单组份tmb显色液及其配制方法
【专利摘要】本发明涉及一种单组份TMB显色液及其配制方法。该单组份TMB显色液包括以下组分：TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、糖类化合物或其衍生物、缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0?7.0；所述缓冲液选自柠檬酸?柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸?EDTA缓冲液、柠檬酸?乙酸钠缓冲液或柠檬酸?磷酸氢二钠缓缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。所述单组份TMB显色液能够用于Western、IHC或原位杂交等实验，灵敏度高、稳定性好、保存时间长。
【专利说明】
单组份TMB显色液及其配制方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物体外诊断试剂技术领域，特别是涉及一种单组分TMB显色液及其制备方法。【背景技术】
[0002]在分子生物学与病理领域中，进行Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等试验时， 传统的方法一般使用DAB(3,3’_二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物，在显色反应中产生棕色沉淀。DAB具有一定的致癌性，而且DAB作为HRP的底物，配成溶液后稳定性差，灵敏度也比较低。11?(3,3〃，5,5〃-四甲基联苯胺)是一种无致癌特性的试剂，也是 HRP的显色底物之一，具有高灵敏度的特性，因此被广泛用于ELISA反应(酶联免疫反应)。
[0003]现有市售的酶联免疫试剂盒所采用的TMB显色液大多为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，因此存在以下缺点:使用不够方便、提高了包装材料的成本、浪费资源，且使用中的混合过程容易造成批间质量不均一。市售的酶联免疫试剂盒也有采用单组份的 TMB显色液，但是现有的单组份TMB显色液存在稳定性差、保存时间短、显色背景高、灵敏度低等问题。而且，TMB与HRP作用后只产生蓝色溶液而不能产生沉淀，因此，传统的TMB显色液只能用于ELISA反应，而不能用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验。
【发明内容】
[0004]基于此，本发明提供了一种单组份TMB显色液，该显色液可用于Western、免疫组化 (IHC)或原位杂交等实验。
[0005]具体技术方案如下:
[0006]一种单组份TMB显色液，包括以下组分:0.l-2mg/mL TMB、体积分数为0.1-3%的二甲基亚砜、体积分数为1-10 %的甘油、0.01 -0.5mg/ml氧化剂、0.5-1 Omg/mL糖类化合物或其衍生物、0.1 -2.5mo 1 /L缓冲液；
[0007]所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-7.0;所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-EDTA缓冲液、柠檬酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
[0008]所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。
[0009]在其中一些实施例中，所述糖类化合物或其衍生物选自葡聚糖或其衍生物。
[0010]在其中一些实施例中，所述葡聚糖或其衍生物选自DEAE葡聚糖盐酸盐或右旋糖酐。
[0011]在其中一些实施例中，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
[0012]在其中一些实施例中，所述氧化剂选自过氧化氢、过氧化脲和过硼酸钠中的至少一种。
[0013]在其中一些实施例中，所述氧化剂选自过氧化脲。
[0014]在其中一些实施例中，所述单组份TMB显色液包括以下组分:0.3-0.5mg/mL TMB、体积分数为0.4-0.6 %的二甲基亚砜、体积分数为8-10 %的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化剂、 2.5-3.5mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.2-0.3mol/L缓冲液;所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-5.0。[〇〇15] 本发明还提供了上述单组份TMB显色液的配制方法。[〇〇16]具体技术方案如下:[〇〇17] 上述单组份TMB显色液的配制方法，包括以下步骤:
[0018]配制缓冲液，用酸调节pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A;
[0019]将TMB溶解于二甲基亚砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B;
[0020]在所述混合溶液B中加入糖类化合物或其衍生物以及氧化剂，充分混匀，即得所述单组份TMB显色液。
[0021]在其中一些实施例中，用于调节pH值的酸为浓盐酸。[〇〇22]本发明的单组份TMB显色液具有以下有优点和有益效果:[〇〇23]本发明的单组份TMB显色液，通过在显色体系中加入糖类化合物或其衍生物作为着附剂，使TMB与HRP显色反应的反应产物能够固定于反应膜或者细胞原位上，形成与DAB— 致的显色斑点，因此能够用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验，解决了传统的 TMB显色液不能用于Western、IHC或原位杂交实验的问题。[〇〇24]本发明的单组份TMB显色液，通过糖类化合物或其衍生物与其它各组分(TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、缓冲液)以特定浓度互配，可以实现以混合的单一液体存在，无需分成A液、B液，该单组份TMB显色液可直接使用，操作更为便利，也可降低包装成本，减少了 A 液、B液在混匀过程中的实验误差和批间质量不均一的问题。[〇〇25]本发明的单组份TMB显色液，通过糖类化合物或其衍生物与其它各组分(TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、缓冲液)以特定浓度互配，使其灵敏度高、稳定性好、保存时间长、灵敏度与稳定性均比DAB显色液强，同时解决了现有的单组份TMB显色液的稳定性问题。【附图说明】[〇〇26]图1为单组分TMB显色液与DAB显色液的灵敏度比较结果示意图；[〇〇27]图2为经过不同保存条件保存后的单组分TMB显色液的灵敏度比较结果示意图； [〇〇28] 图3为本发明的单组份TMB显色液与传统单组份TMB显色液的显色效果比较示意图。【具体实施方式】[〇〇29]以下结合具体实施例对本发明的单组份TMB显色液和配制方法作进一步详细的说明。
[0030]以下实施例中所用试剂如无特殊说明均为市售普通试剂。
[0031]实施例1
[0032]本实施例的单组份TMB显色液由以下方法配制得到:[〇〇33] 称取25g柠檬酸(0 ? 13mol)与29g二水柠檬酸三钠(0 ? 099mol)，溶于800ml去离子水中，用浓盐酸调pH至4.0,加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。[〇〇34] 称取350mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A中，得到新的混合液B。[〇〇35]向上述混合液B中加入3g DEAE葡聚糖盐酸盐与350mg过氧化脲，充分混匀，即得所述单组分TMB显色液，避光4°C保存。
[0036] 实施例2[〇〇37]本实施例的单组份TMB显色液由以下方法配制得到:[0〇38] 称取120g梓檬酸(0.62mol)与150g乙酸钠(1.83mol)，溶于800ml去离子水中，用浓盐酸调pH至6.0，加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。[〇〇39] 称取300mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A 中，得到新的混合液B。
[0040]向上述混合液B中加入3.5g右旋糖酐与350mg过氧化脲，充分混匀，即得所述单组分TMB显色液，避光4°C保存。[〇〇41 ] 实施例3TMB显色液与DAB显色液的灵敏度比较[〇〇42]用abeam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取lul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于上述实施例1所配置的单组分TMB显色液与DAB 显色液(广州捷倍斯生物科技有限公司的产品，货号G3433)中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。显色结果如图1所示，A为TMB显色液，B为DAB显色液。[〇〇43] 从图1可以看出，本发明的单组分TMB显色液对1:4500稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗能够检出，而DAB显色液对1:2000稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗也无法检测，表明本发明的单组分TMB显色液具有比DAB显色液更高的灵敏度。[〇〇44] 实施例4TMB显色液的稳定性[〇〇45]用abeam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取lul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于经过不同保存条件保存后的单组分TMB显色液中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。其中单组分TMB显色液按照上述实施例1的方法配制。结果如图2所示，C为新鲜配制的单组分TMB显色液;D为室温避光保存1年的单组分TMB 显色、液。[〇〇46]从图2中可以看出，室温避光保存一年的单组分TMB显色液(C)与新鲜配制的单组分TMB显色液(D)对HRP标记羊抗鼠二抗的检测灵敏度无明显差异，表明本发明的单组分TMB 显色液稳定性优越。[〇〇47] 实例5本发明的单组份TMB显色液与传统单组份TMB显色液的比较 [〇〇48]用abeam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取lul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于上述实施例1所配置的单分TMB显色液与传统单组份TMB显色液(广州捷倍斯生物科技有限公司的产品，货号G4308)中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。显色结果如图3所示，G为实施例1所配置的TMB显色液，H为传统单组份TMB显色液。[〇〇49] 从图3中可以看出，传统的TMB显色液，用水冲洗终止显色时，会把显色产物一并冲洗掉，而本发明的单组份TMB显色液能够将显色产物固定在膜上。
[0050]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0051]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种单组份TMB显色液，其特征在于，包括以下组分:0.l-2mg/mL TMB、体积分数为 0.1 -3%的二甲基亚砜、体积分数为1-10%的甘油、0.01-0.5mg/ml氧化剂、0.5-1 Omg/mL糖 类化合物或其衍生物、〇.1-2.5mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-7.0;所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠 檬酸-EDTA缓冲液、柠檬酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍 生物中的至少一种。2.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述糖类化合物或其衍生物 选自葡聚糖或其衍生物。3.根据权利要求2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述葡聚糖或其衍生物选自 DEAE葡聚糖盐酸盐或右旋糖酐。4.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬 酸钠缓冲液。5.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化氢、过 氧化脲和过硼酸钠中的至少一种。6.根据权利要求5所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化脲。7.根据权利要求1-6任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，包括以下组分:0.3_ 0.5mg/mL TMB、体积分数为0.4-0.6 %的二甲基亚砜、体积分数为8-10 %的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化剂、2.5-3.5mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.2-0.3mo 1/L缓冲液;所述单组份 TMB显色液的pH值为3.0-5.0。8.权利要求1-7任一项所述的单组份TMB显色液的配制方法，其特征在于，包括以下步 骤:配制缓冲液，用酸调节pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A;将TMB溶解于二甲基亚砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B;在所述混合溶液B中加入糖类化合物或其衍生物以及氧化剂，充分混匀，即得所述单组 份TMB显色液。9.根据权利要求8所述的单组份TMB显色液的配制方法，其特征在于，用于调节pH值的 酸为浓盐酸。
【文档编号】G01N33/531GK105974107SQ201610557182
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】卢秀劲, 王小芳
【申请人】广州捷倍斯生物科技有限公司