胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，含有试剂R1和试剂R2，其中试剂R1中含有Tris缓冲液，聚乙二醇对异辛基苯基醚，pH为7.0?8.0，试剂R2中含有鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子，Tris缓冲液，牛血清白蛋白；烷基糖苷APG0810，甘露醇，聚乙二醇对异辛基苯基醚，pH值为7.0?8.0。本申请的试剂盒中严格限定了不同粒径的乳胶颗粒所占的比例，提高了检测的灵敏度和特异性；得到适合于此体系的表面活性剂和稳定剂的组合，从而在测定快速灵敏、特异性高的前提下，整个体系稳定性好，操作简便，可适于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。
【专利说明】
胶乳増强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒， 还涉及所述心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备方法。
【背景技术】
[0002] 心型脂肪酸结合蛋白（hFABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白。它具有高度 心脏特异性(也就是主要在心脏组织中表达），但在心脏以外的组织中也有低浓度表达。心 肌缺血性损伤出现后，hFABP可以早在胸痛发作后1-3小时在血液中被发现，6-8小时达到峰 值而且水平在24-30小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由132个氨基酸组成，分子 量为15kDa。
[0003] hFABP在血清中的正常范围根据试验和方法而定。1991年，Tanaka等人报告正常范 围为0.0-2.8即/1^ ;1991年，了811」1等人报告正常范围为0.0-0.6即/1^，而1997年，1〇(^18等 人认为正常范围是0.3-5ng/mL。1995年，Ohkaru等人报告100位健康受试者的男女平均血清 hFABP水平分别为3.60± 1.73和3.73± 1.92ng/mL。在近期Hasegawa等人的报告中，儿童的 基线血清hFABP水平与以前报道的成人基线血清hFABP水平一致(平均值=3.8，范围=1.9_ 5.5ng/mL)。在不同研究中临界浓度不同，从6.2ng/mL到19ng/mL。生理血清hFABP浓度很可 能由损坏的骨骼肌细胞不断释放这种蛋白质引起。
[0004] 用两种hFABP特异性单克隆抗体通过夹心酶联免疫吸附法测定血清hFABP浓度。可 以用全血样本进行一步免疫色谱分析法来快速测量hFABP;获得血清hFABP水平定性数据需 要15分钟。利用面板试验，初步结果显示对AMI检测的灵敏度高（93 %)但是特异性低 (43%)。现有技术中还有免疫比浊测定、免疫传感器法等测定方，这些方法具有操作繁琐、 耗时长、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验。
[0005] 现有技术中，还有一种胶乳增强免疫比浊法，是公认的特异性和灵敏度较高的检 测方法。如公开号为CN 102788880 A的中国发明专利申请，公开了一种心型脂肪酸结合蛋 白检测试剂盒，其组成为试剂R1、试剂R2,其中试剂R1包括:200-220mmol/L Tris缓冲液、5-10mmol/L聚乙二醇、l_5mmol/L叠氮钠、l_5mmol/L乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L牛血清白蛋 白；b、试剂R2:200-220mm 〇l/L Tris缓冲液、结合有心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的乳胶 粒子、l_5mmol/L 吐温 _20、0.5_3mmol/L 叠氮钠、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L 牛血 清白蛋白。试剂R2中的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子中的乳胶颗粒直径50-100nm。但此专利申请中并没有公开其检测灵敏度、特异性等性能，使本领域技术人员无法 预测其检测效果。
【发明内容】
[0006] 为了解决以上现有技术中存在的心型脂肪酸结合蛋白检测中存在的操作繁琐、耗 时长、过度浪费资源、检测灵敏度特异性不理想的问题，本申请提供了一种检测方便易操 作、时间短、灵敏度高、稳定性好、特异性强的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒。
[0007] 血清中的心型脂肪酸结合蛋白与试剂中的胶乳包被的特异性抗体相结合，形成抗 原抗体复合物产生混浊，在一定的抗体浓度范围内，其浊度高低与血清心型脂肪酸结合蛋 白含量成正比。通过测定在700nm波长的吸光度值，根据多点定标曲线即可求出血清中心型 脂肪酸结合蛋白的含量。
[0008] 本申请还提供了所述心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备方法。
[0009] 本发明是通过以下措施实现的：
[0010] 一种胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，含有试剂R1和试剂 R2,其中
[0011]试剂R1中含有以下组分：
[0012] Tris 缓冲液 120mmol/L，
[0013] 聚乙二醇对异辛基苯基醚 20mmol/L，
[0014] pH为 7.0-8.0，
[0015] 试剂R2中含有以下组分：
[0016]鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子4.5g/L， Tris 缓冲液 120mmol/L,. 牛血清白蛋白 3mmol/L ;
[0017] 烷基糖苷 APG0810 1. 5g/L, 甘露醇 0.5g/L， 聚乙二醇对异辛基苯基藤 lOmmol/Lj
[0018] pH 值为 7.0-8.0，
[0019] 所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶颗粒中，直径10-30nm的乳胶颗粒占总体积的10-30%，30-60nm的乳胶颗粒占总体积的40-60%，60-100nm的 乳胶颗粒占总体积的20-30 %，
[0020] 试剂R1与试剂R2体积比为4:1。
[0021]所述的试剂盒，优选所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶 颗粒中，直径10-30nm的乳胶颗粒占总体积的10%，30-60nm的乳胶颗粒占总体积的60%， 60-1 OOnm的乳胶颗粒占总体积的30 %。
[0022] 所述的试剂盒，优选所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中的乳 胶颗粒中，直径l〇_3〇nm的乳胶颗粒占总体积的30%，30-60nm的乳胶颗粒占总体积的40%， 60-1 OOnm的乳胶颗粒占总体积的30 %。
[0023] 所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0024] (1)制备试剂R1:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
[0025] (2)制备试剂R2:将试剂R2中的Tri s缓冲液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘 露醇、聚乙二醇对异辛基苯基醚溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，后向溶液中加入鼠抗 人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子，充分搅拌，混合均匀，定容。
[0026]本发明的有益效果：
[0027] 1、心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP)检测试剂(胶乳增强免疫比浊法）用于体外定量 测定人体血清中心型脂肪酸结合蛋白的含量，本申请的试剂盒中使用的鼠抗人心型脂肪酸 结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中的乳胶颗粒中，严格限定了不同粒径的乳胶颗粒所占的比 例，提高了检测的灵敏度和特异性；
[0028] 2、由于选用乳胶颗粒的粒径相差大，所以整个体系的稳定性是需要着重解决的问 题，所以在表面活性剂和稳定剂的选择上，发明人进行了很多尝试，最终得到适合于此体系 的表面活性剂和稳定剂的组合，从而在测定快速灵敏、特异性高的前提下，整个体系稳定性 好(可稳定12个月），操作简便，可适于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。
【具体实施方式】
[0029] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
[0030] 实施例1:
[0031] -种胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，含有试剂R1和试剂 R2，其中试剂R1中含有以下组分：
[0032] Tris 缓冲液 120mmol/L，
[0033] 聚乙二醇对异辛基苯基醚 20mmol/L，
[0034] pH为 7.0-8.0，
[0035] 试剂R2中含有以下组分：
[0036]鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子4.5g/L，
[0037] Tris 缓冲液 120腿ol/L， 牛血清白蛋白 3mmol/L ； 烷基糖苷 APGQSlfl 1. 5g/L,
[0038] 甘露醇 0.5g/L， 聚乙二醇对异辛基苯基醚 1 Qramo 1./L
[0039] pH 值为 7.0-8.0，
[0040] 所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶颗粒中，直径10-30nm的乳胶颗粒占总体积的10 %，30-60nm的乳胶颗粒占总体积的60 %，60-100nm的乳胶颗 粒占总体积的30 %，
[0041 ] 试剂R1与试剂R2体积比为4:1。
[0042] (1)制备试剂R1:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
[0043] (2)制备试剂R2:将试剂R2中的Tri s缓冲液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘 露醇、聚乙二醇对异辛基苯基醚溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，后向溶液中加入鼠抗 人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子，充分搅拌，混合均匀，定容。
[0044] 实施例2:
[0045] -种胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，含有试剂R1和试剂 R2，其中试剂R1中含有以下组分：
[0046] Tris 缓冲液 120mmol/L，
[0047] 聚乙二醇对异辛基苯基醚 20mmol/L，
[0048] pH为7.0-8.0，
[0049] 试剂R2中含有以下组分：
[0050] 鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子4.5g/L， Tris 缓冲液 l:20mmol/L,. 牛血清白蛋白 3mmol/L ;
[0051] 烷基糖苷 APGO810 1.5g/L， 甘露醇 0.5g/L, 聚乙二醇对异辛基苯基醚
[0052] pH 值为 7.0-8.0，
[0053]所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶颗粒中，直径10-30nm的乳胶颗粒占总体积的30 %，30-60nm的乳胶颗粒占总体积的40 %，60-1 OOnm的乳胶颗 粒占总体积的30 %，
[0054] 试剂R1与试剂R2体积比为4:1。
[0055] (1)制备试剂R1:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
[0056] (2)制备试剂R2:将试剂R2中的Tri s缓冲液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘 露醇、聚乙二醇对异辛基苯基醚溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，后向溶液中加入鼠抗 人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子，充分搅拌，混合均匀，定容。
[0057] 对比例1:
[0058] 同实施例1相比，鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶颗粒中， 100 %为30-60nm的乳胶颗粒，其余同实施例1完全相同。
[0059] 对比例2:
[0060] 同实施例1相比，鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶颗粒中， 100%为60_10011111的乳胶颗粒，其余同实施例1完全相同。
[0061 ] 对比例3:
[0062]同实施例1相比，试剂R2中，将甘露醇替换为烷基糖苷APG0810，其余同实施例1完 全相同。
[0063]性能检测试验
[0064] 1、空白吸光度评价(37°(：、70011111、光径1.0〇11)，见表1〇
[0065]表1空白吸光度
[0067] 2、准确度
[0068] 在检测浓度范围内不同浓度的样品，以市面上公认测试结果最准备的试剂作为参 比试剂的测定值为X，本公司试剂的测定值为Y，均为6次测定结果的平均值，计算a、b，得到 回归方程Y = aX+b，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计 算每个浓度点的偏差，结果如下表2。
[0069]表2准确度的测定
[0071 ]从以上实施例1、2及对比实施例1、2、3的测试结果相对偏差值可以看出，实施例1、 2的相对偏差数值比对比实施例1、2、3的相对偏差数值小，测试结果更准确。
[0072] 3、灵敏度
[0073]用已知浓度的样本测试试剂(盒），记录在试剂(盒)规定参数下产生的吸光度改变 即为吸光度差值(AA)，换算为浓度5ng/mL的吸光度差值，结果如下表3:
[0074]表3灵敏度的测定
[0076]从表3内容可以看出，实施例1、2和对比实施例3灵敏度较好，对比实施例1、2灵敏 度较差，说明乳胶颗粒的粒径分布，对灵敏度影响较大，而实施例1、2和对比实施例3中选择 的乳胶颗粒的粒径分布，使试剂盒具有更高的灵敏度。
[0077] 4、精密度评价
[0078] 重复性CV值的测定:在重复性条件下，用控制物质（朗道质控品，祀值:31.3ng/mL) 测试试剂(盒），重复测试10次，分别计算测量值的平均值(X)和标准差(S)，结果如下表4。
[0079] 表4重复性CV值的测定
[0081]上述结果表明，本发明试剂的重复性均符合规定的要求(变异系数CVS5.0%)。 [0082] 5、线性评价
[0083]用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成6 个稀释浓度（Xl)。分别测试试剂（盒），每个稀释浓度测试3次，分别求出检测结果的均值 (yi)。以稀释浓度( Xl)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线 性回归的相关系数(r)，结果如下表5、6、7。
[0084]表5实施例1试剂盒线性试验
[0086]表6对比实施例1试剂盒线性试验
[0088]表7对比实施例2试剂盒线性试验
[0090] 以上结果表明实施例1、对比实施例1、2试剂在线性范围内均相关性良好。
[0091] 6、常规储存稳定性研究
[0092] 6.1实验基本情况
[0093] 6.1.1实验起止时间：
[0094] 2014 年 5 月到2015年6 月。
[0095] 6.1.2实验批号：
[0096] 对实施例1、对比实施例1、2、3的试剂盒进行实验。
[0097] 6.1.3产品储存条件：
[0098] 2~8 °C避光冷藏储存。
[0099] 6.1.4实验过程
[0100] 2014年5月到2015年6月，经过13个月的严格检验，并如实记录时间数据，见下表8、 9、10、11〇
[0101] 6.2实验结果汇总
[0102]表8实施例1的实验结果：
[0105]表9对比实施例1的实验结果：
[0107]表10对比实施例2的实验结果：
[0109]表11对比实施例3的实验结果：
[0112] 从试验结果来看，实施例1试剂的外观、试剂空白吸光度、分析灵敏度、准确度均是 最好的，对比实施例1、2随着时间延长，试剂空白吸光度上升明显、分析灵敏度、准确度下降 明显，对比实施例3试剂初始空白吸光度、分析灵敏度、准确度好，但随着时间的延长，由于 稳定剂的原因，空白吸光度升高，分析灵敏度、准确度下降。所以本申请技术方案中粒径范 围同稳定剂的组合，是相辅相成、缺一不可的。
[0113] 7、抗干扰性
[0114] 取健康人的血清样本，每份标本单独做一种干扰物质(血红蛋白、总胆红素、甘油 三酯、胆固醇、维生素C、脂浊）的试验，将每份标本再分作十份，分别添加不同浓度(如下表 所示)的干扰成份，然后使用实施例1、对比实施例1、2、3的试剂(盒)在规定参数下对含有不 同浓度梯度的常见干扰物质的标本进行测定，测定结果与未加干扰物质的标本比较，干扰 率<±5%则可判断被评价干扰物对被评价方法无干扰。反之则认为被评价干扰物对被评 价方法有明显干扰作用。结果应符合本产品技术要求和说明书的要求。
[0117]
[0118] 干扰率（％)判断计算公式如下：
[0119] 干扰值=干扰样品测定值-基础样品测定值
[0120] 干扰率（％ )=干扰样品测定值/基础样品测定值X 100
[0121] 由图表可得出，心型脂肪酸结合蛋白检测试剂在总胆红素>342mi〇1/L、血红蛋白 >5g/L、维生素C>0.3g/L、甘油三酯>11.3mmol/L、类风湿因子>500IU/mL、脂浊>300、胆 固醇> 9ng/mL时，干扰率超过5 %，因此心型脂肪酸结合蛋白检测试剂抗干扰能力可达到： 总胆红素<342_〇1八、血红蛋白<5g/L、维生素C<0.3g/L、甘油三酯<11.3mmol/L、类风 湿因子彡500IU/mL、脂浊彡300、胆固醇彡9ng/mL。
[0122] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于含有试剂 Rl和试剂R2,其中 试剂Rl中含有以下组分： Tris 缓冲液 120mmol/L， 聚乙二醇对异辛基苯基醚 20mmol/L， pH为 7.0-8.0， 试剂R2中含有以下组分： 鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子4.5g/L， Tris 缓冲液 120mmol/L， 牛血清白蛋白 3mmol/L ; 烷基糖苷 APG0810 1.5g/L， 甘露醇 〇.5g/L， 聚乙二醇对异辛基苯基醚 10mmol/L， pH 值为 7.0-8.0， 所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子中乳胶颗粒中，直径10_30nm的 乳胶颗粒占总体积的10-30%，30-60nm的乳胶颗粒占总体积的40-60%，60-100nm的乳胶颗粒 占总体积的20 -30%， 试剂Rl与试剂R2体积比为4:1。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆 抗体乳胶粒子中的乳胶颗粒中，直径10_30nm的乳胶颗粒占总体积的10%，30-60nm的乳胶颗 粒占总体积的60%，60-1 OOnm的乳胶颗粒占总体积的30%。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述鼠抗人心型脂肪酸结合蛋白单克 隆抗体乳胶粒子中的乳胶颗粒中，直径10_30nm的乳胶颗粒占总体积的30%，30-60nm的乳胶 颗粒占总体积的40%，60-1 OOnm的乳胶颗粒占总体积的30%。4. 一种权利要求1-3中任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 制备试剂Rl:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容； (2) 制备试剂R2:将试剂R2中的Tris缓冲液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘露 醇、聚乙二醇对异辛基苯基醚溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，后向溶液中加入鼠抗人 心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体乳胶粒子，充分搅拌，混合均匀，定容。
【文档编号】G01N33/68GK105911297SQ201610531911
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】王保全, 尚凯, 王霞
【申请人】宏葵生物（中国）有限公司