一种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的hplc指纹图谱及其建立方法和应用
【专利摘要】本发明涉及中药材检测技术领域，具体公开了一种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的HPLC指纹图谱及其建立方法和应用。所述的指纹图谱的建立方法包含如下步骤：S1.精密称取多枝雾水葛药材，制备得到供试品溶液；S2.将供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到指纹图谱。所述的指纹图谱可以更全面的反应样品的特征峰信息，且该方法稳定性和重现性较好；利用该指纹图谱可以对多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮进行真伪或品质鉴别。
【专利说明】
-种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPLC指纹图谱及 其建立方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及中药材检测技术领域，具体设及一种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总 黄酬的HPlX指纹图谱及其建立方法和应用。
【背景技术】
[0002] 多枝雾水葛（学名：Pouzolzia zeylanica var.microphylla)为等麻科雾水葛属 下的一个变种。亚洲热带地区广布，产于中国云南东南部，广西，广东，福建，江西南部，台 湾;具有解毒消炎功效；用于治疗巧疮炎肿。黄酬类成分是多枝雾水葛的有效成分之一。目 前，缺乏一种精确的检测多枝雾水葛药材真伪和质量，W及多枝雾水葛总黄酬质量的方法。
[0003] 中药指纹图谱是指某种(或某产地）中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分 析手段，得到的能够标示该中药材或中成药药物特性的共有峰的图谱。指纹图谱从中医整 体观念和中药药效来自多种化学物质综合作用的观点出发，能够建立比较客观、整体和多 指标的综合评价体系，并通过图谱的整体特征，能够比较全面地反映出中药所含化学成分。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中存在的上述不足，提供一种 多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱。
[0005] 本发明所要解决的上述技术问题，通过W下技术方案予W实现：
[0006] -种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱的建立方法，包含如下 步骤：
[0007] Sl.精密称取多枝雾水葛药材，制备得到供试品溶液；
[000引S2.将供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到指纹图谱。
[0009]优选地，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：
[0010] S11.称取多枝雾水葛药材，加入5~15倍量(ml/g)石油酸回流提取1~5次，每次 0.5~化，滤过，弃去石油酸提取液，得滤渣；
[001 U S12.将滤渣服~15倍量(ml/g)乙醇回流提取1~5次，每次0.5~化，滤过，合并滤 液，浓缩至无醇味，加水溶解、离屯、，取上清液加水调整浓度至0.1~0.5g生药/ml并调节pH 至4.5~5.5,得样品溶液；
[0012] S13.吸取步骤S12制备得到的样品溶液，用AB-8大孔树脂柱富集总黄酬，上样流速 0.5~3BVA，上样完毕后，用1~5BV的水洗脱除杂，在用2~5BV体积分数为50~70%的乙醇 W1~3BVA的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，用滤膜滤过，得供试品溶液。
[0013] 优选地，所述的HPLC指纹图谱的建立方法，选自如下的A~M项中的任意一项或者 多项：
[0014] A.步骤S11.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量)石油酸；
[001引 B.步骤Sll.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）；
[0016] C.步骤S11.中，每次回流提取的时间为0.5~化(例如0.5、I、1.5或化）；
[0017] D.步骤S12.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量)乙醇；
[001引 E.步骤S12.中，乙醇的体积分数为50~95% (例如50%、60%、70%、80%、90%或 95%)；
[0019] F.步骤S12.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）；
[0020] G.步骤S12.中，每次回流提取的时间为0.5~化(例如0.5、1、1.5或化）；
[0021] H.步骤S12.中，离屯、的时间为5~50min，转速1500~5000巧m(例如时间为5~ 20min，转速为2000~4000巧m;或者时间为IOmin，转速为3000巧m);
[0022] I.步骤S12.中，取上清液加水调整浓度至0.2~0.4g生药/ml (例如0.2、0.3或0.4g 生药/ml);
[0023] 1步骤512.中，调节抑至4.5、4.8、5.0、5.2或5.5。
[0024] K.步骤S13.中，上样流速为1~3BVA(例如lBV/h、2BV/h或3BVA);
[00巧]L.步骤S13.中，用2~4BW例如2BV、3BV或4BV)的水洗脱除杂；
[0026] M.步骤S13.中，用2~4BV(例如2BV、3BV或4BV)体积分数为50%、60%或70%的乙 醇WIBVA或IBVA的流速洗脱。
[0027] 上述的倍量表示每克多枝雾水葛药材中加入石油酸或乙醇的毫升数。
[0028] 上述的单位IBV为体积单位，表示体积相当于1倍大孔树脂柱体积。
[0029] 优选地，步骤S13.中在用AB-8大孔树脂柱富集总黄酬前，精密吸取步骤S12制备得 到的样品溶液;在用滤膜滤过前，将收集乙醇洗脱液，用体积分数为50~70% (例如50%、 60%或70%)的乙醇定容。
[0030] 优选地，步骤S2中高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用ACQUITY U化C BEH SHI化D RP18色谱柱；W乙腊-0.2 %甲酸水为流动相进行梯度洗脱；流速为0.2~0.5mL/ min,检测波长为30~330nm;进样量为0.2~IOiil;
[0031] 相梯度洗脱条件为:〇~22min，乙腊的体积分数变化为15%~19%;22~26111111，乙 腊的体积分数变化为19 %~24 % ; 26~32min，乙腊的体积分数变化为24%~24 % ; 32~ 40min，乙腊的体积分数变化为24%~38%。
[0032] 更优选地，步骤S2中高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为21mm X 150mm，l.7皿的AC卵口 Y UPLC邸H SHI化D RP18色谱柱；W乙腊-0.2%甲酸水为流动相进 行梯度洗脱;流速为0.3mL/min，检测波长为330nm;进样量为0.化1;
[0033] 相梯度洗脱条件为:0~22min，乙腊的体积分数变化为15%~19%;22~26111111，乙 腊的体积分数变化为19 %~24 % ; 26~32min，乙腊的体积分数变化为24%~24 % ; 32~ 40min，乙腊的体积分数变化为24%~38%。
[0034] 上述0.2%甲酸水表示水中含有体积分数为0.2%的甲酸。
[0035] 本发明还提供一种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱，是通过 上述任一项所述的建立方法建立得到。
[0036] 本发明还一种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的标准HPLC指纹图谱，选自 (1)~(3)中的任一项：
[0037] (1)使用单批次或多批次多枝雾水葛道地药材并且按照上述任一项所述的建立方 法得到的多枝雾水葛药材HPlX指纹图谱；
[0038] (2)将使用多批次多枝雾水葛道地药材并且按照上述任一项所述的建立方法得到 的HPlX指纹图谱通过平均数法或者中位数法制成对照谱图；
[0039] (3)其有 11 个特征峰，保留时间分别为 6.814±0.05min，11.737±0.05min，12.307 ±0.05min，12.987±0.05min，18.821±0.05min，19.888±0.05min，21.115±0.05min， 24.684±0.05min，26.924±0.05min，27.643±0.05mi^P30.297±0.05min。
[0040] 按照本发明提供的方法，测定了多枝雾水葛药材，确定了上述11个特征峰。
[0041] 本发明还提供一种检测多枝雾水葛药材质量或多枝雾水葛总黄酬质量的方法，包 括如下步骤:首先按上述任一项所述的HPlX指纹图谱的建立方法，建立待检测多枝雾水葛 药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱;然后与上述多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄 酬的标准HPlX指纹图谱进行比较，最后判断多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的质量是 否合格。
[0042] 所述的判断可W根据指纹图谱的相似度来判断，若二者指纹图谱的相似度不低于 0.85，则为质量合格;如果低于0.85，则为不合格;所述相似度通过国家药监局颁布的指纹 图谱相似度评价软件得到。
[0043] 本发明还提供一种上述多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱，或 上述多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的标准HPlX指纹图谱在鉴别多枝雾水葛药材或 多枝雾水葛总黄酬的真伪或质量中的应用。
[0044] 有益效果：（1)本发明首次建立了多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指 纹图谱W及多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的标准HPlX指纹图谱；（2)该指纹图谱W 及标准指纹图谱可W更全面的反应样品的特征峰信息，且该方法稳定性和重现性较好；（3) 利用该指纹图谱W及标准指纹图谱可W对多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬进行真伪 或品质鉴别。
【附图说明】
[0045] 图1为多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPLC标准指纹图谱。
[0046] 图2为多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPLC标准指纹图谱的精密度试验 图。
[0047] 图3为多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPLC标准指纹图谱的重复性实验 图。
[0048] 图4为多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPLC标准指纹图谱的稳定性实验。
[0049] 图5为多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPLC标准指纹图谱与液-质（谱)联 用总离子流图比较图；其中A为总离子流图，B为指纹图谱图。
【具体实施方式】
[0050] W下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限 定。
[0051] 实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，所用 试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[0052] 实施例1多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱的建立
[0化3] I、仪器与试剂
[0化4] Waters SYNAPT G2-S Q-TOF质谱仪（美国Waters公司）
[0化日]AC卵口Y UPLC型超高效液相色谱仪(美国waters公司）
[0056] AC卵口Y UPLC 邸H 甜IELD RP18色谱柱（21mmX150mm，1.7曲1)
[0057] AY120型托盘电子分析天平（日本岛津公司）
[005引DK-S24型电热恒溫水浴锅(上海精宏实验设备有限公司）
[0化9] LAB0R0TA4000旋转蒸发仪(德国Heidol地）。
[0060] 乙腊为色谱纯(欧普森牌），液相用水为屈臣氏蒸馈水，乙醇为工业乙醇，其它试剂 为分析纯。
[0061] 多枝雾水葛药材购自广西玉林，经广东药学院刘基柱教授鉴定均为等麻科雾水葛 属多枝雾水葛化uzolzia zeylanica(L. )Benn.va;r.mic;rophylla(Wedd. )W.T.Wang的全草。
[0062] 2、实验方法
[0063] 2.1供试品溶液的制备
[0064] 取多枝雾水葛药材进行粉碎，称量药材粗粉25g，置于圆底烧瓶中，分别加入8倍量 石油酸80°C回流提取2次，每次化。滤渣挥去石油酸后，加入8倍量70%乙醇回流提取3次，每 次化，合并3次滤液，减压浓缩至无醇味，加水使充分溶解，离屯、（300化/min) IOmin，取上清 液加水调整浓度至〇.3g生药/ml并调节抑至5。精密吸取75ml上述样品溶液加在AB-8大孔树 脂柱（巫1.5 X 8cm)，上样流速2BVA，加水2BV除杂，加60 %乙醇2BVW2BVA洗脱，收集洗脱 液，加60%乙醇定容至100mL容量瓶中，摇匀，0.22皿滤膜滤过，即得。所述的乙醇百分含量 均为体积百分含量。
[00化]2.2色谱条件
[0066] 采用规格为21mmX 150mm，1.7皿的AC卵ITY IMX B邸細I化D RP18色谱柱；W乙 腊-0.2 (体积）％甲酸水为流动相进行梯度洗脱;流速为0.3mL/min，检测波长为330nm;进样 量为0.化1;
[0067] 相梯度洗脱条件为:0~22min，乙腊的体积分数变化为15%~19%;22~26111111，乙 腊的体积分数变化为19 %~24 % ; 26~32min，乙腊的体积分数变化为24%~24 % ; 32~ 40min，乙腊的体积分数变化为24%~38%。
[0068] 将供试品溶液，按照2.2所述的色谱条件检测，得到的多枝雾水葛药材或多枝雾水 葛总黄酬的HPLC标准指纹图谱如图1所示。图1显示该指纹图谱有11个特征峰，保留时间分 别为 6.814min，11.737min，12.307min，12.987min，18.821min，19.888min，21.115min， 24.684min，26.924min，27.643min和30.297min。
[0069] 3、方法学考察
[0070] 3.1精密度实验
[0071] 精密称量药材粗粉25g，按2.1项下的方法制备供试品溶液，按2.2的色谱条件进行 测定，连续进样6次，各色谱峰的相对峰面积的RSD小于2.0%，相对保留时间RSD小于2.0%， 按2.4项下方法计算指纹图谱的相似度，分别为0.993、0.996、0.992、0.997、0.995、0.996 (见图2)，表明仪器精密度良好。
[0072] 3.2重复性实验
[0073] 精密称量药材粗粉25g，按2.1项下的方法平行制备供试品溶液6份，按2.2的色谱 条件进行测定，结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于7%，相对峰面积的RSD均 小于5%，按2.4项下方法计算指纹图谱的相似度，分别为0.997、0.998、0.998、0.995、0.997 (见图3)，说明该方法的重复性良好。
[0074] 3.3稳定性实验
[0075] 精密称量药材粗粉25g，按2.1项下的方法平行制备供试品溶液，室溫下放置，分别 在0,2,4,12,24时按2.2的色谱条件进行测定，各色谱峰的相对保留时间的RSD小于3%;相 对峰面积的RSD小于5 %，按2.4项下方法计算指纹图谱的相似度，分别为0.993、0.987、 0.997、0.994、0.997、0.996 (见图4 )，表明供试品溶液在24小时内稳定。
[0076] 实施例2多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酬的HPlX指纹图谱特征峰的鉴定
[0077] 供试品溶液制备参照实施例1中的2.1项。
[007引色谱条件参照实施例1中的2.2项。
[00巧]对照品溶液制备:精密称取6,7-二甲基-1,4-二氨-2,3-哇喔嘟二酬、芹菜素-6-C- 曰-心阿拉伯糖8-C-0-D-葡萄糖巧、芹菜素-6-(：-[0-心阿拉伯糖（1 一6)-e-D-葡萄糖]、山奈 酪-3-0-[a-k鼠李糖（1 一6)-e-D-葡萄糖]-7-0-日寸-葡萄糖巧、搬皮素-3-0-[aA-鼠李糖 (1 一6) -P-D-葡萄糖]-7-0-aA-鼠李糖巧、搬皮素-3，7-2-0-aA-化喃鼠李糖巧、山奈酪-3- 0- [ CtA-鼠李糖（1 一6) -P-D-葡萄糖]-7-0-aA-鼠李糖巧和山奈酪-3，7-2-0-日寸-化喃鼠李 糖巧对照品适量，用适量甲醇溶解配置成对照品溶液，即得。
[0080]质谱检测条件：电喷雾离子源化SI),负离子模式；毛细管电压（capillary voltage)3000V;碰撞电压山〇11131〇11，〔6)为30~40V;锥孔电压（sampling cone)40V;去溶 剂溫度(TEM)为350°C ;氮气为辅助喷雾电离与去溶剂气体，去溶剂气体积流量为S(K)LA;锥 孔气流cone gas flow)为50L/h。
[0081 ]通过UPLC-ESI-Q-TOF-MS检测得到多枝雾水葛药材中各化学成分的总离子流图与 指纹图谱图（见图5)，并结合各化学成分的提取离子流图及与对照品色谱图、相关文献数据 对比，对指纹图谱中11个特征峰进行进一步的化学成分确认，结果见表1。
[0082] 表1色谱峰的鉴别与鉴定
[00831
[0084] 表1结果表明，本发明的指纹图谱W及标准指纹图谱中包含了多枝雾水葛中已知 的多个化合物，具有高度的可靠性。
[0085] 实施例3利用标准指纹图谱检测多枝雾水葛药材真伪的方法
[0086] 随机从市场上购买一批多枝雾水葛药材检测其真伪。
[0087] 首先按实施例1所述的HPLC指纹图谱的建立方法，建立待检测多枝雾水葛药材的 HPLC指纹图谱;然后与按实施例1方法建立得到的多枝雾水葛药材HPLC标准指纹图谱进行 比较;通过国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件测得该批药材的HPlX指纹图谱与标 准HPlX指纹图谱的相似度为0.9，可W判定，该批药材为合格的多枝雾水葛药材。
【主权项】
1. 一种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在 于，包含如下步骤：51. 精密称取多枝雾水葛药材，制备得到供试品溶液；52. 将供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到指纹图谱。2. 根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的供试品溶液通过包含如下步骤 的方法制备得到：511. 称取多枝雾水葛药材，加入5~15倍量(ml/g)石油醚回流提取1~5次，每次0.5~ 3h，滤过，弃去石油醚提取液，得滤渣；512. 将滤渣用5~15倍量(ml/g)乙醇回流提取1~5次，每次0.5~3h，滤过，合并滤液， 浓缩至无醇味，加水溶解、离心，取上清液加水调整浓度至〇. 1~〇. 5g生药/ml并调节pH至 4.5~5.5,得样品溶液；513. 吸取步骤S12制备得到的样品溶液，用AB-8大孔树脂柱富集总黄酮，上样流速0.5 ~3BV/h，上样完毕后，用1~5BV的水洗脱除杂，在用2~5BV体积分数为50~70 %的乙醇以1 ~3BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，用滤膜滤过，得供试品溶液。3. 根据权利要求2所述的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，选自如下的A~M项中 的任意一项或者多项： A. 步骤S11.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量)石油醚； B. 步骤Sll.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）； C. 步骤SI 1.中，每次回流提取的时间为0.5~2h(例如0.5、I、1.5或2h); D. 步骤S12.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量）乙醇； E .步骤S12 .中，乙醇的体积分数为50~95% (例如50%、60%、70%、80%、90%或 95%)； F. 步骤S12.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）； G. 步骤S12.中，每次回流提取的时间为0.5~2h (例如0.5、I、1.5或2h); Η.步骤S12.中，离心的时间为5~50min，转速1500~5000rpm(例如时间为5~20min，转 速为2000~4000rpm;或者时间为IOmin，转速为3000rpm); I.步骤SI2.中，取上清液加水调整浓度至0.2~0.4g生药/ml (例如0.2、0.3或0.4g生 药/ml); 了.步骤312.中，调节口!1至4.5、4.8、5.0、5.2或5.5。 K. 步骤Sl3.中，上样流速为1~3BV/h(例如lBV/h、2BV/h或3BV/h); L. 步骤S13.中，用2~4BV (例如2BV、3BV或4BV)的水洗脱除杂； M. 步骤Sl3 .中，用2~4BV(例如2BV、3BV或4BV)体积分数为50 %、60 %或70 %的乙醇以 I BV/h或I BV/h的流速洗脱。4. 根据权利要求2所述的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S13.中在用AB-8 大孔树脂柱富集总黄酮前，精密吸取步骤S12制备得到的样品溶液;在用滤膜滤过前，将收 集乙醇洗脱液，用体积分数为50~70% (例如50%、60%或70% )的乙醇定容。5. 根据权利要求2所述的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S2中高效液相色 谱仪分析的色谱条件为:采用ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色谱柱；以乙腈-0.2%甲酸 水为流动相进行梯度洗脱;流速为0.2~0.5mL/min，检测波长为30~330nm;进样量为0.2~ ΙΟμΙ; 相梯度洗脱条件为:〇~22min，乙腈的体积分数变化为15 %~19% ; 22~26min，乙腈的 体积分数变化为19 %~24 %; 26~32min，乙腈的体积分数变化为24 %~24 %; 32~40min， 乙腈的体积分数变化为24%~38%。6. 根据权利要求5所述的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S2中高效液相色 谱仪分析的色谱条件为：采用规格为21mmX150mm，1.7ym的ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色谱柱；以乙腈-0.2%甲酸水为流动相进行梯度洗脱;流速为0.3mL/min，检测波长为 330nm;进样量为0·2μ1; 相梯度洗脱条件为:〇~22min，乙腈的体积分数变化为15 %~19% ; 22~26min，乙腈的 体积分数变化为19 %~24 %; 26~32min，乙腈的体积分数变化为24 %~24 %; 32~40min， 乙腈的体积分数变化为24%~38%。7. -种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的HPLC指纹图谱，其特征在于，通过权利 要求1~6任一项所述的建立方法建立得到。8. -种多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的标准HPLC指纹图谱，其特征在于，选自 (1)~(3)中的任一项： (1) 使用单批次或多批次多枝雾水葛道地药材并且按照权利要求1至6中任一项所述的 建立方法得到的多枝雾水葛药材HPLC指纹图谱； (2) 将使用多批次多枝雾水葛道地药材并且按照权利要求1至6中任一项所述的建立方 法得到的HPLC指纹图谱通过平均数法或者中位数法制成对照谱图； (3) 其有11 个特征峰，保留时间分别为 6.814±0.05min，11.737±0.05min，12.307 土 0.05min，12.987±0.05min，18.821±0.05min，19.888±0.05min，21.115±0.05min， 24.684±0.05min，26.924±0.05min，27.643±0.05mir^P30.297±0.05min。9. 一种检测多枝雾水葛药材质量或多枝雾水葛总黄酮质量的方法，其特征在于，包括 如下步骤:首先按权利要求1~6任一项所述的HPLC指纹图谱的建立方法，建立待检测多枝 雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的HPLC指纹图谱;然后与权利要求8所述的多枝雾水葛药 材或多枝雾水葛总黄酮的标准HPLC指纹图谱进行比较，最后判断多枝雾水葛药材或多枝雾 水葛总黄酮的质量是否合格。10. 权利要求7所述的多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的HPLC指纹图谱，或权利要 求8所述的多枝雾水葛药材或多枝雾水葛总黄酮的标准HPLC指纹图谱在鉴别多枝雾水葛药 材或多枝雾水葛总黄酮的真伪或质量中的应用。
【文档编号】G01N30/06GK105954450SQ201610171641
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年3月23日
【发明人】郭丽冰, 陶曙红, 陈卓瀚
【申请人】广东药学院