一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，包括（1）设定高效液相色谱条件；（2）制备对照品溶液；（3）制备供试品溶液；（4）含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算昆明杯冠藤总皂苷的含量。本发明所述检测方法以流动相作提取溶剂，较之于稀乙醇、甲醇等其他溶剂，提取效率更高更完全；且本发明所述检测方法以甲醇和水的二元高压梯度为流动相，该方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测。
【专利说明】
一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，属于医药化工技术领域。
【背景技术】
[0002] 癌症已成为21世纪威胁人类生存的头号杀手，平均每年有600多万人死于各种癌 症。中国已成为世界癌症高发国之一，每年新增200多万名癌症患者，占全球总数的20%，并 且每年呈快速增长趋势。临床上目前治疗癌症的药物主要是化学药品，但由于化学药物毒 性大，在杀死肿瘤细胞的同时也无选择性的杀死白细胞、淋巴细胞等自身免疫细胞，导致各 种并发症和严重的不良反应，而且疗程长，费用高，在临床使用中有较大的局限性。中药在 治疗癌症方面有独特的优势，以中药为代表的天然药物具有毒副作用小、作用靶点多样、耐 受性好等特点，在治疗肿瘤方面越来越受到重视。
[0003] 昆明杯冠藤([71^11(3111111^^11;[(311；[1118111:.)又名断节参，是萝蘑科鹳绒藤属植物， 产于我国四川、贵州、云南以及广西等地，并分布于印度。民间用其治疗风湿关节炎及跌打 损伤，云南成药"虎力散"用其为主药。
[0004] 留体皂苷类成分为昆明杯冠藤主要的组成成分，本发明的
【发明人】研究发现，昆明 杯冠藤C21留体类化合物单体或有效部位在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、细胞毒 性作用、逆转肿瘤细胞的多药耐药以及增强机体免疫力等方面有着很好的药理作用，为抗 肿瘤中药的开发和应用打下了坚实的基础。然而，目前尚未有有效的检测方法对其进行质 量控制，研究及开发一种适合于常规检测昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法则显得尤为重 要。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种操作简单，具有良好的精密度、重 现性和可靠性，可用于昆明杯冠藤总皂苷的质量控制的昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方 法。
[0006] 本发明的技术方案为： 一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，包括以下步骤： (1) 设定高效液相色谱条件:色谱柱为Agilent TC-C18:4.6 mmX250 mm，5 um，以浓度 为0.1%的乙酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱方式为等度洗脱，流速为 l.OmL.min-I柱温为30°C，检测波长为265nm，进样量5yl; (2) 制备对照品溶液：称取昆明杯冠藤皂苷A对照品，置于容量瓶中，加入流动相，稀释 至刻度，摇匀，制成浓度为O.SOOmg^mr 1的溶液，得到对照品溶液； (3) 制备供试品溶液：称取供试品粉末，置于容量瓶中，加入流动相，超声提取30min， 静置，再用流动相稀释至刻度，摇匀，用〇. 45wii微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； (4) 含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5iU，注入液相色谱仪，进行高效液 相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算昆明杯冠藤总皂苷的含量。
[0007] 进一步，上述的昆明杯冠藤皂苷A的制备方法为：取昆明杯冠藤总皂苷，用浓度为 20%的甲醇溶解后过微孔滤膜，经过反相硅胶柱层析吸附后，用浓度为30%的甲醇洗脱，收集 洗脱液并在65-70°C的温度条件下浓缩结晶，即得昆明杯冠藤皂苷A。
[0008] 且上述的昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，还包括对昆明杯冠藤皂苷A对照品 溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的步骤。
[0009] 而对昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的方法具 体为:取不同浓度的昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪 的操作，并记录色谱图，得到线性回归方程为:A = 4.55X107C-184181，R = 0.9999,且所述 的A为峰面积积分值，而所述的C为a-甘草次酸对照品溶液浓度。
[0010] 当然，还可以包括对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤、对供试品溶液的稳 定性进行检测的步骤、检验昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法的重复性的步骤、进行加样 回收率实验的步骤或进行昆明杯冠藤总皂苷最低检测浓度测定的步骤。
[0011 ]且信噪比为3:1时，所述的昆明杯冠藤总皂苷的最低检测浓度为0.0300yg ? ml/1。 [0012]本发明的有益效果为:本发明所述检测方法以流动相作提取溶剂，较之于稀乙醇、 甲醇等其他溶剂，提取效率更高更完全;且本发明所述检测方法以甲醇和水的二元高压梯 度为流动相，该方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留 时间适中，更加适合于常规检测。
【附图说明】
[0013]图1为昆明杯冠藤皂苷A的结构示意图； 图2为昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液的高效液相色谱图； 图3为昆明杯冠藤总皂苷样品的高效液相色谱图； 图4为某一批次的昆明杯冠藤总皂苷样品的高效液相色谱图； 图5为另一批次的昆明杯冠藤总皂苷样品的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0015]实施例1:制备昆明杯冠藤皂苷A 昆明杯冠藤药材lkg粉碎后，用6倍药材质量的95%乙醇连续回流提取2次，合并提取液 并在65-70 °C浓缩至浸膏状，加入5倍浸膏重量的水于70 °C热溶，经过石油醚萃取两次，合并 水层得到水溶液;水溶液上聚酰胺柱，用10个柱体积的溶剂进行洗脱;聚酰胺洗脱后流出液 上DM130型号大孔吸附树脂柱，用纯化水、20%乙醇和95%乙醇进行洗脱，回收95%乙醇部分， 并于65-70°C减压浓缩至浸膏状后，加入浸膏重量4倍量的乙酸乙酯溶清，溶解液直接上硅 胶柱，依次用乙酸乙酯以及质量比为6:1的乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱，薄层监测后，合并含 昆明杯冠藤皂苷部分的流出液，于70°C浓缩至干，即得昆明杯冠藤总皂苷12.5g;取上述制 备得到的昆明杯冠藤总皂苷5g，用20%甲醇溶解后过微孔滤膜，经过反相硅胶柱层析吸附 后，用30%甲醇洗脱，收集洗脱液并于70°C浓缩结晶，即得昆明杯冠藤皂苷A 1.2g。经检测， 昆明杯冠藤皂苷A的结构如图1所示。
[0016] 实施例2:设定高效液相色谱条件 色谱柱为Agilent TC_C18:4.6 mmX250 mm，5 um，以浓度为0.1%的乙酸水溶液为流动 相A，以甲醇为流动相B，洗脱方式为等度洗脱，流速为l.Oml^mirT1，柱温为30°C，检测波 长为265nm，进样量5iU，理论板数按昆明杯冠藤皂苷A计算应不低于2000。
[0017] 实施例3:制备对照品溶液 称取昆明杯冠藤皂苷A对照品25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入流动相，稀释至 刻度，摇匀，制成浓度为0.500mg ?mr1的溶液，得到对照品溶液(对照品贮备液）。
[0018] 实施例4:制备供试品溶液： 称取供试品粉末30mg，置于50ml容量瓶中，加入流动相30ml，超声提取30min，静置，再 用流动相稀释至刻度，摇匀，用〇. 45mi微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
[0019] 实施例5:对昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归 精密量取对照品贮备液〇. 2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释 至刻度，摇匀，得到含昆明杯冠藤皂苷A分别为0.0100、0.0300、0.0500、0.0700、0.0900 mg ? ml/1的对照品溶液，分别精密吸取上述各对照品溶液5yL，按上述色谱条件进行测定，分 别得到峰面积积分值为249208、1208723、2097562、2997755、3907256，以峰面积积分值(八） 对对照品溶液浓度(C)进行线性回归，得回归方程为A = 4.55 X 107C-184181 (R=0.9999 )。
[0020] 图2为昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液的高效液相色谱图。
[0021] 如图2所示：昆明杯冠藤皂苷A检测浓度在0.0100-0.090 mg ? ml/1范围内与峰面积 积分值呈良好的线性关系。
[0022] 实施例6:对高效液相色谱仪进行精密度检测 精密吸取浓度为0.0500mg ? ml/1的对照品溶液5此，按上述色谱条件连续进样6次，测 定峰面积积分值分别为：2093562、2094287、2090223、2108994、2095145、2108102。结果，1?0 =0.38 %，表明仪器精密度良好。
[0023] 实施例7:对供试品溶液的稳定性进行检测 精密量取同一供试品溶液5yL，分别在0、1、2、3、4、5、24h进样测定，测得峰面积积分值 分别为：3103894、3110434、3099403、3101980、3098113、3089864、3090343,均值为 3099147.3，结果:RSD = 0.24 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。
[0024] 实施例8:检验昆明杯冠藤总皂苷的含量检测方法的重复性 称取同一昆明杯冠藤总皂苷样品粉末约30 mg，平行6份，精密称定，按实施例4所述方 法制备供试品溶液，精密吸取5yL，按上述色谱条件测定。图3为昆明杯冠藤总皂苷样品的高 效液相色谱图。如图3所示：上述平行六份样品，最终测得峰面积积分值分别为：787463、 802338、799935、785958、780341、786885，均值为790486 ? 7;结果，RSD = 1 ? 10%，表明本发明 所述方法重复性较好。
[0025] 实施例9:加样回收率实验 取已知含量的昆明杯冠藤总皂苷样品9份，每份约30 mg，精密称定，加入相应量的对 照品，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。 [0026]表1加样回收率试验结果(n = 9)
[0027]实施例10:昆明杯冠藤总皂苷最低检测浓度测定 将对照品溶液稀释测定，测得信噪比为3:1时，昆明杯冠藤总皂苷的最低检测浓度为 0.0300iig ? mL_1〇
[0028]实施例11:样品含量测定 取4个不同批次的供试品粉末各约30 mg，精密称定，按照实施例4的方法制成供试品溶 液，分别取供试品溶液各如1，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱 图，然后，利用色谱图计算昆明杯冠藤总皂苷的含量。
[0029] 图4为某一批次的昆明杯冠藤总皂苷样品的高效液相色谱图；图5为另一批次的昆 明杯冠藤总皂苷样品的高效液相色谱图。
[0030] 根据图4和图5的高效液相色谱图，得到各批次的昆明杯冠藤总皂苷样品含量测定 结果如表2所示： 表2不同批次的昆明杯冠藤总皂苷样品含量测定结果
[0031] 上述昆明杯冠藤总皂苷含量测定方法实现了对昆明杯冠藤总皂苷的质量检测，经 过试验表明，该方法线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好，且本发明所述方法 准确、简便、快捷，能够更有效、全面的控制昆明杯冠藤总皂苷的质量。
[0032] 以上【具体实施方式】不以任何形式限制本发明，凡是以等同替换或等效变换的方式 所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 设定高效液相色谱条件:色谱柱为Agilent TC-C18:4.6 mmX 250 mm，5 um，以浓度 为0.1%的乙酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱方式为等度洗脱，流速为 l.OmL.min-I柱温为30°C，检测波长为265nm，进样量5μ1; (2) 制备对照品溶液：称取昆明杯冠藤皂苷A对照品，置于容量瓶中，加入流动相，稀释 至刻度，摇匀，制成浓度为OJOOmg^mr 1的溶液，得到对照品溶液； (3) 制备供试品溶液：称取供试品粉末，置于容量瓶中，加入流动相，超声提取30min， 静置，再用流动相稀释至刻度，摇匀，用〇. 45μπι微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； (4) 含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5μ1，注入液相色谱仪，进行高效液 相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算昆明杯冠藤总皂苷的含量。2. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，所述的 昆明杯冠藤皂苷A的制备方法为:取昆明杯冠藤总皂苷，用浓度为20%的甲醇溶解后过微孔 滤膜，经过反相硅胶柱层析吸附后，用浓度为30%的甲醇洗脱，收集洗脱液并在65-70°C的温 度条件下浓缩结晶，即得昆明杯冠藤皂苷A。3. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，还包括 对昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的步骤。4. 根据权利要求3所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，对昆明 杯冠藤皂苷A对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的方法为:取不同浓度的昆明 杯冠藤皂苷A对照品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，得 到线性回归方程为:A = 4.55 X 107C-184181，R = 0.9999，且所述的A为峰面积积分值，而所 述的C为昆明杯冠藤皂苷A对照品溶液浓度。5. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，还包括 对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤。6. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，还包括 对供试品溶液的稳定性进行检测的步骤。7. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，还包括 检验昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法的重复性的步骤。8. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，还包括 进行加样回收率实验的步骤。9. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，还包括 进行昆明杯冠藤总皂苷最低检测浓度测定的步骤。10. 根据权利要求1所述的一种昆明杯冠藤总皂苷含量的检测方法，其特征在于，信噪 比为3:1时，所述的昆明杯冠藤总皂苷的最低检测浓度为0.0300yg · mL一、
【文档编号】G01N30/02GK105929079SQ201610419752
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】季浩, 张宇, 阚建伟, 刘佳, 孔繁博
【申请人】江苏天晟药业股份有限公司