，即为样品待测 液。
[0025] 3.测定方法： 吸取不同浓度的标准溶液和前处理之后的小牛胸腺DNA样品各5 yL，注入LC-MS/MS系 统进行分离分析，测得样本中甲醛-DNA加合物的含量。
[0026] 实例2 :如实施例1所述，利用本研究建立的方法对不同浓度甲醛（0.001，0.01， 0.05，0.1，0.5和1.0 mM)暴露的小牛胸腺DNA中甲醛-DNA加合物进行了检测(每个样本平行 检测三次）。依据标准曲线和峰面积得出各个样品中DNA加合物的浓度，根据公式
计算获得各个样品中DNA加合物相对于核苷酸的含量，结果乘以108换算成DNA加合物个数/ 1〇8个核苷酸。数据结果显示Me-dA和Me-dG的量与甲醛暴露剂量成效应关系（SPSS，P< 0.004,图 2)。
【主权项】
1. 一种甲醛-DNA加合物的测定方法，即DNA中N6-羟甲基-腺嘌呤(HOMe-dA)和N 2-羟甲 基-鸟嘌呤(HOMe-dG)的测定方法，其特征在于:包括以下具体步骤： a、 甲醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的甲醛溶液，对照组加入 同等体积的PBS溶液;将上述溶液放入37°C恒温培养箱中24 h;使用2倍体积的冰乙醇沉淀 DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入 200 yL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双 链DNA-个吸收单位(OD)相当于50 yg/mL; b、 DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500 yL的10 mM PIPES/5 mM MgCl2缓冲液 中，向DNA溶液中加入30 mg的NaBH3CN,将N6-羟甲基-腺嘌呤(HOMe-dA)和N2-羟甲基-鸟嘌 呤(HOMe-dG)还原成N 6-甲基-腺嘌呤(Me-dA)和N2-甲基-鸟嘌呤(Me-dG)进行检测，加入20 μ L混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶I和 30U碱性磷酸酶在37°C中继续孵育2h，水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至 干，复溶于100 yL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液； c、 标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度Me-dA和Me-dG标准工作溶液； d、 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注 入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的 比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。2. 根据权利要求1所述的甲醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤a中的甲醛溶 液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM。3. 根据权利要求1所述的甲醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤b中所述的混 合内标为 10 ng/mL的[15N5]Me-dA和 10 ng/mL的[13Ci〇15N5]Me-dG。4. 根据权利要求1所述的甲醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤d中选取 Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色谱柱，规格4.6X150 mm，3 μπι，流动相体系 选取甲醇A和纯水B，等度洗脱，分析时间为8 min，进样量为5 yL。5. 根据权利要求4所述的甲醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：等度洗脱条件为： 0-8 min:50% A，流速为0.5 mL/min。6. 根据权利要求1所述的甲醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤d中串联质谱 检测器的条件：电喷雾离子源ESI，多反应监测正离子扫描方式;喷雾电压:5500 V，离子源 温度：550°C，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射 入电压：10 V，碰撞能:9 eV，驻留时间：200 ms;监测离子对为Me-dA: 266.1 - 150.2定量离 子对，266 · 1 - 117 · 2定性离子对；内标[15N5]Me-dA为271 · 2-155 · 2 ;Me-dG: 282 · 2-166 · 2 定量离子对，282.2-117.1 定性离子对；内标[13Cio15N5 ]Me-dG为297.2- 176.2。
【文档编号】G01N30/02GK105911164SQ201610226542
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】陈欢, 侯宏卫, 胡清源, 刘鲁娟, 张小涛, 朱贝贝, 王红娟
【申请人】国家烟草质量监督检验中心