一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，属于分析化学技术领域，具体涉及一种专用于分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法。本发明采用脱脂棉收集唾液样品，采集完后脱脂棉置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压得到唾液样品，经高速离心后取上清液，然后依次经盐析萃取、甲酯化反应和溶剂萃取分离后，浓缩至近干，再复溶，过微孔滤膜，滤液采用气相色谱?质谱联用法测定唾液中有机酸和脂肪酸物质，制作标准曲线，外标法定量。本发明方法可以有效的用于测定唾液中有机酸和脂肪酸物质，方法可行，检出限低，精密度好，准确可靠，具有推广应用价值。
【专利说明】
-种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体设及一种专用于分离测定唾液中有机酸和脂 肪酸物质的方法。
【背景技术】
[0002] 食品中有机酸和脂肪酸是食品香吃味的主要来源，它们的含量及相互比例对色、 香、味乃至质量和风格均有着直接影响。对食品中有机酸和脂肪酸的研究，通常是直接测定 食品中运些组分的含量。然而，食品饮食过程中，被口腔唾液选择性溶解吸收的成分才是刺 激人体产生感官感受的物质，决定了食品的风格和风味。研究测定饮食者唾液中吸收溶解 的有机酸和脂肪酸成分，则能更直接、客观的得到决定食品风味的化学成分数据，不仅可为 食品、烟草等的香吃味评定提供数据支持，还可为改善食品风味提供理论依据。
[0003] 目前，测定不同基质、样品中有机酸或脂肪酸已有大量报道，然而唾液样品中有机 酸和脂肪酸物质的测定还未见报道。唾液样品基体复杂，主要成分是水（占99%)，但含有多 种有机物如黏蛋白、黏多糖、唾液淀粉酶、溶菌酶、免疫球蛋白、血型物质、尿素、尿酸和游离 氨基酸等，W及无机物和一些气体分子，被分析成分在唾液中含量极低，还会受到唾液中多 种有机成分和无机成分的干扰。因此，开发简单快速、高选择性、高灵敏度、定量准确的唾液 中有机酸和脂肪酸物质的提取和分离测定方法非常迫切。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对目前唾液中有机酸和脂肪酸物质分离测定的方法未见文 献报道的现状，W及现有技术的不足，提供一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方 法，该方法可行，精密度好，检出限低，准确可靠，具有推广应用价值。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括W下步骤： 步骤（1)，样品采集:将脱脂棉置于口腔内，放置0.2-5 min后，取出吸收了唾液的脱脂 棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离屯、管中，经高速离屯、后， 收集上清液得到唾液样品； 步骤(2)，盐析萃取:移取唾液样品于离屯、管中，加入甲醇、氯化钢、萃取用盐和抑调节 剂，经满旋振荡至混合均匀后离屯、，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液； 甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5-2:1;氯化钢的加入质量为唾液样品质量的5- 20%； 所述的萃取用盐为无水硫酸儀和无水硫酸钢中的一种或两种的组合物;萃取用盐的加 入质量为唾液样品质量的40-70%;当为组合物时，无水硫酸儀和无水硫酸钢的之间的比例 没有具体限制； pH调节剂为液体酸或缓冲盐，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸中的一种或几种的组合 (当为组合物时，各组分的之间的比例没有具体限制），缓冲盐为巧樣酸钢和巧樣酸氨二钢 中的一种或两种的组合（当为组合物时，各组分的之间的比例没有具体限制）；液体酸的加 入体积是唾液样品体积的0.01-1%，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10-25%; 步骤(3)，甲醋化:将步骤(2)得到的第一萃取液中加入促甲醋化反应试剂后在50-80°C 下的密闭条件进行甲醋化反应，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，取萃取 液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液； 所述的促甲醋化反应试剂为硫酸、盐酸、氨氧化钟或=氣化棚，加入体积为步骤(2)得 到的第一萃取液体积的5-40%;所述的饱和食盐水的体积是步骤(2)得到的第一萃取液体积 的 5〇-200〇/〇; 所述的萃取溶剂为二氯甲烧、=氯甲烧、正己烧或环己烧;每次萃取萃取溶剂的体积是 步骤(2)得到的第一萃取液体积的25-100%; 所述的干燥剂为无水硫酸儀或无水硫酸钢;干燥剂的质量是步骤(2)中萃取溶剂质量 的 5-25〇/〇; 步骤(4)，测定:将步骤(3)得到的第二萃取液，在30-45°C下浓缩至近干后，用正己烧复 溶，正己烧的用量为步骤(2)移取唾液样品体积的10-200%，过0.22皿微孔滤膜，滤液采用 气相色谱-质谱联用法分析，外标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。
[0006] 进一步，优选的是步骤(1)中的脱脂棉的质量为0.2-2.0 g。
[0007] 进一步，优选的是步骤（1)中唾液离屯、转速不低于10000巧m，离屯、时间不少于10 min。
[000引进一步，优选的是步骤(2)中唾液移取量为0.5-10 mL，满旋振荡转速为100-20000 巧m，满旋振荡时间为0.5-10 min,离屯、转速不低于10000巧m，离屯、时间不少于5 min。
[0009] 进一步，优选的是所述的甲醋化反应是将加入促甲醋化反应试剂的第一萃取液中 移入微波萃取罐中并密闭，放入微波萃取系统中在50-8(TC条件下进行甲醋化反应，反应时 间为1-10 min; 或者所述的甲醋化反应是将加入促甲醋化反应试剂的第一萃取液中移入密闭的锥形 瓶中，在加热50-80°C条件下进行甲醋化反应，反应时间为2-30 min。
[0010] 进一步，优选的是步骤(3)中萃取次数为1-2次。
[0011] 进一步，优选的是步骤(4)中收集到的萃取液在35°C水浴中减压蒸发浓缩至近干， 用正己烧复溶，定容至1.0-5.0 mL，过0.22皿滤膜后进样分析。
[0012] 进一步，优选的是步骤(4)中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条 件如下： 色谱柱为长度X内径X膜厚为60 mX0.32 mm X 0.25皿，DB-5MS石英毛细管柱或相 当者;载气氮气，纯度>99. 999 %，恒流模式，流量2.5血/min;进样口溫度:230°C;不分流 进样;进样量：1化;程序升溫:初始溫度120°C，保持2 min,然后WlOtVmin升溫到160°C， 再W20 °C/min 升溫到200°C，保持20 min; 电离方式为电子轰击源(EI)，色谱质谱接口溫度为250°C，离子源溫度为220°C，电离能 量为70 eV，溶剂延迟:3.0 min,选择离子监测模式，离子选择参数见表1。
[0013] 表1有机酸和脂肪酸的定量和辅助定性离子
进一步，优选的是步骤(4)中标准曲线绘制方法如下:配制有机酸和脂肪酸对应甲醋化 产物的系列标准溶液，浓度为:0.1 mg/L、0.5 mg/L、l mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系 列标准溶液进行气相色谱-质谱联用仪分析，得到标准溶液的总离子流色谱图（如图I所 示），根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，W各物质浓度为横坐标，作各测定物质的标准 曲线。
[0014] 进一步，优选的是所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酷丙酸、苹果酸和巧樣 酸;所述的脂肪酸为栋桐酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
[0015] 本发明与现有技术相比，其有益效果为:本发明方法可W有效的用于测定唾液中 有机酸和脂肪酸物质，方法可行，前处理简单，萃取效率高于98.5%，甲醋化效率高于98%，萃 取效率和甲醋化效率高，检测限低，精密度好，准确可靠，具有推广应用价值。
[0016] W上说明为本发明技术方案的概述，为了更清楚的了解本发明的技术手段，而可 依照说明书的内容予W实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明 显易懂，现特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明有机酸和脂肪酸对应甲醋化产物混合标准溶液(2.0 mg/L)的总离子 流色谱图； 图2为唾液加标样品的总离子流色谱图。
[001引图中各峰的含义如下：1,6.47 min,乳酸；2,8.32 min,草酸；3,9.60 min,丙二酸； 4,9.75 min,乙酷丙酸；5,10.18 min,苹果酸；6,10.63 min,巧樣酸；7,10.99 min,栋桐酸； 8,11.53 min,亚油酸;9,11.74 min,油酸+亚麻酸；10,13.20 min,硬脂酸。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但其并不限制本发明。
[0021] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过购买获得的 常规产品。
[0022] 本发明所述的萃取液层为萃取后萃取溶剂所在层。
[0023] 本发明如无特殊说明，百分号代表质量百分数。
[0024] 实施例1 一种分离测定烟草吸食者唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括W下步骤： 步骤(1)，样品采集:将0.2 g脱脂棉置于烟草吸食者口腔内，放置0.3 min后取出，置于 注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离屯、管中，于10000 rpm转速下离 屯、时间10 min得到唾液样品。
[00巧]步骤(2)，盐析萃取:移取2.0 mL唾液样品于离屯、管中，加入2.0 mL甲醇、1 g无水 硫酸儀、0.2 g氯化钢、0.2 g巧樣酸钢、0.1 g巧樣酸氨二钢，于500 rpm转速满旋振荡2.0 min,再于10000巧m转速下离屯、时间5 min,取萃取液层； 步骤(3)，甲醋化:萃取液中加入萃取液体积10%的硫酸，移入微波萃取罐中并密闭，放 入微波萃取系统中于60°C下进行甲醋化反应2 min。反应完成后，加入2.0 mL饱和食盐水、 0.5血正己烧进行萃取，取正己烧层，再加入0.5血正己烧重复萃取1次，合并正己烧层，并 用1.0 mL水洗至中性，加入0.25 g无水硫酸钢进行干燥。
[00%]步骤(4)，测定:将步骤(3)收集到的洗脱液在30°C水浴中，用减压蒸发浓缩至近 干，用1.0 mL正己烧复溶，过0.22 Mi滤膜后进样分析，滤液采用气相色谱-质谱联用法分 析，得到的样品的总离子流色谱图如图2所示，根据标准曲线计算有机酸和脂肪酸物质的含 量。
[0027] 步骤(3)中采用的微波萃取系统为EXC化全功能型微波化学工作平台（上海脸尧仪 器科技发展有限公司）。
[0028] 表2是本方法分析烟草吸食者唾液中有机酸和脂肪酸物质的试验数据。表2给出了 本分析方法的线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率相关参数，表明该方法 结果可靠，精密度好。萃取时加入盐与不加入盐相比显著提高了目标分析物的萃取率;加入 pH调节剂，不但可W保证目标物的稳定性，还可进一步提高萃取效率;采用微波辅助甲醋 化，甲醋化效率高，甲醋化完全，因此目标物回收率高。该方法适合于烟草吸食者唾液中有 机酸和脂肪酸物质的分析检测。
[0029] 表2线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率
n表示实验重复次数。
[0030] 实施例2 一种分离测定白酒饮用者唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括W下步骤： 步骤(1)，样品采集:将1.5 g脱脂棉置于烟草吸食者口腔内，放置4.0 min后取出，置于 注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离屯、管中，于15000 rpm转速下离 屯、时间12 min得到唾液样品。
[0031] 步骤(2)，盐析萃取:移取8.0 mL唾液样品于离屯、管中，加入8.0 mL甲醇、5 g无水 硫酸钢、0.8 g氯化钢、10化甲酸，于15000 rpm转速满旋振荡10.0 min,再于10000 rpm转 速下离屯、时间5 min,取萃取液层； 步骤(3)，甲醋化:萃取液中加入萃取液体积30%的=氣化棚，在水浴中于75°C下进行甲 醋化反应5 min。反应完成后，加入10.0 mL饱和食盐水、5.0 mL二氯甲烧进行萃取，取二氯 甲烧层，再加入3.0 mL二氯甲烧重复萃取1次，合并二氯甲烧层，并用5.0 mL水洗至中性，加 入2.5 g无水硫酸儀进行干燥。
[0032] 步骤(4)，测定:将步骤(3)收集到的洗脱液在40°C水浴中，用减压蒸发浓缩至近 干，用2.0 mL正己烧复溶，过0.22 Mi滤膜后进样分析，滤液采用气相色谱-质谱联用法分 析，根据标准曲线计算有机酸和脂肪酸物质的含量。
[0033] 表3是本方法分析白酒饮用者唾液中有机酸和脂肪酸物质的试验数据。表3给出了 本分析方法的线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率相关参数，表明该方法 结果可靠，精密度好。该方法适合于白酒饮用者唾液中有机酸和脂肪酸物质的分析检测。
[0034] 表3线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率
n表示实验重复次数。
[0035] 实施例3 一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括W下步骤： 步骤(1)，样品采集:将0.2 g脱脂棉置于口腔内，放置0.2 min后，取出吸收了唾液的脱 脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离屯、管中，经高速离屯、 后，收集上清液得到唾液样品；唾液离屯、转速不低于10000 rpm，离屯、时间不少于10 min; 步骤(2)，盐析萃取:移取0.5 mL唾液样品于离屯、管中，加入甲醇、氯化钢、萃取用盐和 抑调节剂，经满旋振荡至混合均匀后离屯、，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液;其中， 满旋振荡转速为100巧m，满旋振荡时间为0.5min，离屯、转速不低于10000巧m，离屯、时间不 少于5 min; 甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5:1;氯化钢的加入质量为唾液样品质量的5%; 所述的萃取用盐为无水硫酸儀;萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的40%; pH调节剂为液体酸，液体酸为盐酸和硫酸(体积比为1:1);液体酸的加入体积是唾液样 品体积的0.01%; 步骤(3)，甲醋化:将步骤(2)得到的第一萃取液中加入促甲醋化反应试剂后在50°C下 的微波萃取罐进行甲醋化反应，反应时间为Imin，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂 进行萃取，萃取次数为1次，取萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃 取液； 所述的促甲醋化反应试剂为盐酸，加入体积为步骤(2)得到的第一萃取液体积的5%;所 述的饱和食盐水的体积是步骤(2)得到的第一萃取液体积的50%; 所述的萃取溶剂为二氯甲烧;每次萃取萃取溶剂的体积是步骤(2)得到的第一萃取液 体积的25%; 所述的干燥剂为无水硫酸儀;干燥剂的质量是步骤(2)中萃取溶剂质量的5%; 步骤(4)，测定:将步骤(3)得到的第二萃取液，在30°C下浓缩至近干后，用正己烧复溶， 正己烧的用量为ImL,过0.22 WIi微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定 量，根据标准曲线计算目标物含量。
[0036] 步骤(4)中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下： 色谱柱为长度X内径X膜厚为60 mX0.32 mm X 0.25皿，DB-5MS石英毛细管柱或相 当者;载气氮气，纯度>99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min;进样口溫度:230°C ;不分流 进样;进样量：1化;程序升溫:初始溫度120°C，保持2 min,然后WlOtVmin升溫到160°C， 再W20 °C/min 升溫到200°C，保持20 min; 质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口溫度为250°C，离子源溫度为220 °C，电离能量为70 eV，溶剂延迟:3.0 min,选择离子监测模式。
[0037] 步骤(4)中标准曲线绘制方法如下:配制有机酸和脂肪酸对应甲醋化产物的系列 标准溶液，浓度为:0.1 mg/L、0.5 mg/L、l mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液 进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，W各物质浓度为横 坐标，作各测定物质的标准曲线。
[0038] 所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酷丙酸、苹果酸和巧樣酸;所述的脂肪酸为 栋桐酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
[0039] 实施例4 实施例4与实施例3的区别在于： pH调节剂为液体酸，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸(体积比为1:1:1:1)，液体酸的加 入体积是唾液样品体积的1 %; 甲醋化反应时间为10 min。
[0040] 实施例5 实施例5与实施例3的区别在于： pH调节剂为液体酸，液体酸为乙酸，液体酸的加入体积是唾液样品体积的0.5%; 甲醋化反应时间为5 min。
[0041 ] 实施例6 实施例6与实施例3的区别在于： P的周节剂为缓冲盐，缓冲盐为巧樣酸钢，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10%; 实施例7 实施例7与实施例3的区别在于： pH调节剂为缓冲盐，缓冲盐为巧樣酸氨二钢，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的 25%； 实施例8 实施例6与实施例3的区别在于： P的周节剂为缓冲盐，缓冲盐为巧樣酸钢和巧樣酸氨二钢(质量比为1:1);缓冲盐的加入 质量是唾液样品质量的15%; 实施例9 一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括W下步骤： 步骤(1)，样品采集:将2.0 g脱脂棉置于口腔内，放置5 min后，取出吸收了唾液的脱脂 棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离屯、管中，经高速离屯、后， 收集上清液得到唾液样品；唾液离屯、转速不低于10000 rpm，离屯、时间不少于10 min; 步骤(2)，盐析萃取:移取10 mL唾液样品于离屯、管中，加入甲醇、氯化钢、萃取用盐和抑 调节剂，经满旋振荡至混合均匀后离屯、，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液;其中，满 旋振荡转速为120000巧m，满旋振荡时间为10 min,离屯、转速不低于10000巧m，离屯、时间 不少于5 min; 甲醇加入量与唾液样品的体积比为2:1;氯化钢的加入质量为唾液样品质量的20%; 所述的萃取用盐为无水硫酸钢;萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的70%; pH调节剂为液体酸液体酸为盐酸;液体酸的加入体积是唾液样品体积的1%; 步骤(3)，甲醋化:将步骤(2)得到的第一萃取液中加入促甲醋化反应试剂后在80°C下 的密闭的锥形瓶中进行甲醋化反应，反应2min，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进 行萃取，萃取次数为2次，合并萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃 取液； 所述的促甲醋化反应试剂为氨氧化钟，加入体积为步骤(2)得到的第一萃取液体积的 40%;所述的饱和食盐水的体积是步骤(2)得到的第一萃取液体积的200%; 所述的萃取溶剂为=氯甲烧;每次萃取萃取溶剂的体积是步骤(2)得到的第一萃取液 体积的100%; 所述的干燥剂为无水硫酸钢;干燥剂的质量是步骤(2)中萃取溶剂质量的25%; 步骤(4)，测定:将步骤(3)得到的第二萃取液，在45°C下浓缩至近干后，用正己烧复溶， 正己烧的用量为1 mL，过0.22皿微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定 量，根据标准曲线计算目标物含量。
[0042] 步骤(4)中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下： 色谱柱为长度X内径X膜厚为60 mX0.32 mm X 0.25皿，DB-5MS石英毛细管柱或相 当者;载气氮气，纯度>99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min;进样口溫度:230°C ;不分流 进样;进样量：1化;程序升溫:初始溫度120°C，保持2 min,然后WlOtVmin升溫到160°C， 再W20 °C/min 升溫到200°C，保持20 min; 质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口溫度为250°C，离子源溫度为220 °C，电离能量为70 eV，溶剂延迟:3.0 min,选择离子监测模式。
[0043] 步骤(4)中标准曲线绘制方法如下:配制有机酸和脂肪酸对应甲醋化产物的系列 标准溶液，浓度为:0.1 mg/L、0.5 mg/L、l mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液 进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，W各物质浓度为横 坐标，作各测定物质的标准曲线。
[0044] 所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酷丙酸、苹果酸和巧樣酸;所述的脂肪酸为 栋桐酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
[0045] 实施例10 一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，包括W下步骤： 步骤（1)，样品采集:将1 g脱脂棉置于口腔内，放置3 min后，取出吸收了唾液的脱脂 棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离屯、管中，经高速离屯、后， 收集上清液得到唾液样品；唾液离屯、转速不低于10000 rpm，离屯、时间不少于10 min; 步骤(2)，盐析萃取:移取6 mL唾液样品于离屯、管中，加入甲醇、氯化钢、萃取用盐和抑 调节剂，经满旋振荡至混合均匀后离屯、，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液;其中，满 旋振荡转速为10000巧m，满旋振荡时间为4 min,离屯、转速不低于10000巧m，离屯、时间不 少于5 min; 甲醇加入量与唾液样品的体积比为I: I;氯化钢的加入质量为唾液样品质量的12%; 所述的萃取用盐为无水硫酸儀和无水硫酸钢(质量比为1:1);萃取用盐的加入质量为 唾液样品质量的60%; P的周节剂为缓冲盐，缓冲盐为巧樣酸钢和巧樣酸氨二钢的组合(质量比为1:4);缓冲盐 的加入质量是唾液样品质量的20%; 步骤(3)，甲醋化:将步骤(2)得到的第一萃取液中加入促甲醋化反应试剂后在70°C下 的锥形瓶中进行甲醋化反应，反应30min，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃 取，萃取次数为2次，合并萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取 液； 所述的促甲醋化反应试剂为=氣化棚，加入体积为步骤(2)得到的第一萃取液体积的 40%;所述的饱和食盐水的体积是步骤(2)得到的第一萃取液体积的200%; 所述的萃取溶剂为环己烧;每次萃取萃取溶剂的体积是步骤(2)得到的第一萃取液体 积的60%; 所述的干燥剂为无水硫酸钢;干燥剂的质量是步骤(2)中萃取溶剂质量的18%; 步骤(4)，测定:将步骤(3)得到的第二萃取液，在35°C下浓缩至近干后，用正己烧复溶， 正己烧的用量为3mL，过0.22 WIi微孔滤膜，滤液采用气相色谱-质谱联用法分析，外标法定 量，根据标准曲线计算目标物含量。
[0046] 步骤(4)中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下： 色谱柱为长度X内径X膜厚为60 mX0.32 mm X 0.25皿，DB-5MS石英毛细管柱或相 当者;载气氮气，纯度>99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min;进样口溫度:230°C ;不分流 进样;进样量：1化;程序升溫:初始溫度120°C，保持2 min,然后WlOtVmin升溫到160°C， 再W20 °C/min 升溫到200°C，保持20 min; 质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口溫度为250°C，离子源溫度为220 °C，电离能量为70 eV，溶剂延迟:3.0 min,选择离子监测模式。
[0047] 步骤(4)中标准曲线绘制方法如下:配制有机酸和脂肪酸对应甲醋化产物的系列 标准溶液，浓度为:0.1 mg/L、0.5 mg/L、l mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液 进行气相色谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，W各物质浓度为横 坐标，作各测定物质的标准曲线。
[0048] 所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酷丙酸、苹果酸和巧樣酸;所述的脂肪酸为 栋桐酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
[0049] 实施例11 实施例11与实施例10的区别在于： 甲醋化反应的反应时间为18 min. W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员 应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，运些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效 物界定。
【主权项】
1. 一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤（1)，样品采集:将脱脂棉置于口腔内，放置0.2-5 min后，取出吸收了唾液的脱脂 棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后， 收集上清液得到唾液样品； 步骤(2)，盐析萃取:移取唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节 剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液； 甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5-2:1;氯化钠的加入质量为唾液样品质量的5- 20%； 所述的萃取用盐为无水硫酸镁和无水硫酸钠中的一种或两种的组合物;萃取用盐的加 入质量为唾液样品质量的40-70%; PH调节剂为液体酸或缓冲盐，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸中的一种或几种的组 合，缓冲盐为柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠中的一种或两种的组合;液体酸的加入体积是唾液 样品体积的0.01-1%，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10-25%; 步骤(3)，甲酯化:将步骤(2)得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在50-80°C 下的密闭条件进行甲酯化反应，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，取萃取 液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液； 所述的促甲酯化反应试剂为硫酸、盐酸、氢氧化钾或三氟化硼，加入体积为步骤(2)得 到的第一萃取液体积的5-40%;所述的饱和食盐水的体积是步骤(2)得到的第一萃取液体积 的50-200%; 所述的萃取溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷或环己烷;每次萃取萃取溶剂的体积是 步骤(2)得到的第一萃取液体积的25-100%; 所述的干燥剂为无水硫酸镁或无水硫酸钠;干燥剂的质量是步骤(2)中萃取溶剂质量 的5-25%; 步骤(4)，测定:将步骤(3)得到的第二萃取液，在30-45Γ下浓缩至近干后，用正己烷复 溶，正己烧的用量为步骤(2)移取唾液样品体积的10-200%。2. 根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(1)中的脱脂棉的质量为0.2-2.0 g。3. 根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(1)中唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10 min。4. 根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(2)中唾液移取量为0.5-10 mL，涡旋振荡转速为100-20000 rpm，涡旋振荡时间为0.5-10 min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min。5. 根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:所 述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入微波萃取罐中并密闭，放 入微波萃取系统中在50_80°C条件下进行甲酯化反应，反应时间为1-10 min; 或者所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入密闭的锥形 瓶中，在加热50-80°C条件下进行甲酯化反应，反应时间为2-30 min。6. 根据权利要求4所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(3)中萃取次数为1-2次。7. 根据权利要求6所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(4)中收集到的萃取液在35°C水浴中减压蒸发浓缩至近干，用正己烷1.0-5.0 mL复溶，过 0.22 μπι滤膜后进样分析。8. 根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(4)中所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下： 色谱柱为长度X内径X膜厚为60 mX0.32 mm X 0.25 ym，DB-5MS石英毛细管柱或相 当者;载气氦气，纯度彡99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min;进样口温度:230°C ;不分流 进样;进样量：1 yL;程序升温:初始温度120°C，保持2 min，然后以10°C/min升温到160°C， 再以20 °C/min升温到200°C，保持20 min; 质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口温度为250°C，离子源温度为220 °C，电离能量为70 eV，溶剂延迟:3.0 min，选择离子监测模式。9. 根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在于:步 骤(4)中标准曲线绘制方法如下:配制有机酸和脂肪酸对应甲酯化产物的系列标准溶液，浓 度为:0.1 mg/L、0.5 mg/L、l mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，对系列标准溶液进行气相色 谱-质谱联用仪分析，根据各物质定量离子峰面积为纵坐标，以各物质浓度为横坐标，作各 测定物质的标准曲线。10. 根据权利要求1或9所述的分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法，其特征在 于:所述的有机酸为乳酸、草酸、丙二酸、乙酰丙酸、苹果酸和柠檬酸;所述的脂肪酸为棕榈 酸、亚油酸、油酸、亚麻酸和硬脂酸。
【文档编号】G01N30/88GK105954454SQ201610553675
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】司晓喜, 张凤梅, 朱瑞芝, 刘志华, 杨光宇, 苏美玲, 何沛, 刘春波, 申钦鹏, 王昆淼, 苏钟璧
【申请人】云南中烟工业有限责任公司