固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法
【专利摘要】本发明提供了一种固相萃取?液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，旨在提供一灵敏度高，检测时间短的固相萃取?液质串联检测必妥片中桔霉素的方法；该方法依次包括下述步骤：1)制备标准溶液；2)取脂必妥片0.5g粉碎，置10ml锥形瓶中，加3ml 1％甲酸?甲醇溶液，50℃，310W超声波提取20min，冷却，过滤，滤液转移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后过滤，以1ml/min流速通过分别以3ml乙醇和3ml水活化的C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，弃去，再用5ml乙醇洗脱收集洗脱液，洗脱液于40℃下氮吹至近干，精密加入1ml乙醇溶解，用0.22μm有机滤膜过滤，即得待测样品，将待测样品上Agilent1295?6550C三重四级杆液相质谱联用仪检测；属于化学检测技术领域。
【专利说明】
固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法
技术领域
[0001] 本发明提供一种桔霉素的检测方法，具体的说是一种固相萃取-液质串联检测必 妥片中桔霉素的方法;属于化学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 桔霉素(citrinin)是1931年首次从青霉菌Penicillium citrinum中分离得到。其 分子式为C13H14O5，分子量为250.25。桔霉素有一定的肾毒性和肝毒性，能致畸、引发肿瘤及 诱发突变。而红曲是中国传统药材，是用特有的红曲霉菌在大米中培养发酵而成。因某些红 曲霉菌株能产生具有抑制胆固醇生物合成的他汀类物质，因而中药红曲被开发为降血脂的 国脂必妥片和保健食品。在1995年法国学者Blanc等首次发现了红曲产品中含有桔霉素后， 国外已将桔霉素作为食品污染的严格控制指标。而在中国，中国药典尚未将桔霉素作为含 红曲中成药的控制指标。
[0003] 对于国脂必妥片一一脂必妥片有文献记载用RP-HPLC法测定其桔霉素含量，而在 食品、保健食品中也有桔霉素的检测方法:薄层层析法、荧光分光光度法、高效液相色谱法 等。
【发明内容】
[0004] 针对上述不足，本发明的目的是提供一种灵敏度高，分析时间短的固相萃取-液质 串联检测必妥片中桔霉素的方法桔霉素的方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：
[0006] -种固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，所述的检测方法包括下述 步骤：1)制备标准溶液;2)取脂必妥片0.5g粉碎，置10ml锥形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶 液，50°C，310W超声波提取20min，冷却，过滤，滤液转移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度， 摇匀后过滤，以lml/min流速通过分别以3ml乙醇和3ml水活化的C18固相萃取小柱，用5ml水 淋洗，弃去，再用5ml乙醇洗脱收集洗脱液，洗脱液于40°C下氮吹至近干，精密加入lml乙醇 溶解，用〇. 22_有机滤膜过滤，即得待测样品，将待测样品上Agi 1 ent 1295-6550C三重四级 杆液相质谱联用仪检测。
[0007] 进一步的，上述的一种固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，所述的制 备标准溶液包括下述步骤：
[0008] 1)标准溶液的制备
[0009] 标准储备液:精密称取标准物质5mg，置5ml容量瓶中，加乙醇溶解并至刻度，使成 浓度为lmg/ml;
[0010] 标准稀释液:精密吸取标准溶液〇.2ml，置50ml的容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，使 成浓度为2μg/mll;
[0011] 标准工作曲线：取标准稀释液液适量加乙醇，分别配制成浓度为0.01、2、5、5、 20ng/ml标准工作液。
[0012]进一步的，上述的固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，所述的液相色 谱与质谱条件色谱柱:Agilent poroshell 120EC-C18,3.0X50mm 2.7micron，1.8iim;流动 相A为0.2%磷酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序如下:0-3min，A、75-5 %，B、25-95 % ; 3-5.5min，A、5%，B、95%;5.5.-5.6min，A、75%，B、25% ;流速0.2ml/min;柱温40°C;进样量 2yl;电喷雾源ESI，正离子方式，选择多反应监测MRM，载气温度：150°C，载气流量：15L/ min，雾化器压力40psi，鞘气温度300°C，鞘气流量：12L/min，毛细管电压3500V，定性定量离 子:母离子m/z = 251.2，子离子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分别为5V和20V。
[0013]本文建立了含红曲国脂必妥片的桔霉素液相色谱-串联质谱测定，本方法在6min 内完成了对该物质的分析测定，在保证定性定量准确的情况下，实现了高灵敏的分析，并在 提取过程中减少了甲苯等有毒试剂的使用，具有高效、环保等特点，可为国脂必妥片中的桔 霉素监测提供技术支撑。
【附图说明】
[0014]图1是2μg/ml桔霉素标准溶液多反应监测图。
[0015] 图2是空白样品的多反应监测图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合【具体实施方式】，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对 本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围所做的有限次的修改，仍在本发明的 权利要求保护范围之内。
[0017] 实施例i [0018] 1 材料
[0019] 1.1仪器
[0020] Agi lent 1295-6550C三重四级杆液相质谱联用仪（美国Agilent )、HLB-SPE柱 (60mg/3ml，上海安谱科学仪器有限公司）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus(2.1X50mm，1.8 Mi;美国Agi 1 ent)、XA20OTU电子天平(德国梅特勒托利多公司）、超声波清洗器。
[0021] 1.2国脂必妥片与试剂
[0022]国脂必妥片4批，均来源于市场销售样品。
[0023] 桔霉素（批号：518-75-2-150403,标准品购于Pribolab，纯度>98%)，乙醇和甲醇 均为色谱纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为经ELGA PURELAB ClassicUVF净化系统过滤 的去离子水。
[0024] 本发明所涉及到的百分浓度，没有特别说明的，液体均为体积浓度，溶质为固体的 指质量浓度。
[0025] 2方法与结果 [0026] 2.1标准溶液的制备
[0027] 2.1.1标准储备液:精密称取标准物质5mg，置5ml容量瓶中，加乙醇溶解并至刻度， 使成浓度为lmg/ml。
[0028] 2.1.2标准稀释液:精密吸取标准溶液0.2ml，置50ml的容量瓶中，加乙醇稀释至刻 度，使成浓度为2μg/ml，检测结果见见图1。
[0029] 2.1.3标准工作曲线：取标准稀释液液适量加乙醇，分别配制成浓度为0.01、2、5、 5、20ng/ml标准工作液。
[0030] 2.2样品前处理
[0031] 2)取脂必妥片0.5g粉碎，置10ml锥形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，50°C，310W 超声波提取20min，冷却，过滤，滤液转移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后过滤，待 测。
[0032] 2.3样品净化
[0033]将上述样品前处理液，以约lml/min流速通过C18固相萃取小柱(使用前分别以3ml 乙醇和3ml水活化），用5ml水淋洗，弃去，再用5ml乙醇洗脱收集洗脱液，洗脱液于40°C下氮 吹至近干，精密加入lml乙醇溶解，用0.22mi有机滤膜过滤，即得待测样品。
[0034] 2.4液相色谱与质谱条件
[0035]色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱（2 ? 1 X 50mm，1 ? 8_);流动相A为0 ? 2% 磷酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序，见表1。流速0.2ml/min;柱温40 °C ;进样量2yl;电 喷雾源(ESI)，正离子方式，选择多反应监测(MRM)，载气温度：150°C，载气流量：15L/min，雾 化器压力40psi，鞘气温度300°C，鞘气流量：12L/min，毛细管电压3500V，定性定量离子:母 离子m/z = 251.2(M+1)，子离子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分别为5V和20V，Frag均为 380V〇
[0036]表1梯度洗脱程序
[0037] Tab 1 Gradient elution program
[0039] 2.5实际样品的测定
[0040]在本试验中，以定量离子峰面积代入标准系列的回归方程计算，结果国脂必妥片4 批，均未检出桔霉素。
[0041 ] 2.4方法的准确度
[0042]在经测定不含有桔霉素的二种基质的空白样品中进行加标回收率试验，加标浓度 为5ng/ml。平行测定6次，得到的平均加标回收率液体制剂范围为95%~50%，参见图2。 [0043]本发明提供的技术方案用水(含0.2 %磷酸)+甲醇=75+25作流动相，流速0.3ml/ min，桔霉素的色谱峰对称，采用串联质谱检测器进行检测，由于串联质谱具有在分离、高分 辨能力和灵敏度高的特性，配合多反应监测模式(MRM)及母离子和两个相应的子离子进行 监测，达到了准确的定性和定量的目的，简化了对流动相选择的步骤，所以本方法选用了上 述流动相及其比例。
[0044]为了解本方法采用C18固相萃取小柱对样品中的桔霉素进行净化后，在测定时对 质谱检测的基质干扰情况，选择一个未检出桔霉素的样品按方法进行萃取作基质液，并加 入标准系列，同时对外标标准系列进行质谱测定，根据保留时间对应的定量离子峰面积与 其浓度进行回归分析，得基质液加标准系列的回归方程为Y = 3298.522531X+4528.423351， r = 0.9994,与外标回归方程 Y = 3329.186799X+4586.551631 (r = 0.9994)进行比较，两者无 实质性差异，表明C18固相萃取小柱对样品基质有明显净化作用。
[0045]本文建立了含红曲国脂必妥片的桔霉素液相色谱-串联质谱测定，本方法在6min 内完成了对该物质的分析测定，在保证定性定量准确的情况下，实现了高灵敏的分析，并在 提取过程中减少了甲苯等有毒试剂的使用，具有高效、环保等特点，可为国脂必妥片中的桔 霉素监测提供技术支撑。
【主权项】
1. 一种固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，其特征在于，所述的检测方法 包括下述步骤：1)制备标准溶液；2)取脂必妥片O . 5g粉碎，置IOml锥形瓶中，加3ml 1 %甲 酸-甲醇溶液，50°C，3IOW超声波提取20min，冷却，过滤，滤液转移至25ml容量瓶中，用水定 容至刻度，摇匀后过滤，以lml/min流速通过分别以3ml乙醇和3ml水活化的C18固相萃取小 柱，用5ml水淋洗，弃去，再用5ml乙醇洗脱收集洗脱液，洗脱液于40°C下氮吹至近干，精密加 入Iml乙醇溶解，用0.22μπι有机滤膜过滤，即得待测样品，将待测样品上Agilentl295-6550C 三重四级杆液相质谱联用仪检测。2. 根据权利要求1所述的固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，其特征在 于，所述的制备标准溶液包括下述步骤： 1)标准溶液的制备 标准储备液:精密称取标准物质5mg，置5ml容量瓶中，加乙醇溶解并至刻度，使成浓度 为lmg/ml; 标准稀释液:精密吸取标准溶液〇. 2ml，置50ml的容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，使成浓 度为 2μg/mll; 标准工作曲线：取标准稀释液液适量加乙醇，分别配制成浓度为0.01、2、5、5、20ng/ml 标准工作液。3. 根据权利要求1所述的固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法，其特征在 于，所述的液相色谱与质谱条件色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18,3.0X50mm 2.7micron，1.8μηι;流动相A为0.2 %磷酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序如下:0-3min， A、75-5%，B、25-95% ;3-5.5min，A、5%，B、95% ;5.5.-5.6min，A、75%，B、25%;流速0.2ml/ min;柱温40°C ;进样量2μ1;电喷雾源ESI，正离子方式，选择多反应监测MRM，载气温度：150 。(：，载气流量：15L/min，雾化器压力40psi，鞘气温度300 °C，鞘气流量：12L/min，毛细管电压 3500V，定性定量离子:母离子m/z = 251.2，子离子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分别为 5V和20V。4. 根据权利要求3所述的固相萃取-液质串联检测必妥片中桔霉素的方法桔，其特征在 于，所述的C18固相萃取小柱使用前分别以3ml乙醇和3ml水活化。
【文档编号】G01N30/02GK105929037SQ201610234683
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】陈学松, 罗达龙, 王 华
【申请人】广西壮族自治区梧州食品药品检验所