一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒，选用特定重组抗原用于包被和标记，对封闭工艺进行了优化，提高了试剂盒的特异性，对标记用生物素种类及标记工艺做了系统性的优化使得试剂盒的灵敏度进一步提升，不但灵敏度高、特异性好，同时相较进口发光试剂，检测成本大大降低。
【专利说明】
一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及病毒蛋白免疫分析技术领域，尤其涉及一种丙型肝炎病毒抗体时间分 辨检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的传染病，可通过血液、吸毒、母婴 及性传播等。有研究表明，20 %~50 %的HCV感染者会发生自发性病毒清除，但是仍然有 50 %~80 %的感染者会持续感染，其中85 %进展为慢性肝炎，10~30年后，部分慢性丙肝患 者（尤其年龄较长患者）发展为肝硬化，2~10年后，可能发展为肝细胞癌。由于与慢性乙 肝相比，丙肝更隐蔽，潜伏期为2~26周;症状更不明显，高达75%的感染者无任何症状，因 此很容易被忽视，在中国，丙肝漏报率高达52%。目前为止，尚未研制成功可以预防丙肝的 疫苗，因此防治丙肝只有早诊断、早治疗，防治病情的进一步恶化，否则将会使自身病情加 重、影响身体健康，甚至可能将病毒传染给其他人。因此有必要开发出一种性能较好的诊断 方法，能有效地在早期就将该疾病诊断出来，及时治疗，减少因丙肝带来的健康和财产的损 失。
[0003] 近年来临床上应用较多的丙型肝炎病毒抗体检测方法主要有酶联免疫分析法 (Enzyme Immunoassay，EIA)、化学发光免疫分析法（Chemi lumineseent Immunoassay， CLIA)〇
[0004] EIA的优点在于其无污染、操作简单、试剂有效期长、特异性好等，但由于其敏感性 相对较低，测定范围相对较窄等缺点。酶免试剂盒与化学发光的丙肝抗体试剂盒大部分都 采用间接法，其特异性较差，出现假阳的概率较高，而双抗原夹心法可以提高试剂盒的特异 性，但灵敏度较间接法试剂盒要低，故开发一种灵敏度和特异性都较高的双抗原夹心法丙 型肝炎病毒抗体检测试剂盒显得尤为重要。
[0005] 间接法试剂盒第一步反应是检测样本中的抗体与包被在微孔板上的抗原只有一 次特异性的结合，第二步是羊抗人或鼠抗人抗体与人抗-HCV抗体的结合，第二步的结合较 第一步结合特异性较差，故导致间接法试剂盒出现假阳结果的概率较高;双抗原夹心法试 剂盒大部分采用的重组抗原的片段较短，用于标记的重组抗原标记上酶后抗原活性大大下 降，导致试剂盒灵敏度进一步降低。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种灵敏度高、特异性好的利用双抗 原夹心法进行丙型肝炎病毒抗体检测的时间分辨免疫荧光试剂盒，能够具备和进口发光试 剂相似的检测灵敏度与特异性，但检测成本远远低于使用进口发光试剂。
[0007] 为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术方案为： 一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒，包括包被反应板，还包括生物素标记HCV 重组抗原Π 与III、镧系元素离子标记的抗生物素抗体;所述包被反应板为吸附有HCV重组 抗原I的微孔板。
[0008] 为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括： 进一步地，上述HCV重组抗原I包含HCV病毒Core区与非结构区NS3+NS4+NS5抗原以最大 程度地捕获样本中Core区与非结构区抗原的抗体、HCV重组抗原II包含HCV Core区与非结 构区NS3全长片段，和HCV重组抗原III均包括HCV病毒结构区核心抗原和非结构区NS3抗原 的部分优势表位片段，标记抗原采用HCV重组抗原II与HCV重组抗原III提高了试剂盒对NS3 抗体检测的灵敏度，使得试剂盒的灵敏度接近美国Ortho公司试剂灵敏度。
[0009] 进一步地，本发明的试剂盒还包括生物素标记HCV重组抗原稀释液、镧系元素离子 标记的抗生物素抗体稀释液、抗HCV-阳性对照和抗HCV-阴性对照;更进一步地，本发明的试 剂盒还包括缓冲液、洗涤液、荧光增强液。
[0010] 优选地，上述镧系元素离子为EU3+、Tb3+、Sm3+、Dy 3+中的至少一种;更优选地上述镧 系元素离子为Eu3+。
[0011] 优选地，上述荧光增强液含有β_二酮类化合物或芳香胺类化合物。
[0012] 另一方面，本发明还提供一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤： a. HCV抗原包被板的获得:将HCV重组抗原使用缓冲液稀释至l-3yg/mL后加入微孔反 应板内，以l〇〇yL/孔包被过夜，然后经洗涤、封闭、干燥，将微孔板条真空密封于铝箱袋内， 冷减备用； b. 生物素标记HCV重组抗原II的获得:将HCV重组抗原II经磷酸盐缓冲液透析后，按生 物素与HCV重组抗原II质量比为1:3进行标记，标记后混匀10min，静置2小时;将标记后的抗 原置于缓冲液中透析46-50小时进行纯化，获得生物素标记HCV重组抗原II;将HCV重组抗原 III经磷酸盐缓冲液透析后，按生物素与HCV重组抗原III质量比为1:5进行标记，标记后混 匀10min，静置2小时;将标记后的抗原置于缓冲液中透析46-50小时进行纯化，获得生物素 标记HCV重组抗原III，将生物素标记HCV重组抗原II、生物素标记HCV重组抗原III混合后得 生物素标记HCV重组抗原，标记后的重组抗原需用0.05%疏基甘油于37°C处理2小时； c. 镧系元素离子标记的抗生物素抗体的获得:将抗生物素抗体经缓冲液透析后，镧系 元素离子与抗生物素抗体以质量比1:3比例进行标记，标记后混匀，室温反应48小时；将标 记好的抗生物素抗体用层析柱进行分离纯化，并用洗脱液进行洗脱回收，以获得镧系元素 离子标记的抗生物素抗体； d. 荧光增强液的配制：以无水乙醇溶解β_ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入邻苯二甲酸氢钾和三蒸 水，40°(：溶解后，加入乙酸、1^切11乂-100，调?!1至3.2，定容后保存备用； e. 组装各个组分，获得丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒。
[0013] 优选地，还包括制备抗HCV-阳性对照的步骤:将抗-HCV血清用阴性对照稀释后配 制成阳性对照，要求荧光值约30W~50W，已获得抗HCV-阳性对照。
[0014] 优选地，上述镧系元素离子为Eu3+。
[0015] 本试剂盒利用固相时间分辨免疫荧光法(TRIFMA)，基于双抗原夹心的非竞争性免 疫分析。从国内多家诊断试剂原料供应商中筛选出抗原片段较长的2-3种灵敏度高、特异性 好的重组抗原分别用于包被与标记。所用包被抗原和标记抗原为基因重组抗原(包括HCV病 毒结构区核心抗原和非结构区抗原）。对于标记抗原标记后抗原活性降低的问题，本发明采 用标记长臂生物素进行标记并对标记工艺进行优化以降低对标记抗原活性的影响。
[0016] 本发明的时间盒反应原理为:样本中的抗-HCV抗体(包括I gG、I gM等型）与生物素 标记的HCV重组抗原II/III及固相HCV重组抗原I通过免疫反应，形成"固相HCV重组抗原I 一 抗HCV-生物素标记HCV重组抗原II/III复合物"；振荡反应后洗涤，洗去游离的生物素抗 原；然后加入镧系元素离子标记的抗生物素抗体，形成"固相HCV重组抗原I 一抗HCV -生物 素标记HCV重组抗原II/III 一镧系元素离子标记的抗生物素抗体复合物"；振荡反应后洗 涤，洗去游离的镧系元素离子标记的抗生物素抗体。加入荧光增强液，增强液将复合物上的 Eu解离至溶液中，Eu与增强液中的组分形成荧光络合物，其荧光强度与血清中的抗HCV浓度 成正相关，从而获得检测结果。
[0017] 本发明的一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒，选用特定重组抗原用于包 被和标记，特定地使用两种标记抗原提高了试剂盒的灵敏度，并对标记用生物素种类及标 记工艺做了系统性的优化，同时改变传统的生物素-链霉亲和素放大系统为生物素-抗生物 素体系使得试剂盒的灵敏度进一步提升，不但灵敏度高、特异性好，同时相较进口发光试 剂，检测成本大大降低；同时相较进口发光试剂，检测成本大大降低。
【附图说明】
[0018] 图1为利用本发明的试剂盒进行HCV抗体检测的检测原理示意图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明提供了一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒，包括包被反应板，还 包括生物素标记HCV重组抗原II、III、镧系元素离子标记的抗生物素抗体;所述包被反应板 为吸附有HCV重组抗原I的微孔板。
[0020] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0021 ]实施例1丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒的制备 使用Eu3+作为荧光标记物制备试剂盒，具体操作如下： 1. HCV抗原包被板的获得： 将HCV基因重组抗原以合适的比例，使用碳酸盐缓冲液稀释至l-3yg/mL后加入微孔反 应板内，1〇〇此/孔，包被过夜后经洗涤、封闭、干燥等程序，将微孔板条真空密封于铝箱袋 内，冷减备用。
[0022] 2.生物素标记HCV抗原的获得:将HCV标记抗原II、HCV标记抗原III经磷酸盐缓冲 液透析后，按该比例(生物素与标记抗原1质量比为1:3;生物素与标记抗原2质量比为1:5 ) 分别单独进行标记，标记后混匀lOmin，静置约2小时。将标记后的抗原置于磷酸盐缓冲液中 透析48小时（± 2小时)进行纯化，获得生物标记HCV抗原。
[0023] 3.抗生物素抗体铕标记物的获得:将抗生物素抗体经碳酸盐缓冲液透析后，铕与 抗生物素抗体质量比为1:3比例进行标记，标记后混匀，室温反应48小时± 2小时。将标记好 的抗生物素抗体用层析柱进行分离纯化，并用洗脱液进行洗脱回收，以获得抗生物素抗体 铕标记物。
[0024] 4.荧光增强液的配制：以无水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入邻苯二甲酸氢钾和三 蒸水，40 °C溶解后，加入乙酸、Triton Χ-100，调ΡΗ至3 · 2，定容。
[0025] 5.抗HCV-阳性对照的获得:将抗-HCV血清用阴性对照稀释后配制成阳性对照，要 求荧光值约30W~50W，已获得抗HCV-阳性对照。
[0026] 上述组分制备完毕后，加入缓冲液、洗涤液等其他试剂盒组分，制备得到丙型肝炎 病毒抗体时间分辨免疫荧光检测试剂盒。
[0027]实施例2本发明的试剂盒与进口发光试剂盒的比较实验 利用本发明的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（时间分辨免疫荧光法）与德国Roche Diagnostics GmbH公司的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（电化学发光法)Anti-HCV II同时 检测1073例血清样本，包括HCV阳性血清样本422例，HCV阴性血清样本651例(含60例干扰样 本，干扰因素有CMV / Rubella / ANA / HBsAg / RF / HSV / TP / HCG)。另外检测了422 例阳性血清样本中111例对应的同源血浆样本、651例阴性血清样本中115例对应的同源血 浆样本，BBI/Zepto血清转换盘样本12例。若样本初测结果不一致，则用两种检测试剂盒再 检测一遍 检测结果显示:有18例样本的检测结果不一致。以电化学发光法的检测结果为参考，则 时间分辨免疫荧光法的灵敏度达到95.7%，特异性达到100%，符合率达到98.3%(表1)。
[0028]特异性的比较 对上述18份初测结果不一致的样本用确认试剂盒(丙型肝炎病毒(HCV)抗体检测试剂 盒(免疫印迹法)）进行检测，结果显示其中16份样本为阴性，2份为阳性，证明本发明的丙型 肝炎病毒抗体检测试剂盒(时间分辨免疫荧光法)在特异性方面优于现行电化学发光法试 剂盒。
[0029]灵敏度的比较 同时用两种试剂盒检测12份BBI/Zepto血清转换盘，根据检出数比较两种检测方法的 灵敏度。
[0030] 12份BBI/Zepto血清转换盘中，血清盘编号分别为PHV922-03和PHV922-04的样本 电化学发光试剂未能检出。使用确认试剂盒(丙型肝炎病毒(HCV)抗体检测试剂盒(免疫印 迹法)）进行复检，结果均为阳性，证明本发明的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒(时间分辨免 疫荧光法)在灵敏度方面优于现行电化学发光法试剂盒。
[0031] 通过上述实施例可以知晓，本发明的一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光检 测试剂盒，选用特定重组抗原用于包被和标记，对封闭工艺进行了优化提高了试剂盒的特 异性，对标记用生物素种类及标记工艺做了系统性的优化使得试剂盒的灵敏度进一步提 升，不但灵敏度高、特异性好，同时相较进□发光试剂，检测成本大大降低。
[0032] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒，包括包被反应板，其特征在于，还包括 生物素标记HCV重组抗原II与III、镧系元素离子标记的抗生物素抗体;所述包被反应板为 吸附有HCV重组抗原I的微孔板。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HCV重组抗原I和HCV重组抗原II、 III均包括HCV病毒结构区核心抗原和非结构区抗原。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括生物素标记HCV重组抗原稀释液、 镧系元素离子标记的抗生物素抗体稀释液、抗HCV-阳性对照和抗HCV-阴性对照。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、洗涤液、荧光增强液。5. 根据权利要求1-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu3+、 Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一种。6. 根据权利要求1-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu3+。7. 根据权利要求1-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光增强液含有β-二 酮类化合物或芳香胺类化合物。8. -种制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1 :HCV抗原包被板的获得 将HCV重组抗原使用缓冲液稀释至l-3yg/mL后加入微孔反应板内，以lOOyL/孔包被过 夜，然后经洗涤、封闭、干燥，将微孔板条真空密封于铝箱袋内，冷藏备用； 步骤2:生物素标记HCV重组抗原II、III的获得 将HCV重组抗原II经磷酸盐缓冲液透析后，按生物素与HCV重组抗原II、III分别进行标 记，标记后混匀lOmin，静置2小时;将标记后的抗原置于缓冲液中透析进行纯化，获得生物 素标记HCV重组抗原II; 步骤3:镧系元素离子标记的抗生物素抗体的获得 将抗生物素抗体经缓冲液透析后，镧系元素离子与抗生物素抗体以质量比1:3比例进 行标记，标记后混匀，室温反应48小时；将标记好的抗生物素抗体用层析柱进行分离纯化， 并用洗脱液进行洗脱回收，以获得镧系元素离子标记的抗生物素抗体； 步骤4:荧光增强液的配制 以无水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0，再加入邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，40 °C溶解后，加入乙酸 和Triton X-100，调节PH值至3 · 2，定容后保存备用； 步骤5:组装各个组分，获得丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu3+。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤2中生物素与HCV重组抗原II、 III分别按重量比为1:3和1:5进行标记;标记后的抗原置于缓冲液中透析46-50个小时。
【文档编号】G01N33/569GK105974115SQ201610531653
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】户元林, 张正元
【申请人】苏州新波生物技术有限公司