一种基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法
【专利摘要】一种基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法。该制备方法包括：取洗净的导电基底预处理后，在其基底层的导电面上均匀涂布金属纳米层，干燥后完成电极的第一层修饰；将纳米金属氧化物与生物粘合剂按体积比1：1?3混合，取5?20μL混合液均匀涂布于金属纳米层之上得金属氧化物纳米层，再次干燥得半成品；配制0.5?20mg mL?1的胆固醇氧化酶溶液，取2?7μL的胆固醇氧化酶溶液均匀涂布在金属氧化物纳米层之上，干燥形成酶层，即完成生物传感器的制备。本发明具有经济、简单、快速、灵敏等优点，且制备简单，可用于胆固醇的定量检测，对于高度敏感的胆固醇生物传感器的开发具有深远意义。
【专利说明】一种基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及生物传感器的制备，尤其涉及一种基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇酶生物传感器的制备。
[0003]
【背景技术】
[0004]胆固醇是一种性质类似脂肪的物质，具有重要的生物功能，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及留体激素的原料。胆固醇经代谢还能转化为胆汁酸、类固醇激素、7-脱氢胆固醇，并且7-脱氢胆固醇经紫外线照射就会转变为维生素D3，所以胆固醇并非是对人体有害的物质。
[0005]但是，血清中胆固醇含量越高，就越有可能得动脉粥样硬化、心脏病等疾病。在血清中胆固醇正常含量应低于200 mgdL—超过240 mgdL—1将被视为血脂含量高。实际上，用于检测胆固醇浓度的生物传感器已有发表，但基于金属纳米颗粒的生物传感器备受关注，这是因为金属纳米材料具有独特的特征，如催化活性、光学、电子和磁特性等。而在众多金属中，常用来作为电极材料的多为金、银、铂和钯等。利用这些金属纳米材料独特的物理性质和化学性质，生物传感器的性能目前已经提高到一个新的水平。不仅可以使其快速化、微型化及多功能化，而且它还具有灵敏度高、选择性好、稳定性高、响应速度快、检测范围宽和耐负荷性高等优点。
[0006]而金属氧化物，如氧化锌(ZnO)是非常重要的一类氧化物半导体材料，均属于宽禁带半导体，可以为酶的固定提供更多的活性位点，可以高效吸附酶且保持酶的活性，有效提高酶活性中心与电极之间的电子传输速率，实现直接电子转移，最终获得高灵敏度的电化学传感性能。纳米尺度的ZnO有丰富多样的微观形貌，同时也具有高比表面积、良好的生物相容性、无毒性、化学及光化学稳定性、电化学活性及高电子传输能力等特点，使得ZnO纳米结构在光电、声表面波、场发射、压电、太阳能电池和传感等器件上有重要应用，通过纳米结构的调控及掺杂等手段，还可以进一步对性能进行优化和改进。
[0007]
【发明内容】
[0008]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种基于金属纳米材料与纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，结合电化学技术，利用金属纳米材料与纳米金属氧化物合成简易、电学性能优异和传感器制备简单等特性，获得工艺简单、低成本的胆固醇生物传感器的生产方式。
[0009 ]为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为: 一种基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
步骤I，取洗净的导电基底预处理后，在其基底层的导电面上均匀涂布金属纳米层，再在相对温度为30%-40%、温度为18 0C -28 °C下干燥，完成电极的第一层修饰；
步骤2，将纳米金属氧化物与生物粘合剂按体积比I: 1-3混合，取5-20yL混合液均匀涂布于金属纳米层之上得金属氧化物纳米层，再次在相对温度为30%_40%、温度为18°C_28°C下干燥得半成品；
步骤3，配制0.5-20mg mL—1的胆固醇氧化酶溶液，取2_7yL的胆固醇氧化酶溶液均匀涂布在金属氧化物纳米层之上，同样在相对温度为30%-40%、温度为18°C_28°C环境下干燥形成酶层，即完成生物传感器的制备。
[0010]作为制备方法改进的是，步骤I中金属纳米层的材料为金纳米颗粒、银纳米颗粒或银纳米线中任一种。
[0011 ]作为制备方法改进的是，步骤2中金属氧化物纳米层的材料为纳米氧化锌。
[0012]作为制备方法改进的是，步骤2中生物粘合剂为羧甲基纤维素、壳聚糖或全氟化膜中任一种。
[0013]作为制备方法改进的是，步骤2中金属氧化物与生物粘合剂按体积I: I混合而成。
[0014]作为制备方法改进的是，步骤3中所取胆固醇氧化酶溶液的体积为5yL。
[0015]作为制备方法改进的是，步骤3中胆固醇氧化酶溶液的配制分为两步:第一步，称取0.05-2mg的胆固醇氧化酶(ChOx)，溶于1yL，pH为5_9的磷酸缓冲液，得胆固醇氧化酶(ChOx)的储备液;第二步，取IyL的胆固醇氧化酶(ChOx)的储备液，加入9yL，pH为5-9的磷酸缓冲液制成。
[0016]作为胆固醇氧化酶溶液配制优选的是，所述磷酸缓冲液的pH均为7。
[0017]
有益效果
本发明提供的这种制备胆固醇生物传感器的方法具有很大的优势:
首先，用自组装法将胆固醇氧化酶，固定在氧化锌(ZnO)材料及金纳米粒子修饰的电极表面，制成一种新型的高灵敏的电化学传感器，实现了低电位下对胆固醇的检测，，该传感器灵敏度高，重现性好，性能稳定，且对胆固醇的选择性好，快捷，方便。
[0018]其次，巧妙的利用了氧化锌(ZnO)的优良性能，电化学活性及高电子传输能力等特点，同时加上金纳米粒子的化学稳定性和催化活性，最终获得高灵敏度的电化学传感性能。
[0019]最后，发明设计用价格低廉的氧化锌(ZnO)纳米材料代替贵重金属纳米粒子固定制作酶电极，不仅保持了纳米粒子对酶的强吸附和酶的活性，而且大大降低了电极制作的成本，在临床诊断上是很重要的，本发明经济、简单、快速、灵敏，且制备简单，可以低成本的批量生产，对有电化学生物传感器的应用推广具有深远意义。
【附图说明】
[0020]图1，以裸ITO电极(曲线a) ;Ch0x修饰的ZnO/ITO电极(曲线b) ;Ch0x修饰的Au/CMC/ITO电极(曲线C )以及ChOx修饰的ZnO/Au/CMC/1TO电极(曲线d )检测200mg/dL的胆固醇溶液中(PH7.0)的信号。[0021 ]图2，用葡萄糖，草酸，柠檬酸，L-半胱氨酸，抗坏血酸及胆固醇分别对ChOx/ZnO/Au/CMC/1TO电极进行特异性的性能检测。
[0022]
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例只是用于更加清楚地说明本发明的性能，而不能仅局限于下面的实施例。
[0024]
实施例1
步骤1，取洗净的氧化锡导电玻璃(ΙΤ0)，其尺寸为20mmX5mm，预处理，即将洗净的氧化锡导电玻璃(ITO)浸没在700C的体积比5:1:1的水、30%的双氧水、30%的氨水中90min，然后用流水冲洗，在50 °(:烤箱干燥。之后将预处理的氧化锡导电玻璃(ITO)电极浸没在2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES )乙醇溶液中12h，形成胺硅单层膜。用无水乙醇洗三遍，晾干，完成对氧化锡导电玻璃(ITO)的处理。将金纳米颗粒(AuNPs)超声5-10分钟，然后取2yL的金纳米颗粒(AuNPs)溶液点在预处理的氧化锡导电玻璃(ITO)的导电面上，室内环境下干燥，形成一层厚薄均匀的金纳米颗粒膜。
[0025]步骤2，配制羧甲基纤维素(CMC)溶液，即称量Img的羧甲基纤维素(CMC)，加入110μL的pH为7的磷酸缓冲液，超声混匀，待用;将20 mg mL—1的纳米氧化锌溶液与羧甲基纤维素(CMC)溶液以体积比1:1的比例混合，超声使其分散均匀。取1yL氧化锌溶液与羧甲基纤维素(CMC)溶液的混合溶液点在金纳米颗粒膜之上，室内环境下干燥得半成品。
[0026]步骤3，称取Img的胆固醇氧化酶(ChOx)，溶于1yL的pH为7磷酸缓冲液，作为胆固醇氧化酶(ChOx)的储备液，取IyL的胆固醇氧化酶(ChOx)的储备液，加入9yL的pH为7磷酸缓冲液，浓度为I Omg mL-1 ο，
取5yL的胆固醇氧化酶(ChOx)的使用液点于金属氧化物纳米层之上，同样在室内环境下干燥得酶层，即完成生物传感器的制备。
[0027]如图1所示，在200mg/dL的胆固醇溶液中(pH7.0 )，分别用裸ITO电极(曲线a) ; ChOx修饰的ZnO/1TO电极(曲线b) ; ChOx修饰的Au/CMC/1TO电极(曲线c )以及ChOx修饰的ZnO/Au/CMC/IT0电极(曲线d)做检测，发现金属氧化物纳米层修饰的电极能够灵敏检测出胆固醇浓度。
[0028]
实施例2
步骤1，取洗净的氧化锡导电玻璃(ΙΤ0)，其尺寸为20mmX5mm，预处理，即将洗净的氧化锡导电玻璃(ITO)浸没在700C的体积比5:1:1的水、30%的双氧水、30%的氨水中90min，然后用流水冲洗，在50 °(:烤箱干燥。之后将预处理的氧化锡导电玻璃(ITO)电极浸没在2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES )乙醇溶液中12h，形成胺硅单层膜。用无水乙醇洗三遍，晾干，完成对氧化锡导电玻璃(ITO)的处理。:取处理的氧化锡导电玻璃(ITO)，将金纳米颗粒(AuNPs)超声5-10分钟，然后取2yL的金纳米颗粒(AuNPs)溶液点在预处理的氧化锡导电玻璃(ITO)的导电面上，室内环境下干燥，形成一层厚薄较均匀的金纳米颗粒膜。
[0029]步骤2，配制质量比为1%的壳聚糖溶液，即称量1mg的壳聚糖，加入980yL的去离子水和1yL的乙酸，超声混匀，待用;将20 mg mL—1的氧化锌溶液与1%的壳聚糖溶液以1:1的比例混合，超声使其分散均匀。取1yL氧化锌溶液与1%的壳聚糖溶液的混合溶液点在金纳米颗粒膜之上，室内环境下干燥，形成第二层厚薄较均匀的纳米氧化锌与壳聚糖的混合膜。
[0030]步骤3，称取Img的胆固醇氧化酶(ChOx)，溶于1yL的pH为7磷酸缓冲液，作为胆固醇氧化酶(ChOx)的储备液，取IyL的胆固醇氧化酶(ChOx)的储备液，加入9yL的pH为7磷酸缓冲液，浓度为I Omg mL-1 ο，
取5yL的胆固醇氧化酶(ChOx)的使用液点于金属氧化物纳米层之上，同样在室内环境下干燥得酶层，即完成生物传感器的制备。
[0031]如图2所示，修饰了 ChOx的ZnO/Au/CMC/ITO电极对胆固醇的检测具有专一性，对于其他干扰因素，如葡萄糖，草酸，柠檬酸，L-半胱氨酸，抗坏血酸，均可排除干扰，保持检测的特异性。
[0032]以上对于实施例的详细说明仅作为实例提供，并非以此限制本发明多样化的实施方式。
【主权项】
1.一种基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I，取洗净的导电基底预处理后，在其基底层的导电面上均匀涂布金属纳米层，再在相对温度为30%-40%、温度为18 0C -28 °C下干燥，完成电极的第一层修饰； 步骤2，将纳米金属氧化物与生物粘合剂按体积比I: 1-3混合，取5-20yL混合液均匀涂布于金属纳米层之上得金属氧化物纳米层，再次在相对温度为30%_40%、温度为18°C_28°C下干燥得半成品； 步骤3，配制0.5-20mg mL—1的胆固醇氧化酶溶液，取2_7yL的胆固醇氧化酶溶液均匀涂布在金属氧化物纳米层之上，同样在相对温度为30%-40%、温度为18°C_28°C环境下干燥形成酶层，即完成生物传感器的制备。2.根据权利要求1所述的基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于:步骤I中金属纳米层的材料为金纳米颗粒、银纳米颗粒或银纳米线中任一种。3.根据权利要求1所述的基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于:步骤2中金属氧化物纳米层的材料为纳米氧化锌。4.根据权利要求4所述的基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于:步骤2中生物粘合剂为羧甲基纤维素、壳聚糖或全氟化膜中任一种。5.根据权利要求2所述基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于:步骤2中金属氧化物与生物粘合剂按体积1:1混合而成。6.根据权利要求1所述的基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于:步骤3中所取胆固醇氧化酶溶液的体积为5yL。7.根据权利要求1所述的基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤3中胆固醇氧化酶溶液的配制分为两步:第一步，称取0.05-2mg的胆固醇氧化酶，溶于10yL，pH为5-9的磷酸缓冲液，得胆固醇氧化酶的储备液;第二步，取UiL的胆固醇氧化酶的储备液，加入9yL，pH为5-9的磷酸缓冲液制成。8.根据权利要求7所述的基于纳米金属及纳米金属氧化物的胆固醇生物传感器的制备方法，其特征在于:所述磷酸缓冲液的pH均为7。
【文档编号】G01N27/327GK105954335SQ201610275333
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】黄维, 侯婷, 侯一婷, 吴琼
【申请人】南京邮电大学