肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法
【专利摘要】肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法，包括如下步骤：先用过氧化氢和冰乙酸的混合液离析液浸泡肿柄菊叶片，将处理过的肿柄菊叶片置于载玻片上撕下下表皮放入染色液中，再先后滴30％过氧化氢和30％冰乙酸的混合液与有效氯含量≥5.5％的安替福民原液于带有叶肉的上表皮上，处理1～2min。用镊子将叶肉除去，制片，在光学电镜下观察。本发明采用过氧化氢—冰醋酸混合液离析液处理和次氯酸钠处理结合，解决了肿柄菊叶片上表皮制作玻片难的问题。
【专利说明】
肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物非切片制片的技术领域，涉及一种肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法。【背景技术】
[0002]肿柄菊是菊科肿柄菊属植物，原产于中美非洲地区，曾做为观赏植物、绿肥和防止土壤侵蚀，被广泛引种至亚洲、非洲、北美、澳洲的许多国家和地区。目前，在东南亚、南非、 太平洋的一些国家和地区，肿柄菊已经成为一种入侵草地、河岸、道路绿化的杂草。在中国， 肿柄菊作为观赏植物曾被引种至广东和云南，现在已经逃逸到其他的亚热带省份。
[0003]对于防治外来入侵植物的一个重要方法是研究和利用入侵的植物。根据目前所研究的报道，肿柄菊可以以其根、茎、叶入药，具有清热解毒、消暑利水、降低血糖之效，还可以用于治疗急慢性肝炎、乙型肝炎、黄疽、膀胱炎、青春痘、痈肿毒疮等降疾病。国外有文献报道，肿柄菊的水提物和80 %的醇提物能通过降低胰岛素抵抗而改善体内葡萄糖的代谢，有实验结果说明肿柄菊可能具有对n型糖尿病具有治疗作用。另外还有报道称肿柄菊叶片的乙烷、乙酸乙酯和甲醇提取物具有抗微生物的活性，如:一定剂量的70%乙醇提取物具有明显的抗症活性;倍半砲内酯类物质(1；[￥6^1；1!'〇1；[11，(1；[￥6181；1!'〇1；[1111161:1171和1:；[1'〇1:1111(1；[11具有抗炎性;tagitinin具有化学防癌作用。
[0004]为了可以更好的利用肿柄菊，需要对其植物学结构特征进行研究，而在其植物学结构特征的研究过程中对于叶片的研究是不可或缺的。
[0005]叶片是植物的重要器官，在对植物的研究中，叶片的研究是很重要的组成部分。植物叶片的结构特征可以用于植物的鉴定和分类，可以评估植物的适应性和抗病性。其中植物叶片表皮的结构是除了受基因的影响之外，还和植物所在的生长环境息息相关。同种植物在不同的生活环境下，其表皮表现出相适应的结构特征，如气孔数量的多少，位置的深浅;表皮毛的多少和长短，会体现出不同的抗旱耐涝性。因此，叶片表皮结构上某些变量的研究，要求叶片表皮在制片的过程中保持叶片的完整性和清晰度。
[0006]在植物叶片的研究中，用于叶片解剖研究的方法从大类上可以分为切片法和非切片法。切片法一般用于观察植物叶片横切面结构，大体上可以分为“石蜡切片法”、“冰冻切片法”、“徒手切片法”等方法，这些方法可以切出完整的叶片切面结构，。而对于叶片表皮的研究，目前可以大致分为“扫描法”、“撕片法”、“离析法”以及“透明法”、“印迹法”以及“水煮法”。“扫描法”可以观察到叶片表皮表面的立体结构，目前多用的“扫描法”有“扫描电镜法”。“撕片法”可以很完整的获取叶片表皮结构，但是适用范围较小，仅适用于一些表皮易撕取的肉质、膜质和纸质的植物叶片，而大部分的植物叶片表皮很难撕取，目前多应用的是 “徒手撕片法”。“离析法”主要是运用具有氧化性或是强酸强碱性的化学药品将叶肉细胞和其他物质溶解掉，使叶片表皮自动脱离，目前常用的“离析法”有“有效氯含量多5.5%的安替福民原液法”、“过氧化氢一醋酸法”、“重铬酸钾一硝酸法”、“盐酸法”、“碳酸钠法”以及 “氢氧化钠法”。其中“有效氯含量彡5.5%的安替福民原液法”、“过氧化氢一醋酸法”、“重铬酸钾一硝酸法”主要是利用其强氧化性，“过氧化氢一醋酸法”多用于离析木材，而在叶片表皮研究过程中多用“有效氯含量彡5.5%的安替福民原液法”和“重铬酸钾一硝酸法”。但是 “有效氯含量多5.5%的安替福民原液法”和“重铬酸钾一硝酸法”均存在的缺陷有:它不仅可以将细胞间隙的物质分解掉，还会分解部分表皮细胞，难以避免叶片表皮结构被破坏，在操作过程中需要谨慎注意离析的时间。有效氯含量多5.5%的安替福民原液法在处理过程中容易将叶片氧化成碎末，难以得到完整表皮，同时有效氯含量多5.5 %的安替福民原液具有漂白性，用有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理时间越久，叶片就越难染上颜色。“盐酸法”、“碳酸钠法”、“氢氧化钠法”主要利用其强酸强碱性。
[0007]而在以上的方法中，由于叶片性质不同，所需要的药品浓度和处理时间都不同。并且在离析过程中叶片上表皮离析的时间和叶片表皮的完整性相互矛盾。处理时间短不能离析出叶片表皮，处理时间过长一些表皮结构被破坏，不能获取完整叶片上表皮或是叶片上表皮难以离析。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法，能够简单方便地获得清晰的肿柄菊叶片上表皮结构，为肿柄菊的分类鉴定和研究利用做出贡献。
[0009]本发明通过以下技术方案实现上述目的:肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法，包括以下步骤:
[0010](1)、将新鲜的肿柄菊叶片切成1?〇.5cmXl?0.5〇11，用?44固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在 80°C烘箱中烘烤7?24小时；目的是将叶肉细胞物质溶解，使叶片下表皮分离。[〇〇11](2)、将离析好的肿柄菊叶片置于装有蒸馏水的培养皿中，用镊子和解剖针将肿柄菊叶片下表皮撕下，
[0012](3)、在蒸馏水中，将除去下表皮的肿柄菊叶片置于干净的载玻片上，使带有叶肉面贴近载玻片；
[0013](4)、向载玻片上的肿柄菊叶片先滴加30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合液0.5? 2ml，再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml处理1?2min;目的是利用酸性条件下过氧化氢与有效氯含量多5.5%的安替福民原液反应产生氧气，进一步将叶肉细胞处理干净。
[0014](5)、将处理之后的载玻片全部浸泡在蒸馏水中，浸泡过程需要摇动蒸馏水1? 2min，再倒掉蒸馏水，重复操作2?3次;确保完全除去有效氯含量多5.5%的安替福民原液、 过氧化氢、醋酸的残留物，防止药品与固绿、番红反应产生黑色物质，影响染色效果；同时也能将反应产生的气泡赶走，防止封片后材料上粘附气泡。[〇〇15](6)、将清洗干净的叶片置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，表皮面朝上；[〇〇16](7)、向载玻片上的叶片滴上100%酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1?2min，再倾斜载玻片，然后缓慢滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；[〇〇17](8)、向已经染好固绿的叶片上滴加番红染色液0.5?2ml，染色8?10分钟，倾斜载玻片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净；[〇〇18](9)、向叶片中滴加50%甘油lml，用盖玻片封片，光学显微镜下观察叶片上表皮结构。
[0019]步骤(1)所述离析液还能够用10 %盐酸替代。
[0020]步骤(1)所述在烘箱中烘烤还能够变换在60 °C烘箱中烘烤36?48小时。[〇〇21]本发明人用30%过氧化氢和30%醋酸法离析罗伞树、铜锤玉带草、九龙、肿柄菊、 胜红蓟时发现，30%过氧化氢和30%醋酸混合液能将大部分植物叶片下表皮自动离析出来，但是对于上表皮只有罗伞树可以自动离析，其他的都需要手动撕片获取。其中，肿柄菊叶片的叶肉较厚，且其上表皮与叶肉细胞黏附牢固，手动也不能撕下其上表皮。因此，在此基础上发现先后滴加30 %过氧化氢和30 %醋酸混合液与有效氯含量多5.5 %的安替福民原液处理肿柄菊叶肉，可以将其叶肉溶解掉，获取完整的肿柄菊叶片上表皮结构。[〇〇22]在本发明中，先用常规离析液将肿柄菊叶片下表皮离析脱离，然后再先后用30% 过氧化氢和30%醋酸混合液与有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理肿柄菊叶片上表皮黏附的叶肉，使肿柄菊叶片上表皮中粘附的叶肉氧化溶解，进而获取肿柄菊叶片上表皮，为肿柄菊叶片表皮结构的研究做出贡献，进而为肿柄菊的分类鉴定做出贡献，还可用于肿柄菊的抗性研究。[〇〇23]本发明的突出优点在于:
[0024]1、在肿柄菊叶片上表皮的制片过程中通过过氧化氢一醋酸和次氯酸钠对叶片上表皮的处理，简单方便地获得清晰的肿柄菊叶片上表皮结构。[〇〇25]2、步骤(3)主要是为了让叶肉尽可能的与所滴加的30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合液和有效氯含量多5.5 %的安替福民原液原液接触，加速叶肉的氧化分解过程。[〇〇26]3、步骤(4)先后滴加30 %过氧化氢和30 %冰乙酸的混合液与有效氯含量彡5.5 %的安替福民原液处理叶片主要是去除黏附于肿柄菊叶片上表皮的叶肉；先加30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合液0.5?2ml，然后再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5? 2ml，除了利用安替福民原液的漂白性使叶片透明之外，主要还是利用在酸性条件下，过氧化氢与次氯酸钠反应产生的氧气，使叶肉细胞氧化速度加快。且由于肿柄菊叶肉组织结构是棉絮状的，所以在过氧化氢与次氯酸钠产生氧气的时候，气泡也同时能将肿柄菊叶肉组织结构从肿柄菊叶片上表皮中带离，便于用镊子清理难以被氧化分解的肿柄菊叶肉组织结构。[〇〇27]4、步骤(5)用蒸馏水清洗有效氯含量多5.5%的安替福民原液是为了防止有效氯含量彡5.5%的安替福民原液与番红、固绿染色液反应，使叶片结构粘上黑色杂质。
[0028]5、步骤(6)主要是为了让叶片上表皮结构朝上，便于清楚观察到表皮结构。【附图说明】[〇〇29]图1是10x10倍光学显微镜观察图片;肿柄菊叶片上表皮结构；
[0030]图2是10x10倍光学显微镜观察图片;肿柄菊下叶片表皮结构；
[0031]图3是10x40倍光学显微镜观察图片;肿柄菊上表皮非腺毛结构；[〇〇32]图4是10x40倍光学显微镜观察图片;肿柄菊上表皮结构；[〇〇33]图5是10x40倍光学显微镜观察图片;肿柄菊叶片上表皮结构；
[0034]图6是10x10倍光学显微镜观察图片;肿柄菊叶片下表皮结构；
[0035]图7是10x40倍光学显微镜观察图片;肿柄菊叶片下表皮结构；
[0036]图8是10x10倍光学显微镜观察图片;肿柄菊叶片上表皮结构；[〇〇37]图9是10x40倍光学显微镜观察图片;肿柄菊叶片上表皮结构。[〇〇38]下面结合附图，对附图做进一步的详细说明。[〇〇39]图1、图2是先将固定24小时以上的叶片置于放有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在80°C烘箱中处理7?24小时，然后再先后滴加30%过氧化氢和30% 冰乙酸混合液与有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理后，所获得的肿柄菊叶片在100倍光学显微镜下观察到的上表皮结构，图中可以清楚观察到肿柄菊叶片表皮上的表皮毛，但是由于放大倍数太小所以表皮细胞看不清。
[0040]图3、图4先将固定24小时以上的叶片置于放有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在80 °C烘箱中处理7?24小时，然后再先后滴加30 %过氧化氢和30 %冰乙酸混合液与有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理后，所获得的肿柄菊叶片在400倍光学显微镜下观察到的上表皮结构。图中可以清楚观察到肿柄菊叶片表皮细胞结构以及叶片表皮上的非腺毛结构。非腺毛结构上的四个细胞形状清晰可见。[0041 ]图5是仅用30%过氧化氢和30%冰乙酸混合液处理，所获得的肿柄菊叶片在100倍光学显微镜下观察到的上表皮结构，图中仅仅是可以观察到叶片表皮上的非腺毛结构，叶肉组织较多，还有很多叶脉的的痕迹，叶片染色不均匀。[〇〇42]图6是仅用30%过氧化氢和30%冰乙酸混合液处理，所获得的肿柄菊叶片在400倍光学显微镜下观察到的上表皮结构，图中可以观察到叶片结构不完整，表皮细胞结构模糊， 叶片整体染色不均匀。[〇〇43]图7是先用30 %过氧化氢和30 %冰乙酸的混合离析液，水浴98?100 °C加热处理5 ?7h，然后再先后滴加30 %过氧化氢和30 %冰乙酸混合液与有效氯含量多5.5 %的安替福民原液处理后，所获得的肿柄菊叶片在400倍光学显微镜下观察到的表皮结构。从图中可以辨认出细胞和气孔，表皮细胞和气孔都保持完整，但是表皮细胞和气孔的结构都不清晰。 [〇〇44]图8是仅用有效氯含量彡5.5%的安替福民原液，水浴98?100°C加热处理5?7h 后，所获得的肿柄菊叶片在100倍光学显微镜下观察到的下表皮结构。图中仅可以观察到肿柄菊叶片下表皮上着附的非腺毛，非腺毛结构不不清晰，不能观察到组成非腺毛的四个细胞结构;从图中还可以观察得到肿柄菊叶片中表皮中的许多结构已经被溶解掉，结构已经不完整。
[0045]图9是仅用有效氯含量彡5.5%的安替福民原液，水浴98?100°C加热处理5?7h， 所获得的肿柄菊叶片在400倍光学显微镜下观察到的下表皮结构。图中可以仅仅可以观察到肿柄菊叶片下表皮上的气孔轮廓和非腺毛着生的基座，细胞的整体结果模糊，下表皮细胞看不清楚。【具体实施方式】
[0046]以下通过实施例对本发明的技术方案作进行进一步的说明。[〇〇47] 实施例1[〇〇48]本发明所述的肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法的一个实例，包括以下步骤:
[0049] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在80°C烘箱中烘烤7?24小时;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中， 展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下;在蒸馏水中，将去除下表皮的叶片置于干净的载玻片上，使带有叶肉面贴近载玻片；向装载玻片上的叶片先滴加30 %过氧化氢和 30%冰乙酸的混合液0.5?2ml，再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml处理1 ?2min;将处理之后的载玻片全部浸泡在蒸馏水中，浸泡过程需要摇动蒸馏水1?2min，再倒掉蒸馏水，重复操作2?3次;将清洗干净的叶片置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，表皮面朝上；向载玻片上的叶片滴上100%酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1 ?2min，再倾斜载玻片，然后缓慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；向已经染好固绿的叶片上再滴加番红染色液0.5?2ml，染色8?12min，再倾斜载玻片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净；向叶片中滴加50 %甘油lml，用盖玻片封片;光学显微镜下观察叶片上表皮结构。由此方法所得到的图片结构清晰，可以清楚的观察到叶片上表皮细胞的形状，表皮上的附属物非腺毛的结构。如图1至图5所示。
[0050]实施例2
[0051]本发明所述的肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法的另一个实例，包括以下步骤: [〇〇52] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在 80°C烘箱中烘烤36?48小时；取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下；在蒸馏水中，将除去下表皮的叶片置于干净的载玻片上，使带有叶肉面贴近载玻片；向装载玻片上的叶片先滴加30%过氧化氢和30 %冰乙酸的混合液0.5?2ml，再滴加有效氯含量彡5.5 %的安替福民原液0.5?2ml处理1?2min;将处理之后的载玻片全部浸泡在蒸馏水中，浸泡过程需要摇动蒸馏水1?2min， 再倒掉蒸馏水，重复操作2?3次;将清洗干净的叶片置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，表皮面朝上；向载玻片上的叶片滴上100%酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1?2min，再倾斜载玻片，然后缓慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；向已经染好固绿的叶片上再滴加番红染色液0.5?2ml，染色8?12min，再倾斜载玻片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净；向叶片中滴加50 %甘油lml，用盖玻片封片;光学显微镜下观察叶片上表皮结构。仅用30 %过氧化氢和30 %冰乙酸的混合离析液处理，即使是延长处理时间也不能直接获取肿柄菊上表皮结构，撕下下表皮后，再用先后滴加30%过氧化氢和30% 冰乙酸的混合离析液和有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理，所观察到的结果与实施例1相似。
[0053] 实施例3[〇〇54]本发明所述的肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法的再一个实例，包括以下步骤:
[0055] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有10 %的盐酸溶液的指形瓶中，水浴95?100°C处理3?4小时;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下;在蒸馏水中，将除去下表皮的叶片置于干净的载玻片上，使带有叶肉面贴近载玻片；向装载玻片上的叶片先滴加30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合液0.5? 2ml，再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml处理1?2min;将处理之后的载玻片全部浸泡在蒸馏水中，浸泡过程需要摇动蒸馏水1?2min，再倒掉蒸馏水，重复操作2?3次;将清洗干净的叶片置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，表皮面朝上；向载玻片上的叶片滴上100%酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1?2min，再倾斜载玻片，然后缓慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；向已经染好固绿的叶片上再滴加番红染色液0.5?2ml，染色8?12min，再倾斜载玻片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净； 向叶片中滴加lml50%甘油，用盖玻片封片;光学显微镜下观察叶片上表皮结构。仅用盐酸处理的叶片仅仅能获取肿柄菊叶片下表皮，同样也还需要用30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液和有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理才能获得肿柄菊叶片上表皮，由此方法所得到的图片与实施例1相似。
[0056] 对照例1[〇〇57] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，装有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在80°C 烘箱中烘烤7?24小时;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下，用镊子将叶片中的叶肉刮去;将获取的肿柄菊叶片上表皮置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，上表皮面朝上；向载玻片上的叶片滴上100%酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1?2min，再倾斜载玻片，然后缓慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；向已经染好固绿的叶片上再滴加番红染色液0.5 ?2ml，染色8?12min，再倾斜载玻片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净；向叶片中滴加lml50%甘油，用盖玻片封片;光学显微镜下观察叶片上表皮结构。仅用30%过氧化氢和30%醋酸混合液处理的肿柄菊叶片，只能获取叶片的下表皮，需要刮去叶肉组织才能观察辨别出肿柄菊叶片上表皮细胞。但是由此方法所得到的肿柄菊叶片上表皮结构不清晰， 而肿柄菊叶片的上表皮细胞结构是几乎观察不到的，只能在叶肉组织比较薄的地方辨别出上表皮细胞。如图8、图9所示。[〇〇58] 对照例2
[0059] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，装有30%过氧化氢和30 %冰乙酸的混合离析液指形瓶指形瓶中，水浴98?100°C加热处理5?7h;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下；在蒸馏水中，将去除下表皮的叶片置于干净的载玻片上，使带有叶肉面贴近载玻片；向装载玻片上的叶片先滴加30%过氧化氢和30 %冰乙酸的混合液0.5?2ml，再滴加有效氯含量彡5.5 %的安替福民原液0.5?2ml处理1?2min;将处理之后的载玻片全部浸泡在蒸馏水中，浸泡过程需要摇动蒸馏水1?2min， 再倒掉蒸馏水，重复操作2?3次;将清洗干净的叶片置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，表皮面朝上；向载玻片上的叶片滴上100%酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1?2min，再倾斜载玻片，然后缓慢的滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；向已经染好固绿的叶片上再滴加番红染色液0.5?2ml，染色8?12min，再倾斜载玻片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净；向叶片中滴加50 %甘油lml，用盖玻片封片;光学显微镜下观察叶片上表皮结构。用30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液处理后的叶片能撕下下表皮，再用30 %过氧化氢和30 %冰乙酸的混合离析液和有效氯含量多5.5 %的安替福民原液处理也可以获得叶片上表皮结构，在显微镜下观察到的叶片上表皮结构不如实例1所观察到的结构清晰完整。如图5所示。
[0060] 对照例3[0061 ] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有效氯含量多5.5%的安替福民原液指形瓶中，水浴98?100 °(:加热处理5?7h;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下。而经效氯含量多5.5%的安替福民原液处理的肿柄菊叶片被漂白透明，用镊子轻轻划过叶片表面叶片也会变成碎末，可以获得下表皮，但是结构不完整，完全不能获取上表皮，制片之后无论在哪个显微镜的倍数下都只能观察到叶片下表皮的结构，而且其结构不清晰。如图6、图7所示。
[0062] 对照例4[〇〇63] 将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有10 %重铬酸钾和10 %硝酸混合液的指形瓶中，水浴85?90 °C处理3?6小时;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片， 再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下。由于重铬酸钾和硝酸的氧化性较强，除了能把叶肉溶解掉之外，还能将部分的叶片表皮溶解掉，使叶片表皮结构不清晰，也很难在处理出叶片上表皮。
[0064]对照例5
[0065]将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm大小，用FAA固定液固定，将固定24 小时以上的叶片取出，置于装有10 %的氢氧化钠和10 %的碳酸钠混合液的指形瓶中，水浴加热1?2h;取出指形瓶，用镊子将叶片夹出，置于装有蒸馏水的培养皿中，展开叶片，再用镊子和解剖针将叶片下表皮撕下。用此方法肿柄菊叶片变黑，可以获得叶片下表皮，但是很难撕取;叶片上表皮不能撕取，即使再用30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液和有效氯含量多5.5%的安替福民原液处理也不能获取叶片上表皮结构。
【主权项】
1.肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1 )、将新鲜的肿柄菊叶片切成1?0.5cm X 1?0.5cm，用FAA固定液固定，将固定24小时 以上的叶片取出，置于装有30%过氧化氢和30%冰乙酸的混合离析液的指形瓶中，在80°C 烘箱中烘烤7?24小时；(2)、将离析后的肿柄菊叶片置于装有蒸馏水的培养皿中，用镊子和解剖针将肿柄菊叶 片下表皮撕下，(3)、在蒸馏水中，将除去下表皮的肿柄菊叶片置于干净的载玻片上，使带有叶肉面贴 近载玻片；(4)、向载玻片上的肿柄菊叶片先滴加30 %过氧化氢和30 %冰乙酸的混合液0.5?2ml， 再滴加有效氯含量彡5.5%的安替福民原液0.5?2ml处理1?2min;(5)、将处理之后的载玻片全部浸泡在蒸馏水中，浸泡过程需要摇动蒸馏水1?2min，再 倒掉蒸馏水，重复操作2?3次；(6)、将清洗干净的叶片置于干净的载玻片上，使叶肉面贴近载玻片，表皮面朝上；(7)、向载玻片上的叶片滴上100 %酒精lml，再滴上固绿染色液0.5?2ml，染色1? 2min，再倾斜载玻片，然后缓慢滴加70%酒精，以清洗多余的固绿染色液；(8)、向已经染好固绿的叶片上滴加0.5?2ml番红染色液，染色8?10分钟，倾斜载玻 片，缓慢滴加蒸馏水，将番红染色液清洗干净；(9)、向叶片中滴加50%甘油lml，用盖玻片封片，在光学显微镜下观察叶片上表皮结 构。2.根据权利要求1所述的肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法，其特征在于，步骤(1)所 述离析液还能够用1 〇 %盐酸。3.根据权利要求1所述的肿柄菊叶片上表皮离析制片的方法，其特征在于，步骤(1)所 述在烘箱中烘烤还能够在60 °C烘箱中烘烤36?48小时。
【文档编号】G01N1/28GK105954083SQ201610481889
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】周琼, 裴艳艳, 陆志森, 陈书权, 韦远涛
【申请人】广西大学