2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：样品收集；样品预处理；纳米磁珠活化；唾液样品上样；纳米磁珠洗脱；数据采集；数据分析；建立诊断模型。本发明采用液态芯片联合MALDI技术检测2型糖尿病脾虚证患者的唾液蛋白质指纹图谱，从唾液蛋白质中筛选出64个有极显著的统计学意义的差异蛋白峰，选择质荷比为2082.92、2843.79两个差异蛋白质峰进行建模，识别率为97.5％，预测能力86.7％。本发明构建的模型能够正确地区分2型糖尿病脾虚证患者及不同的中医证型的患者，为临床疾病诊断及中医辩证客观化开辟了新途径，开拓了中医微观辩证学的研究新思路。
【专利说明】
2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋 白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 2型糖尿病（Type 2diabetes mellitus，T2DM)是临床常见的老年代谢紊乱性疾 病，生化检查主要表现为患者空腹血糖及(或者)餐后血糖的升高，症状典型者可以同时伴 有口干多饮、多食易饥、尿量增多以及体重减轻等表现，在病程后期，患者多出现心、脑、肾 等组织器官的血管粥样硬化性病变，导致血管管腔狭窄，从而引起一系列心、脑、肾等组织 器官供血不足、代谢障碍甚至衰竭的临床表现。病情危重者，则由于碳水化合物、脂肪、蛋白 质等物质代谢严重失常，或者胰岛素使用不当，血糖在短时间内急剧飙升，引起患者出现病 情危重的状态，例如糖尿病酮症酸中毒昏迷(DKA)、高血糖高渗性昏迷，倘若抢救不及时，患 者多有生命危险。此外，2型糖尿病的致残率极高，有的老年性患者因为血糖反复或持续性 升高，出现了白内障、青光眼、失明、尿毒症，甚至肢体坏疽、截肢等严重不良后果，严重影响 患者生活质量，增加社会经济负担。目前，随着人们现在生活水平的提高、平均寿命年龄的 延长、人口的老龄化以及人们饮食习惯的西方化，我国的2型糖尿病患者人口总数已经高居 于世界首位，而且处于快速增长的阶段，与此同时，我国2型糖尿病患者的患病年龄日趋于 年轻化，形势非常严峻。
[0003] 机体胰岛素分泌相对不足(胰岛素缺乏)和(或)胰岛素的生物效应降低(胰岛素抵 抗)是2型糖尿病患者血糖持续性居高不下的重要原因，是2型糖尿病发病的主要机制。为了 更好的防治2型糖尿病，减少或者阻止2型糖尿病的并发症出现，目前已经对其发病机制进 行更深层次的研究。例如患者胰岛素分泌或功能减退，除了与体型肥胖、运动过少等环境因 素有关外，也跟基因等遗传因素有关，其中基因核转录因子7类似物2(tran SCripti〇n factor 7-like 2，TCF7L2)是引起2型糖尿病最重要的一个遗传基因，它除了可以通过直接 影响0细胞的生长、分化以及功能来干扰胰岛素的分泌，也可以通过间接的引起胰岛功能的 缺陷，从而引起血糖的异常。随着科学的进步，人们对2型糖尿病的研究逐渐由基因转向基 因表达的蛋白质研究，例如有人发现2型糖尿病患者跟正常人比较，存在唾液激素原转化酶 (Prohormone convertase，PC)含量明显偏低的现象，这种酶是一种内切蛋白酶，能够对神 经内分泌激素的前身进行加工，而且能够作用于胰岛辟田胞，使其分泌的胰岛素原去除部分 肽段形成胰岛素，其含量的降低则可以导致胰岛素的形成不足，从而引起血糖升高。
[0004] 中医将2型糖尿病归属于"消渴病"范畴，对其有深刻的认识及理解，并创立各具特 色的流派及治疗学说，如肾虚论、脾虚论、阴虚燥热论，及从脾论治，从肝论治等。中医药理 论治疗2型糖尿病，确实可以提高机体对胰岛素的敏感性，缩减西药的毒副作用及使用剂 量，延缓甚至能够有效地防止糖尿病并发症的发生与发展。但是，实际生活中，中医药诊断 治疗2型糖尿病并不能够得到很好的重视及广泛运用，其主要的原因就是2型糖尿病的辨证 分型方法太过于繁多，缺少可靠的客观性的量化性指标，从而在相当大的程度上影响中医 药治疗2型糖尿病的可行性以及具体操作性。因此，要提升2型糖尿病的中医药理论发展，必 要先着手2型糖尿病的中医辨证论治理论的现代研究发展。随着现代医学技术的快速发展， 运用中西医结合诊治手段研究中医药理论成为一种必然趋势，本课题研究从宏观辨证与微 观辨证相结合的思想理念出发，运用唾液蛋白质组学技术探讨2型糖尿病不同证候的微观 物质变化，尝试开展2型糖尿病的"病"与"证"相结合的研究，为2型糖尿病临床辨证分型的 规范化、客观化提供分子物质基础依据，以期将来能够促进中医药对2型糖尿病的诊断与治 疗。
[0005] 随着人类基因组计划(human genomic project，HGP)的完成，人们逐渐将研究革巴 向转变对蛋白质组(pro teome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提 出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强 调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图 的同时，分别发表了 Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所 未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学 (proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模 式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作 用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层 次上对蛋白质进行动态研究。
[0006] 蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相 互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者 存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白 质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部 基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达 蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测 与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。
[0007] 近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一 种临床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且 具有无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更 安全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在； 与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本量 小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具有极高 的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。
[0008] 唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细 胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆 浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化 过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与疾病的 关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在临床疾病 的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能够作为艾 滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志，而且也可以 应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为目前西方国家 研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。
[0009]唾液具有消化食物、润滑、防御保护、缓冲、机械清洗、抗菌以及内分泌等生物作 用，而蛋白质和多肽是唾液成分中最主要的具有生物学功能的物质，目前已发现唾液蛋白 质和多肽有2300多种，主要有a-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳铁蛋白、 黏蛋白等蛋白质，其中有98%的唾液蛋白质是富酷蛋白及转铁蛋白。然而，通过对已发现的 唾液蛋白质的功能进行分类，发现功能未知的蛋白质占有28.7% (比例最大），与免疫功能 相关的蛋白质占21%，与蛋白质复制及修复相关的蛋白质占1.6%，与细胞动力及分泌相关 的蛋白质占4.8%，与转录和核糖体相关的蛋白质占2.3%，与细胞繁殖及细胞循环相关的 占4.2%，而与信号传导、代谢、细胞骨架及内膜相关的蛋白质分别占9.7%、5.2%、7.1 % 等。可见，生物功能尚处于未知状态的唾液蛋白质仍占有相当大的比例，需要进一步研究挖 掘，且意义重大。新近研究证实，大通量、大精度的蛋白组学技术的应用，使唾液蛋白质生物 标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等均成为可能。
[0010]因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的2型糖尿 病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术 难题。
【发明内容】
[0011] 有鉴于此，本发明要解决现有2型糖尿病脾虚证检测技术方法复杂，灵敏度低，特 异性差，检测时间长，标本用量大的问题，提供了一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱 分子诊断模型建立方法。
[0012] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱 分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：
[0013] (1)样品收集；
[0014] (2)样品预处理:收集的唾液样品在2h内置于转速3000r/min的4°C低温离心机离 心lOmin，并按照50iU/管分装于冻存管(EP管），置于-80°C冰箱冷冻保存备用；
[0015] ⑶纳米磁珠活化；
[0016] (4)唾液样品上样:④取5yl唾液样品，加10yl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入 185yl的Wash Buff er稀释（唾液最终上样量为2.5yl);⑤向含有活化磁珠的PCR管中加入 lOOiil处理好的唾液样品（注意避免产生气泡），室温孵育30min，置于磁铁上孵育lmin，去除 上清液;⑥再往PCR管中加入100y 1的Wash Buffer，洗脱5min，并置于磁铁上孵育lmin，去除 上清液;⑦重复步骤⑥一次，重复步骤⑥是为了去除杂质，洗脱更干净，获得较纯的目的蛋 白；
[0017] (5)纳米磁珠洗脱:每个PCR管中加入10yl的Elution Buffer，洗脱5min(不能少于 5min)，放置于磁铁上孵育lmin，取5yl上清液移至另一个PCR管中，并加入5yl的CHCA饱和溶 液充分混匀，吸取2iU混合溶液加样到Au/Steel芯片上，风干，然后上机读取芯片，收集数 据；
[0018] (6)数据采集；
[0019] (7)数据分析；
[0020] (8)建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算 出多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
[0021]进一步的，步骤（1)所述样品收集方法为:2型糖尿病脾虚证组和正常对照组在取 材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天清晨起床漱口后 空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴预冷的50ml具塞 离心管内，每个临床病例共采集唾液样品2-3毫升，将每个装有唾液样本的所述离心管置于 冰盒里，4°C保存。
[0022] 进一步的，步骤(3)所述纳米磁珠活化方法为:①取WCX纳米磁珠50iil加入到200iil 的PCR管中，置于磁铁上孵育lmin(注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块），去除上清 液;②再加入l〇〇yl的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上孵育lmin，去除上清液;③重复步骤 ②一次，重复是为了洗脱更干净，去除杂质，最好洗脱2次，这样质谱检测受到干扰的可能性 会更少。
[0023]进一步的，步骤(6)所述数据采集方法为:采用质谱仪读取芯片信息，设置激光强 度为190,灵敏度为5,收集数据的质荷比范围为2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平 均每点收集20次，收集总点为100次，用Ciphergen Proteinchip Software3? 2? 1软件自动 采集数据，纵坐标为峰强度(蛋白质相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z);数据采集前， 用已知A11-in-one多肽标准芯片校正仪器，激光离子流为0.5。
[0024] 进一步的，步骤（7)所述数据分析方法为：所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做总离子强度及分子量校正，使其达到均一;对位于2000~25000m/z峰值， 用Biomarker Wizard软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10 %为 最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较2型糖尿病脾虚证组和正常对照 组唾液蛋白质质谱数据（由Biomarker Wizard软件完成），找出2组之间表达差异有统计学 意义的蛋白质峰，P<〇.05为差异有统计学意义。
[0025] 进一步的，步骤(7)中，用Biomarker Wizard软件分析，在质谱峰(m/z)为2000~ 25000范围内总共检测到331个差异蛋白峰，其中有64个在2型糖尿病脾虚证组和正常对照 组的差异有极显著意义(P<〇.001，如下表所示），所述64个差异表达蛋白质峰具体如下：
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[0030]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0031] 1)本发明采用液态芯片联合MALDI技术检测2型糖尿病脾虚证患者的唾液蛋白质 指纹图谱，从唾液蛋白质中筛选出有意义的特异性生物标记物，并建立了相关病证结合的 诊断模型。
[0032] 2)本发明筛选出331个具有统计学意义(P<0.05)的差异蛋白峰，其中64个在2型 糖尿病脾虚证组和正常对照组的差异有极显著意义（P<〇. 001)，选择质荷比（m/z)为 2082.92、2843.79两个差异蛋白质峰进行建模，识别率为97.5 %，预测能力86.7 %。临床回 代检验结果表明，该诊断模型的灵敏度为85.0%，特异度为82.2%。说明该模型对2型糖尿 病脾虚证的诊断效率优良，灵敏度高、特异性强。
[0033] 3)本发明构建的模型能够正确地区分2型糖尿病脾虚证患者及不同的中医证型的 患者，具有重要的临床诊断意义，为临床疾病诊断及中医辩证客观化开辟了新途径，并为中 医微观辩证学的研究开拓了新思路。
[0034] 4)本发明的技术方案已显示出良好的应用前景，值得进一步深入研究并在临床推 广转化。
[0035] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0036] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0037] 图1为本发明实施例中2型糖尿病脾虚证组与正常对照组代表性蛋白指纹图谱；
[0038] 图2为本发明实施例中2型糖尿病脾虚证组与正常对照组诊断模型。
【具体实施方式】
[0039] 以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0040] 实施例
[00411 1研究对象的筛选及诊断标准
[0042] 1.1病例收集时间
[0043] 2014 年 10 月--2015年2 月。
[0044] 1.2诊断标准
[0045] 1.2.1 2型糖尿病的西医诊断标准
[0046] 参照目前世界卫生组织(WHO)以及美国糖尿病协会(ADA)在2014年公布的《糖尿病 诊疗指南》，其中关于2型糖尿病的诊断标准具体如下：
[0047]患者出现典型"三多一少"症状：
[0048] 1)糖化血红蛋白（HbAlC) 2 6.5%;
[0049] 2)空腹血糖浓度(FPG) 2 7.0mmol/L;
[0050] 3)随机血糖浓度(GLU) 2 ll.lmmol/L;
[0051] 4) 口服葡萄糖耐量试验(0GTT)2小时的血糖浓度2 11. lmmol/L，即服用75克无水 葡萄糖溶于水来作为糖负荷，且严格按照世界卫生组织(WHO)的要求标准来进行该试验。
[0052] 患者没有明确典型的高血糖症状：
[0053] 5)应当重复检测确认结果，即除了上述诊断标准外尚须另一次口服葡萄糖耐量试 验（0GTT)2小时血糖浓度211.1mmol/L，或者另一次检测发现空腹血糖（FPG)浓度2 7.0mmol/L〇
[0054] 2型糖尿病典型的"三多一少"症状是指口渴多饮、多食易饥、排尿增加和体重减 轻。
[0055]空腹的准确定义即是指患者禁止摄入热量至少达8小时以上。
[0056] 1.2.2 2型糖尿病的中医辨证分型标准
[0057] 在确定西医临床诊断为2型糖尿病的基础上，参照全国中西医结合虚症研究专业 委员会制定的《中医虚症辨证参考标准》及中华人民共和国卫生部2002年制定颁发的《中药 新药临床研究指导原则》关于2型糖尿病的诊断建议，将所收集到的2型糖尿病患者资料分 为脾虚证、肾虚证及其他证：
[0058] 脾虚证的诊断标准为：
[0059] 1)脾气虚证:饮食减少、纳谷不馨、食后脘腹胀满、有时自觉腹部隐隐作痛、喜按、 少气体倦、神疲、懒言、面色萎黄、大便泄泻溏薄、甚至或者肛门坠胀、体型消瘦、乏力自汗、 舌体胖大或边有齿痕、脉象虚弱无力或软濡；
[0060] 2)脾阳虚证:脘腹自觉冷痛绵绵难忍、喜温喜按、口淡不欲饮水、口中常常泛吐清 水、饮食减少、食后脘腹胀满、形寒肢冷、肢体浮肿、大便清稀甚至出现完谷不化、小便短少、 舌质淡胖多伴边有齿痕、舌苔白滑、脉象沉迟微弱。
[0061 ] 1.2.3正常对照组的诊断标准
[0062]正常对照组的筛选标准是空腹血浆葡萄糖浓度水平可以波动在4.4mmo 1/L (80mg/ dl)至6. lmmol/L( 1 lOmg/dl)之间，餐后两小时血衆葡萄糖浓度水平在4.4mmol/L(80mg/dl) 至8.0mmol/L(144mg/dl)之间，并且没有发现严重疾病。
[0063] 1.3病例的纳入标准
[0064] 1)符合2型糖尿病诊断标准，而且患者的年龄、性别、临床表现、有无严重并发症及 舌苔、脉象等基本资料都应该收集齐全。
[0065] 2)正常对照组人群经过广东省深圳市第二人民医院体检科生化检查排除2型糖尿 病，各项理化指标正常，无其他严重疾病的患者。
[0066] 1.4病例的排除标准
[0067]在唾液标本收集前的一天，本课题研究人员对2型糖尿病患者进行筛查排除，凡是 出现以下任意一项及以上标准的患者，均不予病例的入选，应当予以排除：
[0068] 1)年龄在30岁以下或者70岁以上的2型糖尿病患者；
[0069] 2)性别、年龄、临床表现、舌苔、脉象等资料不齐全的患者；
[0070] 3)不愿意提供唾液标本或者唾液标本收集量不足的患者；
[0071] 4)确诊为2型糖尿病，但正处于妊娠期或者哺乳期的妇女患者；
[0072] 5)确诊为1型糖尿病、其他特殊类型糖尿病的患者；
[0073] 6)确诊为2型糖尿病，但是并发糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷的患者；
[0074] 7)严重的精神分裂患者；
[0075] 8)患有口腔局部及唾液腺的炎症、肿瘤性疾病的患者。
[0076] 1.5病例的剔除标准
[0077]在唾液标本收集完成后，本次课题研究人员对当天所收的2型糖尿病患者基本资 料进行筛查剔除，凡是出现以下任意一项及以上标准的2型糖尿病患者，均应当予以剔除： [0078] 1)病例筛选过程中因粗忽而纳入者；
[0079] 2)病历资料符合以上排除标准者；
[0080] 3)对临床表现及舌脉的中医辨证分型不明确者；
[0081] 4)没有严格遵守唾液取样标准操作的患者；
[0082] 5)在唾液标本转移过程中出现不小心被污染者；
[0083] 6)唾液样本收取的量明显不足者。
[0084] 2纳入病例基本资料
[0085] 本次研究所收集的唾液样本全部来自广东省深圳市第二人民医院住院部内分泌 科临床明确诊断为2型糖尿病患者，总计共70例，年龄阶段在30-70岁，男女性别不限;45例 正常对照组的健康人为本院体检科体检，并且无糖尿病、高脂血症、原发性高血压、冠状动 脉硬化性心脏病、肥胖症等疾病的志愿者。
[0086] 3研究分组
[0087] 2型糖尿病组脾虚证组40例，正常对照组45例。
[0088] 4实验方法
[0089] 4.1主要仪器和试剂
[0090] 弱阳离子交换型（WCX)纳米磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂解液及 MALDI-TIF-MS(蛋白指纹图谱仪I型），均为湖州赛尔迪生物医药科技有限公司产品;PBSII-c型蛋白质芯片阅读仪，为美国Ciphergen公司产品；高速台式低温离心机(Eppendorf公 司）；-80 °C 冰箱(Harris公司）；dH20(HPLC级）、CHCA为Sigma公司产品。
[0091] 4.2样品收集
[0092]取材前一天晚上嘱患者临睡前清水漱口三次(漱口以后不再进任何食物和药物）， 第二天清晨起床漱口后空腹取材，取材时间为清晨六点至八点。患者在前5min内的唾液自 然吞下，然后将无菌的唾液管棉球含入口中，唾液积聚至一定量后，将棉球吐回50ml经过预 先冰浴预冷的具塞离心管内，每个临床病例共采集唾液样品2_3ml，并将每个装有唾液样本 的离心管置于冰盒里，低温保存。
[0093] 4.3样品处理
[0094] 收集的唾液全部在2h内置于转速3000r/min的4°C低温离心机离心10min，并按照 50yl/管分装于冻存管(EP管），置于-80°C冰箱冷冻保存备用。实验时取出标本，常温解冻。 [0095] 4.4纳米磁珠活化
[0096] ①取WCX Magnetic Beads纳米磁珠50yl加入到200yl的PCR管中，在磁铁上孵育 lmin(注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块），去除上清液；②再加入lOOyl的Wash Buffer洗脱5min，置于磁铁上孵育lmin，去除上清液；③再往PCR管中加入100yl的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上孵育lmin，去除上清液，即重复步骤②一次。重复是为了洗脱更 干净，去除杂质，最好洗脱2次，这样质谱检测受到干扰的可能性会更少。
[0097] 4.5唾液样品洗脱上样
[0098] ①每个唾液样品取5yl，加10yl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185yl的Wash Buffer稀释（唾液最终上样量为2.5yl);②向含有活化磁珠的PCR管中加入100yl处理好的 唾液样品（注意避免产生气泡），室温孵育30min，置于磁铁上孵育lmin，去除上清液;③再往 PCR管中加入100yl的Wash Buffer，洗脱5min，并置于磁铁上孵育lmin，去除上清液;④重复 步骤③一次，以去除杂质，洗脱更干净，获得较纯的目的蛋白。
[0099] 4.6纳米磁珠洗脱
[0100] 每个PCR管中加入10yl的Elution Buffer，洗脱5min(不能少于5min)，放置于磁铁 上孵育lmin，取5yl上清液移至另一个PCR管中，并加入5yl的CHCA饱和溶液充分混匀，吸取2 y 1混合溶液加样到Au/Steel芯片上，风干，然后上机读取芯片，收集数据。
[0101] 4.7数据收集
[0102] 采用质谱仪读取芯片信息，设置激光强度为190,灵敏度为5,收集数据的质荷比范 围为2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次。用 Ciphergen Proteinchip Software3.2.1软件自动采集数据，纵坐标为峰强度(蛋白质相对 含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。每次试验数据采集前，均用已知All-in-one多肽标准 芯片校正仪器，激光离子流为〇. 5。
[0103] 4.8生物信息学分析
[0104] 所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做总离子强度及分子量校正，使 其达到均一;对位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard软件过滤噪音。设置初始的 噪音过滤值为5,二次信噪比为2,以10%为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t 检验比较2型糖尿病脾虚证组和正常对照组唾液蛋白质质谱数据（由Biomarker Wizard软 件完成），找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰。P<0.05为差异有统计学意义。 [0105] 4.9建立诊断模型
[0106] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋 白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型，即诊断模型。用SPSS软件进 行各组基线值比较，年龄比较用单因素方差分析，所有数据用±s表达，性别构成比较用X 2 检验。
[0107] 5 结果
[0108] 5.1年龄、性别分布情况
[0109] 40例2型糖尿病脾虚证患者中男性患者有27例，女性患者有13例;45例正常对照组 的健康人有男性27例，女性18例。（表1)
[0110] 表1 2型糖尿病组与正常对照组分布
[0112] 表1显示:经统计学分析，各组性别与年龄分布均无显著性差异(P>0.05)。
[0113] 5.2 2型糖尿病脾虚证组与正常对照组比较结果
[0114] 将85份唾液标本的原始蛋白指纹图谱标准化后（其中2型糖尿病脾虚证患者40例， 正常对照组45例），用Biomarker Wizard软件分析，在质谱峰(m/z)为2000~25000范围内总 共检测到331个差异蛋白峰，其中有64个在2型糖尿病脾虚证组和正常对照组的差异有极显 著意义(P<〇. 001，见表2)。
[0115] 表2正常对照组与2型糖尿病脾虚证组的差异峰结果
[0119]图1为2型糖尿病脾虚证组与正常对照组蛋白质代表性图谱，图中纵坐标为峰强度 (蛋白相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。
[0120] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋 白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型（图2)，建立由m/z为2082.92、 2843.79两个差异蛋白峰联合组成的诊断决策树模型，该模型的敏感性为97.5% (39/40)， 特异性为86.7 % (39/45)(见表3)。
[0121] 如图2所示，当满足条件以下条件之一者：①m/z 2843.79>2.18且m/z 2082.92〉 2.11且m/z 2082.92 <4.68,②m/z 2082.92 <2.11提示为2型糖尿病脾虚证组；当满足条件 以下条件之一者：@111/2 2082.92>2.11且111/2 2843.79 <2.18，(1)111/2 2843.79>2.18且111/2 2082.92>4.68提示为正常组。M:质谱峰相对强度。
[0122]表3所建诊断模型的诊断效率(临床回代检验结果）
[0124] 为了验证由2082.92、2843.79这两个差异蛋白峰组成的诊断模型，对所建立的诊 断模型采用十字交叉法进行验证，40例2型糖尿病脾虚证患者的唾液样本中有34例划分正 确，敏感性为85.0 % (34/40); 45例正常健康对照组样本，有37例划分正确，特异性为82.2 % (37/45)(见表 4)。
[0125] 表4所建诊断模型的诊断效率(十字交叉验证结果）
[0127] 本发明采用液态芯片联合MALDI技术检测2型糖尿病脾虚证患者的唾液蛋白质指 纹图谱，从唾液蛋白质中筛选出有意义的特异性生物标记物，并建立了相关病证结合的诊 断模型。筛选出331个具有统计学意义(P<0.05)的差异蛋白峰，其中64个在2型糖尿病脾虚 证组和正常对照组的差异有极显著意义(P<0.001 )，选择质荷比(m/z)为2082.92、2843.79 两个差异蛋白质峰进行建模，识别率为97.5%，预测能力86.7%。临床回代检验结果表明， 该诊断模型的灵敏度为85.0%，特异度为82.2%。说明该模型对2型糖尿病脾虚证的诊断效 率优良，灵敏度高、特异性强。本发明构建的模型能够正确地区分2型糖尿病脾虚证患者及 不同的中医证型的患者，具有重要的临床诊断意义，为临床疾病诊断及中医辩证客观化开 辟了新途径，并为中医微观辩证学的研究开拓了新思路。本发明显示出良好的应用前景，值 得进一步深入研究并在临床推广转化。
[0128] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非 用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0129] 还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0130]上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括 W下步骤： (1) 样品收集； (2) 样品预处理：收集的唾液样品在化内置于转速3000r/min的4°C低溫离屯、机离屯、 lOmin，并按照SOiil/管分装于冻存管，置于-80°C冰箱冷冻保存备用； (3) 纳米磁珠活化； (4) 唾液样品上样:④取化1唾液样品，加1化1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18扣 1的Wash Buffer稀释;⑤向含有活化磁珠的PCR管中加入10化1处理好的唾液样品，室溫解 育30min，置于磁铁上解育Imin,去除上清液；⑥再往管中加入10化1的Wash Buffer洗脱 5min，然后将PCR管置于磁铁上解育Imin，去除上清液;⑦重复步骤⑥一次； (5) 纳米磁珠洗脱:每个PCR管中加入IOiil的Elution Buffer,洗脱5min，放置于磁铁上 解育Imin，取扣1上清液移至另一个PCR管中，并加入扣1的CHCA饱和溶液充分混匀，吸取化1 混合溶液加样到Au/Steel忍片上，风干，然后上机读取忍片，收集数据； (6) 数据采集； (7) 数据分析； (8) 建立诊断模型:采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定诊 断模型。2. 如权利要求1所述的2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤（1)所述样品收集方法为:2型糖尿病脾虚证组和正常对照组在取材前一天 晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天清晨起床漱口后空腹取材， 前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴预冷的50ml具塞离屯、管内， 每个临床病例共采集唾液样品2-3毫升，将每个装有唾液样本的所述离屯、管置于冰盒里，4 °C保存。3. 如权利要求2所述的2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(3)所述纳米磁珠活化方法为:①取WCX纳米磁珠50山加入到2(K)山的PCR管， 置于磁铁上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上解育 Imin，去除上清液，③重复步骤②一次。4. 如权利要求3所述的2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(6)所述数据采集方法为:数据采集前，用多肤标准忍片校正仪器，激光离子 流为0.5;采用质谱仪读取忍片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5，收集数据的质荷比范 围为2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次。5. 如权利要求4所述的2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(7)所述数据分析方法为:所有原始数据先做总离子强度及分子量校正，使 其达到均一;对位于2000~25000m/z峰值，过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪 比为2, W10%为最小阔值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较2型糖尿病脾虚 证组和正常对照组唾液蛋白质质谱数据，找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰， P<0.05为差异有统计学意义。6. 如权利要求5所述的2型糖尿病脾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(7)中，在质谱峰为2000~25000m/z范围内总共检测到331个差异蛋白峰，其 中有64个在2型糖尿病脾虚证组和正常对照组的差异P<0.001，有极显著意义，所述64个差 异亲化蛋白席略且化如下，
【文档编号】G01N1/38GK105911287SQ201610209147
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】吴正治, 曹美群, 孙珂焕, 黄飞娟, 杨长青
【申请人】深圳市老年医学研究所, 吴正治