一种“浮雕式”纸基微流控检测设备及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物残留物的快速检测设备的设计及制备技术领域，特别是涉及一种“浮雕式”纸基微流控检测设备，由底物反应区和底物基底区组成，底物反应区置于底物基底区表面，由具备若干微小亲水性木质纤维丝及通过浸润方式包埋于其内的反应底物及呈色剂层制成；底物基底区是疏水性的有机材质。制备方法：（1）取市售疏水性的材质无菌处理后，裁剪成底物基底区；（2）无菌条件下，将亲水性的whatman滤纸置于底物基底区上，即形成底物反应区；然后，将制备好的反应底物及呈色剂溶液滴加在whatman滤纸上，25?40℃条件下，浸润0.5?2h；无菌条件下晾干，即制成“浮雕式”纸基微流控检测设备。使用本检测设备能对动物源性食品病原微生物进行准确快速粗定量检测。
【专利说明】
一种“浮雕式”纸基微流控检测设备及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物残留物的快速检测设备的设计及制备和使用方法技术领域，特别是涉及一种“浮雕式”纸基微流控检测设备及其制备方法。
【背景技术】
[0002]食源致病微生物污染是困扰食品安全的主要问题之一，而其快速准确检测与监测是保障食品安全的第一道防线。目前常用的检测技术主要有传统生化培养技术、免疫学技术、液相色谱技术和新近发展起来的分子生物学技术，传统生化培养技术具有特异准确的优势，但程序复杂、耗时耗力，检测周期较长，无法满足快速检测需要，基于免疫学和分子生物学技术发展起来的检测技术具有良好的特异性和灵敏性，准确快速，但对昂贵仪器设备和专业技术人员的依赖程度较高，无法满足食品生产一线的快速检测与监测需要。
[0003]纸基微流控检测装置(microf luidic paper based analytical devices，μPADs)是近几年发展起来的一种制备简便、成本低廉、几无污染的快速检测技术，其基本原理是:通过计算机设计图形，喷蜡打印滤纸，制备疏水隔离区，在隔离区内包被反应物，通过纸上反应实现对被检物的快速检测，该方法与传统生化培养技术、免疫学技术、液相色谱技术和的分子生物学检测技术具有很好的互补性，弥补了前述几种方法的不足和局限性，非常适合食品生产一线的快速检测需要。
[0004]然而，由于喷蜡打印技术近几年退出了市场，喷蜡打印机已市场难觅，导致纸基微流控检测技术陷入困境，而其替代方法如光刻胶技术、十八烷基三甲氧基硅烷(TMOS)蚀刻技术等又都存在检测纸片制备复杂、稳定性较差、不易保存的缺陷。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于:设计一种“浮雕式”纸基微流控检测设备，使用这种设备，能对动物源性食品病原微生物进行准确快速定性检测;更进一步的利用已知酶底物反应原理中的数学模型，在预设检测设备中底物一定量的基础上，通过已知的数学模型关系式，间接的计算出待测微生物的基本定量，能较好的满足食品生产一线的质控、抽检、初筛等便捷检测要求。
[0006]本发明技术方案:一种“浮雕式”纸基微流控检测设备，该检测设备由两部分组成:底物反应区和底物基底区，所述底物反应区垂直置于底物基底区表面;所述底物反应区由具备若干微小亲水性木质纤维丝及通过浸润方式均匀包埋于木质纤维丝内的反应底物及呈色剂层制成;所述底物基底区是由疏水性的有机材质制成。
[0007]所述的底物反应区为圆形或矩形或不规则形状，或依据检测目要求的任意形状。所述的底物反应区高于底物基底区l_5mm。所述的底物反应区为含有反应底物及呈色剂层的whatman滤纸。所述的底物基底区为具备疏水性的单面或双面胶。所述的反应底物及呈色剂层为能在待测细菌产生的特异酶催化下产生显色反应的物质组。
[0008]—种“浮雕式”纸基微流控检测设备的制备方法，该制备方法包括下述步骤:(I)取市售疏水性的单面或双面胶带无菌处理后，裁剪成大于底物反应区2倍以上的面积作为疏水性的底物基底区，备用；(2)在无菌条件下，将亲水性的whatman滤纸制作成要求的形状，并置于步骤(I)制备好的底物基底区上，即形成底物反应区；然后，将事先制备好的反应底物及呈色剂溶液均匀滴加在whatman滤纸上，通过浸润方式均匀的将反应底物及呈色剂包埋于whatman滤纸内细小的木质纤维丝中，25-40 °C条件下，浸润0.5_2h ；无菌条件下瞭干，即可制成“浮雕式”纸基微流控检测设备。
[0009]有益效果:使用本检测设备能对动物源性食品病原微生物进行准确快速粗定量检测;利用已知酶底物反应原理中的数学模型，在预设检测设备中底物一定量的基础上，间接的计算出待测微生物的基础数量，实现快速，基本定量的检测要求。同时，本发明克服了喷蜡打印技术退市后采用光刻和化学蚀刻等替代技术制备纸基微流控检测设备的复杂性和不稳定性，保持了纸基微流控检测设备制备方法简单的优势，并且材料简单、价格低廉、几无污染。
【附图说明】
[0010]附图1为实施例1主视结构示意图；附图2为A-A剖视图；附图3为实施例2的主视结构示意图；附图4为实施例3的主视结构示意图；附图5为实施例4的主视结构示意图；附图6为LM菌液浓度与灰度值的线性关系图。
【具体实施方式】
[0011]实施例1、一种“浮雕式”纸基微流控检测设备，如图1-2所示，该检测设备由两部分组成:底物反应区I和底物基底区2，所述底物反应区I垂直置于底物基底区2表面;所述底物反应区I由具备若干微小亲水性木质纤维丝4及通过浸润方式均匀包埋于木质纤维丝4内的反应底物及呈色剂层5制成;所述底物基底区2是由疏水性的有机材质3制成。
[0012]所述的底物反应区I高于底物基底区21-5mm。所述的底物反应区I为含有反应底物及呈色剂层5的whatman滤纸。所述的底物基底区2为具备疏水性的单面或双面胶。所述的反应底物及呈色剂层5为能在待测细菌产生的特异酶催化下产生显色反应的物质组。
[0013]实施例2、3及4，如图2-5所示，所述的底物反应区I为圆形或矩形或不规则形状，或依据检测目要求的任意形状。
[0014]实施例5、一种“浮雕式”纸基微流控检测设备的制备方法，该制备方法包括下述步骤:(I)取市售疏水性的单面或双面胶带无菌处理后，裁剪成大于底物反应区2倍以上的面积作为疏水性的底物基底区，备用；(2)在无菌条件下，将亲水性的whatman滤纸制作成要求的形状，并置于步骤(I)制备好的底物基底区上，即形成底物反应区;然后，将事先制备好的反应底物及呈色剂溶液均匀滴加在whatman滤纸上，通过浸润方式均匀的将反应底物及呈色剂包埋于whatman滤纸内细小的木质纤维丝中，25-40°C条件下，浸润0.5_2h ；无菌条件下晾干，即可制成“浮雕式”纸基微流控检测设备。
[0015]具体实践:无菌条件下，将whatman滤纸裁制成圆形或矩形或依据检测目要求的任意形状的亲水反应区，将市售单面或双面透明胶带制备成大于亲水反应区直径2倍以上的条状作为疏水基底区；将制备好的亲水反应区whatman滤纸片粘贴其上即可。将待检微生物产生的特异性酶的底物和显色剂包埋于亲水反应区内，例如:X-1nP(5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵)等，在25-40°C条件下，浸润0.5-2h;烘干放入无菌自封袋包装，用做食源微生物快速检测之用。
[0016]其中，最佳亲水反应区直径、疏水效果筛选。(I)参照文献资料设定6、7、8、9和10_直径的亲水区，滴加颜色水溶液(蓝色墨水)测试，经灰度值转换计算，获得最佳显色反应区直径为6-8 _。(2)采用7mm直径亲水反应区，滴加市售墨水原液，滴加量分别为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60微升共13个梯度，测定其最佳疏水效果，经比对分析，I和5微升亲水反应区充盈不完全，10和15微升虽充盈完全，但尚未形成明显的表面张力，不足以反映疏水区的隔离作用，20微升侧面观已开始形成略凸于亲水区表面的张力层，25微升以后表面张力层升高，到60微升仍然可以表现出完整的疏水效果，底层疏水基质层无渗漏，以最佳经济实用角度考虑，筛选20-25微升作为最佳疏水剂量。
[0017]实施例6、菌液浓度与灰度值量效关系确定:
(I)细菌复苏:将用甘油保存于_20°C的单核增生李斯特菌标准菌株CICC 21633的菌液复苏，之后进行平板划线，分离纯化。(2)菌液富集:挑取纯化后平皿中长势良好的单增李斯特菌菌落，进行Sh的菌液富集。(3)将富集好的菌液分别进行2、4、8、10、20倍的稀释，混匀后分别滴加到试纸片上，1.5h后，终止反应，观察显色结果并进行扫描。(4)活菌计数
将富集8 h的菌液进行活菌计数，得到所显颜色对应的菌液浓度。(5 )灰度转换:用Imagejl.4u软件对显色结果进行灰度读数，得到颜色反应的灰度值。(6)建立回归方程:所得的菌液浓度和灰度值关系采用Graph Pad Prism 5统计软件进行数据处理，并建立回归方程为:y=-0.03850 x + 9.615，r2=0.9357;如附图6所示。
[0018]结论:通过实施例6的实践能很好的证明，通过本发明浮雕式检测试纸(设备)，可以得出待测细菌的半定量的分析结果。可满足食品生产一线的质控、抽检、初筛等便捷检测要求。
[0019]本发明技术原理:自主研发一种专用打孔机制备不同直径不同形状的滤纸片作为亲水反应区(底物反应区)，以市售普通单面或双面胶带作为疏水隔离基层载体(底物基底区)，将亲水反应区滤纸片粘贴在疏水隔离基层上，形成“浮雕”样亲水检测区(底物反应区)。
[0020]本发明的创新点:首创了将亲水反应区(底物反应区)突出在疏水隔离区基层(底物基底区)之上，依靠亲水反应区滤纸的表面张力和周围疏水阻隔作用制备纸基微流控检测设备方法，该方法可将检测发生的化学反应限制一致特定区域内，从而实现了反应的可定量性，且制作材料可获得性强、制备简便、成本低廉，制作的检测试纸可弥补当前快速便捷检测技术的匮乏，填补了该领域的空白。
【主权项】
1.一种“浮雕式”纸基微流控检测设备，其特征在于:该检测设备由两部分组成:底物反应区(I)和底物基底区(2)，所述底物反应区(I)垂直置于底物基底区(2)表面;所述底物反应区(I)由具备若干微小亲水性木质纤维丝(4)及通过浸润方式均匀包埋于木质纤维丝(4)内的反应底物及呈色剂层(5 )制成;所述底物基底区(2 )是由疏水性的有机材质(3 )制成。2.根据权利要求1所述的检测设备，其特征在于:所述的底物反应区(I)为圆形或矩形或不规则形状。3.根据权利要求1或2所述的检测设备，其特征在于:所述的底物反应区(I)高于底物基底区(2)l_5mm。4.根据权利要求1所述的检测设备，其特征在于:所述的底物反应区(I)为含有反应底物及呈色剂层(5)的whatman滤纸。5.根据权利要求1所述的检测设备，其特征在于:所述的底物基底区(2)为具备疏水性的单面或双面胶。6.根据权利要求1所述的检测设备，其特征在于:所述的反应底物及呈色剂层(5)为能在待测细菌产生的特异酶催化下产生显色反应的物质组。7.一种“浮雕式”纸基微流控检测设备的制备方法，其特征在于:该制备方法包括下述步骤:(I)取市售普通双面胶带无菌处理后，裁剪成大于底物反应区2倍以上的面积作为疏水性的底物基底区，备用；(2)在无菌条件下，将亲水性的whatman滤纸制作成要求的形状，并置于步骤(I)制备好的底物基底区上，即形成底物反应区；然后，将事先制备好的反应底物及呈色剂溶液均匀滴加在whatman滤纸上，通过浸润方式均匀的将反应底物及呈色剂包埋于whatman滤纸内细小的木质纤维丝中，25-40 °C条件下，浸润0.5_2h ；无菌条件下瞭干，即可制成“浮雕式”纸基微流控检测设备。
【文档编号】G01N21/78GK105954273SQ201610288961
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】姚刚, 郑晓风, 张琦, 王金泉, 赵红琼, 苏战强, 钟旗, 李宏波, 闫向民
【申请人】新疆农业大学