一种胃蛋白酶原Ⅰ或Ⅱ测定试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ测定试剂盒，包括测PG Ⅰ/Ⅱ磁微粒、测PG Ⅰ/Ⅱ示踪结合物和PG Ⅰ/Ⅱ校准品，测PG Ⅰ/Ⅱ磁微粒为标记有胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ单克隆抗体的磁性微球和磁微粒保存液；测PG Ⅰ/Ⅱ示踪结合物为标记有胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ抗体的示踪标记物和示踪结合物稀释液，所述示踪标记物为吖啶酯及其衍生物；PG Ⅰ/Ⅱ校准品包括胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。本发明在酶免疫分析基础上结合高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了灵敏度，使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。
【专利说明】
一种胃蛋白酶原I或Π 测定试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种用于测定胃蛋白酶原(PGI/Π)的磁 微粒化学发光免疫测定试剂盒，尤其涉及该试剂盒的制备及测定方法。
【背景技术】
[0002]胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是由胃黏膜分泌的胃蛋白酶的前身，属于门冬氨酸 蛋白酶家族，分子量为42kDa，按其免疫原性不同，可分为两个亚群，即胃蛋白酶原I和胃蛋 白酶原Π。正常情况下约1 %的PG进入血循环，进入的量十分稳定，当胃黏膜发生病理变化 时，血清PG含量也随之改变，因此血清PG反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜 不同部位的分泌功能，故而PG被称为胃黏膜的"血清学活检"。PGI主要由胃黏膜的主细胞和 黏液颈细胞分泌，其分泌的增多或减少均可作为胃黏膜病理的一项指标，故PGI检测在目前 胃病的诊断及早期筛查中是十分重要的工作，PGII由胃黏膜的主细胞和黏液颈细胞分泌， 也可由幽门腺和十二指肠腺产生，其分泌的增多可作为胃底粘膜病变的一项指标。
[0003] PGI/Π的传统检测方法包括胶体金法、放射免疫法、酶联免疫法和普通化学发光 法等，但胶体金法灵敏度偏低且每次只能实现单一人份的检测;放射免疫法的优点是灵敏、 特异、简便易行、用样量少等，但试剂的半衰期段费用较高，需要用闪烁计数仪等专门的设 备，放射性核素对人体存在着一定潜在的危害性，试验废物处理困难，放射性核素标记有时 会改变某些生物物质的生理活性;酶联免疫法和化学发光法检测时间长，主要依靠纯手工 加样等系列繁琐操作，效率低，导致实验结果易误差大，而酶促反应不够彻底，且易受外部 干扰因素影响，如温度、时间及材料浓度等，因此检测时特异性低、灵敏度差、检测范围窄。 因此，本领域亟需一种在保证灵敏度高、稳定性好的同时操作更加简便、迅速、无污染，能够 借助分析仪器实现检测过程全自动化的测定试剂盒。
[0004] 专利申请号：201110257438.4公开了一种胃蛋白酶原I (PGI)的定量测定试剂盒， 其特征在于，该试剂盒包含PGI磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，PGI校准品、PGI 质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。该发明还公开了该试剂盒的制备方法，其将化学发光 技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，该试剂盒具 有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟，并 达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。
[0005] 专利申请号：201110257440.1公开了一种胃蛋白酶原II (PGII)的定量测定试剂 盒，其特征在于，该试剂盒包含PGII磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，PGII校准 品、PGII质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液，其还公开了该试剂盒的制备方法。该试剂盒 将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比， 该试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产 品成本。
[0006] 专利申请号：201410441604.x公开了一种胃蛋白酶原II (PGII)定量测定试剂盒， 该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。该专利还公开了该试剂盒 的制备方法与使用该试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的方法，以异硫氰酸荧光素标记的胃 蛋白酶原Π (PGII)包被抗体和碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II (PGII)标记抗体制备抗试 剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分 离，而且大大提高了反应速度，以新型化学发光底物APLS为底物，提高了试剂盒的灵敏度和 特异性性能。该检测试剂盒性能可靠、灵敏度高、线性范围宽，可配合半自动、全自动仪器使 用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床辅助诊断的微粒子 化学发光法胃蛋白酶原(PGI/n)测定试剂盒及其制备方法。本发明在酶免疫分析基础上结 合高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，较其他方法有许多独特的优点，首 先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高 了灵敏度，其次由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定 性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。
[0008] 本发明的技术方案是：
[0009] 一种胃蛋白酶原Ι/Π测定试剂盒，包括测PGI/Π磁微粒、测PGI/Π示踪结合物和 PGI/ Π校准品，所述测PGI/ Π磁微粒为标记有胃蛋白酶原1/ Π单克隆抗体的磁性微球和磁 微粒保存液;测PGI/ Π示踪结合物为标记有胃蛋白酶原1/ Π抗体的示踪标记物和示踪结合 物稀释液;PGI/Π校准品包括胃蛋白酶原I/Π溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。
[0010] 本发明是利用磁微粒化学发光免疫分析技术定量测定人血清或血浆中胃蛋白酶 原(PGI/Π )的含量。在磁性微粒子上共价标记胃蛋白酶原(PGI/Π )抗体，加入待测样本，第 一步反应形成磁微粒标记抗体-抗原结合物，与第二步反应加入的示踪物标记的胃蛋白酶 原(PGI/ Π )抗体，形成磁微粒标记抗体-抗原-示踪物标记抗体复合物，充分洗涤后，加入激 发液，催化发光，相对发光强度(RLU)与人血清/浆中PGI/Π含量呈正相关，根据标准曲线即 可计算出样本中PGI/Π的含量。
[0011] 所述示踪标记物为吖啶酯及其衍生物。
[0012] 吖啶酯较其他化学发光标记物，具有信噪比高，干扰因素少，发光效率高、强度大， 易于蛋白交联，灵敏度尚等优点。
[0013] 所述磁性微球为Fe203或Fe304磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体。
[0014] 所述磁性微球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团 包括但不限于-OH，-C00H，-NH2，-CH0，-S03H。
[0015] 所述胃蛋白酶原I/Π抗体为一种或多种单克隆抗体和/或多克隆抗体。
[0016] 所述PGI/Π校准品还包括PGI/Π抗原和保护蛋白溶液，所述保护蛋白包含但不限 于新生牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白。
[0017] 保护蛋白可以提供良好稳定反应环境，使抗原/抗体保持天然构象，可以选择上述 稳定剂其中一种。
[0018] 所述PGI/ Π校准品中保护蛋白质量浓度为1 -30 %。
[0019] 校准品中蛋白浓度低，易失活，1-30%质量浓度的保护蛋白可以降低溶液的极性， 为蛋白提供可长期稳定保存的疏水环境。
[0020]所述磁微粒保存液和示踪结合物稀释液包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂和pH缓 冲剂。
[0021]所述pH缓冲剂包括TBS缓冲系统、HAC-NAC缓冲系统、PBS缓冲液系统、MES缓冲系 统、HEPES缓冲系统中的一种或几种，所述pH缓冲剂的缓冲能力为调节pH值6.0-8.5，所述pH 缓冲剂的浓度范围为〇. 〇 1 -〇. 2mo 1 /L。
[0022] 所述表面活性剂为吐温系列（包括吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40 (TWEEN-40)、吐温60 (TWEEN-60)、吐温61 (TWEEN-61)、吐温80 (TWEEN-80)、吐温81 (TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85))、TritonX-100、CTAC中的至少一种；
[0023]优选所述表面活性剂为质量浓度范围为0.1-1 %的吐温20。
[0024]蛋白结合物在反应中易发生非特异性吸附，0.1-1%的吐温20可削弱非特异性吸 附能力，当吐温20浓度高于1%后影响特异性吸附效果，降低反应灵敏度。
[0025] 所述防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠、抗生素类、proclin中的至少一种;所述硫柳汞的 浓度不大于1%〇;所述叠氮钠的浓度不大于1%〇;所述抗生素类包括庆大霉素等；所述 proclin的浓度不大于2%〇。
[0026] 表面活性剂能够在试剂加入到反应体系时，降低表面张力，提高分散性和稳定性。
[0027] 一种所述胃蛋白酶原PGI/Π测定试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
[0028] 1)测PGI/ Π磁微粒的制备，包括磁微粒保存液的配制和磁微粒标记PGI/ Π抗体的 制备；
[0029] 2)测PGI/ Π示踪结合物的制备，包括示踪物稀释液的配制和吖啶酯标记PGI/ Π抗 体的制备；
[0030] 3)PGI/n校准品的制备，包括校准品稀释液的配制和校准品的配制。
[0031 ]所述步骤1)中磁微粒保存液的配制包括如下步骤：
[0032] 1 · 1称取磷酸氢二钠2 · 68g，磷酸二氢钠0 · 39g，氯化钠8 · 5g于1L的容器中，加入适 量的纯化水搅拌使其完全溶解；
[0033] 1.2用移液器移取lmL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述 1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；
[0034] 1.3调节PH计测量溶液PH，使其控制在7.2-7.4之间；
[0035] 1.4称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；
[0036] 1.5定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2_8°C无菌环境下贮存。
[0037]所述步骤1)中磁微粒标记PGI/ Π抗体的制备包括如下步骤：
[0038] 1.6将带羧基的磁微粒与碳二亚胺(EDC)分别按质量比1:1-3的比例混合；
[0039] 1.7按每毫克磁微粒分别加入5-40yg抗体的比例加入PGI/Π单抗，磁微粒与抗体 质量比为100:1;
[0040] 1.8在混匀情况下20-28°C分别标记0.5-2小时；
[00411 1.9标记后采用终浓度25mM的甘氨酸封闭多余的位点，22-26 °C反应0.5小时，至少 洗涤三次，用磁微粒保存液进行保存；
[0042] 1.10采用方阵滴定法调试最佳浓度，用磁微粒保存液按照最佳浓度稀释磁微粒标 记PGI / Π得到测PGI / Π磁微粒，于2-8 °C贮存；
[0043] 所述步骤2)中示踪物稀释液的配制包括如下步骤：
[0044] 2.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适 量的纯化水搅拌，用移液器移取lmL Tween-20搅拌使其完全溶解；
[0045] 2.2用移液器移取11^?仰(：1111 300于1〇1^纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述 1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；
[0046] 2.3调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2-7.4之间；
[0047] 2.4称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；
[0048] 2.5定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2-8°C无菌环境下贮存；
[0049] 所述步骤2)中吖啶酯标记PGI/Π抗体的制备包括如下步骤：
[0050] 2.6分别取10111〇1?61/11单抗，按照每10111〇1抗体分别加入吖啶酯25-200111〇1标记 ；
[0051 ] 2.7加入戊二醛至戊二醛质量浓度为0.75-1.5 %，在20-28°C条件下反应0.5-2小 时；
[0052]戊二醛为双功能团试剂，通过氨基连接单抗与吖啶酯，吖啶酯一般采用此方法标 记。
[0053] 2.8用?!17.2-7.4的0.0謂？85透析，至少换液三次，透析后加入等体积甘油-20 1€ 存放；
[0054] 2.9采用方阵滴定法确定吖啶酯标记PGI/ Π抗体的最适工作浓度，用示踪结合物 稀释液进行稀释，混匀即得到测PGI/Π示踪结合物，置2-8°C存放。
[0055] 所述步骤3)中校准品稀释液的配制包括如下步骤：
[0056] 3.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适 量的纯化水搅拌，用移液器移取lmL Tween-20搅拌使其完全溶解；
[0057] 3.2用移液器移取11^?仰(：1丨11 300于1〇1^纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述 1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；
[0058] 3.3调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2-7.4之间；
[0059] 3.4称取牛血清白蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；
[0060] 3.5定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2_8°C无菌环境下贮存。
[0061] 所述步骤3)中校准品的配制包括如下步骤：
[0062] 3.6用校准品稀释液稀释?61纯品的工作浓度范围为0.5-500即/1^;
[0063] 3.7稀释PG Π纯品的工作浓度范围为0.1-lOOng/mL，配成PGI/ Π校准品1和PGI/ Π 校准品2，校准品测定值应在范围之内，PGI校准品1的浓度范围为47.832-60.83 3ng/mL，PGI 校准品2的浓度范围为：291.300-365.103ng/mL; PG Π校准品1的浓度范围为：8.788_ 11 · 018ng/mL，PG Π 校准品 2 的浓度范围为：53.289-67.494ng/mL。
[0064] 优选的，所述步骤2.7中加入戊二醛至戊二醛质量浓度为1.25 %，在22-26°C条件 下反应1小时。
[0065]本发明试剂盒的优点是采用了微粒子化学发光免疫分析技术，排除了人为和环境 的影响，提高了试剂精密度;用微粒子做固相载体，扩大了反应表面积，线性范围更宽;全自 动化，其操作更加简便易行，同时本发明的试剂盒能够与化学发光免疫分析仪尤其是系列 化学发光免疫分析仪(AutolumiS 500、AutolumiS 1000、AutolumiS 2000、AutolumiS 3000 全自动化学发光测定仪)配套使用，在样本测定过程中实现了全自动化，使得浓度的检测可 以简单、方便、快速、批量地进行，同时保证检测的系统误差较小。
【具体实施方式】
[0066] 实施例1
[0067] -、磁微粒保存液的配制步骤(以配制1L为例，配方见表1)
[0068] 1.称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量 的纯化水搅拌使其完全溶解；
[0069] 2.用移液器移取lmL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述 1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；
[0070] 3.调节PH计测量溶液PH，加HCL或NaOH调节PH，使其控制在7.2-7.4之间。
[0071] 4.称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；
[0072] 5.定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2_8°C无菌环境下贮存。
[0073]表1胃蛋白酶原(PGI/Π )磁微粒保存液配方
[0075]二、磁微粒标记PGI/Π抗体的制备
[0076] 1.先将带羧基的磁微粒与碳二亚胺(EDC)分别按质量比1:1、1: 2、1:3混合，最佳质 量比为1:2;
[0077] 2.再按每毫克磁微粒分别加入5以8、1(^8、2(^8、4(^8抗体的比例加入?61/11单抗， 磁微粒与抗体最佳质量比为100:1;
[0078] 3.在混匀情况下20°C、22 °C、24°C、26 °C、28°C分别标记0.5小时、1小时、2小时，最 佳标记温度为22-26Γ，最佳标记时间为1小时；
[0079] 4.标记后采用终浓度25mM的甘氨酸封闭多余的位点，22~26°C反应0.5小时，至少 洗涤三次，用磁微粒保存液进行保存；
[0080] 5.采用方阵滴定法调试最佳浓度，用磁微粒保存液按照最佳浓度稀释磁微粒标记 PGI / Π得到测PGI / Π磁微粒，于2~8 °C贮存；
[0081 ] 6.测PGI/ Π磁微粒放置37 °C加速破坏6天，稳定性良好。
[0082]实施例2:测PGI/Π示踪结合物的制备
[0083] 一、示踪物稀释液的配制步骤（以配制1L为例，配方见表2)
[0084] 1.称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量 的纯化水搅拌，用移液器移取lmL Tween-20搅拌使其完全溶解；
[0085] 2.用移液器移取lmL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述 1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；
[0086] 3.调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2-7.4之间；
[0087] 4.称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；
[0088] 5.定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2-8°C无菌环境下贮存。
[0089]表2胃蛋白酶原(PGI/Π )示踪物稀释液配方
[0091] 二、吖啶酯标记PGI/Π抗体的制备
[0092] 1 ·分别取lOmol PGI/ Π 单抗，按照每lOmol抗体分别加入25mol、50mol、lOOmol、 200mol的比例加入吖啶酯标记，抗体与吖啶酯的最佳标记比例为1:10;
[0093] 2 ·戊二醛使用浓度分别为0 · 75 %、1 · 0 %、1 · 25 %、1 · 5 %，分别在20°C、22°C、24°C、 26°C、28°C反应0.5小时、1小时、1.5小时、2小时，戊二醛的的最佳使用浓度为1.25 %，最佳 反应温度为22-26°C，最佳反应时间为1小时；
[0094] 3.用?!17.2-7.4的0.0謂？83透析，至少换液三次，透析后加入等体积甘油-201€ 存放；
[0095] 4.采用方阵滴定法确定吖啶酯标记PGI/ Π抗体的最适工作浓度，用示踪结合物稀 释液进行稀释，混匀即得到测PGI/Π示踪结合物，置2-8°C存放；
[0096] 5 .测PGI/ Π示踪结合物37 °C加速破坏6天，其活性保持90 %以上，说明稳定性良 好。
[0097] 实施例3:PGI/n校准品的制备
[0098] -、校准品稀释液的配制步骤（以配制1L为例，配方见表3)
[0099] 1.称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量 的纯化水搅拌，用移液器移取lmL Tween-20搅拌使其完全溶解；
[0?00] 2.用移液器移取lmL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述 1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；
[0101] 3.调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2-7.4之间；
[0102] 4.称取牛血清白蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；
[0103] 5.定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2-8°C无菌环境下贮存。
[0104] 表3胃蛋白酶原(PGI/Π )校准品稀释液配方
[0106] 二、PGI/Π校准品的配制
[0107] 用校准品稀释液稀释PGI纯品的工作浓度范围为0.5-500ng/mL，稀释PG Π纯品的 工作浓度范围为0.1 -100ng/mL，配成PGI / Π校准品1 (低值校准品）和PGI / Π校准品2 (高值 校准品），校准品测定值应在范围之内。PGI校准品1:47.832-60.833ng/mL，PGI校准品2 : 291.300-365.103ng/mL;PGII 校准品1:8.788-11.018ng/mL，PGn 校准品2 :53.289-67.494ng/mL〇
[0108] 本发明上述各种原材料的选择要求如下：
[0109]磁微粒的选择
[0110] 通过对磁微粒的外观，标记蛋白的比率，磁响应性，磁微粒吸附一致性等方面进行 分析，经过多次分析研究，将磁微粒混匀，在灯光下观察，易分散，无聚集，无异物;将蛋白采 用不同的方法进行标记，标记率应大于90 % ;将磁微粒置370-380特斯拉的磁铁上，观察磁 微粒的聚集速度，分散均匀的磁微粒在10秒钟内完全聚集;磁微粒吸附一致性CVS 10%。研 究结果表明直径为0.90-1. ΙΟμπι的磁微粒，含有羧基基团，标记率最高，可用于本发明诊断 试剂盒的制备。
[0111] 吖啶酯的选择
[0112] 将吖啶酯用DMS0(二甲基亚砜)进行溶解，用纯化水进行稀释至1.0ng/mL的量，加 入10yL吖啶酯液体，各加入200yL激发液，测定其发光值，发光值应多1000000，经过研究，采 用美凯特生物提供的吖啶酯作为发光的原料。
[0113] 磁微粒标记用胃蛋白酶原(PGI/Π )抗体的选择
[0114] 首先就抗体的外观、浓度、纯度、效价进行验证，结果抗体为微带乳光的澄清液体， 无肉眼可见异物，无摇不散的沉淀，用紫外吸收法检测其蛋白含量应不低于2.0mg/mL，效价 应不低于标示效价且不低于1:10000，SDS-PAGE检测纯度应主带清晰，无明显杂带。
[0115] 吖啶酯标记用胃蛋白酶原(PGI/Π)抗体的选择
[0116] 首先仍就抗体的外观、浓度、纯度、效价进行验证，结果抗体为微带乳光的澄清液 体，无肉眼可见异物，无摇不散的沉淀，用紫外吸收法检测其蛋白含量应不低于2.0mg/mL， 效价应不低于标示效价且不低于1:10000，SDS-PAGE检测纯度应主带清晰，无明显杂带。
[0117] 本发明实施过程中涉及的其他配套试剂：
[0118] 清洗液、激发A液、激发B液的配制
[0119] 清洗液的主要成分为：磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160g/L、 Tween20 10mL/L，用纯化水按照10倍稀释使用。激发A液为含有0 · 35mol/L NaOH的溶液（其 中含有ImM的铁氰化钾），激发B液为含有1.32%w/v H2〇2的的缓冲液。
[0120] 本试剂盒的方法学评价方法
[0122 ]本产品试剂盒与现有技术产品对比实验方案 [0123] 1.最低检出限
[0124] 用零浓度企业线性参考品作为样本进行检测，重复测定10次，得出10次测量结果 的相对发光值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度企业线性参考品和 相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入 上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检出限。
[0125] 2.准确度
[0126] 将一定浓度胃蛋白酶原1/胃蛋白酶原Π (PGI/PG Π )液(A)加入血清B中，所加入PG I/PGII与血清B之间的体积比为1:9,各重复检测三次，取平均值，根据公式（1)计算结果。
[0128] 式中：R--回收率；
[0129] Vs一一加入A液体积；
[0130] Vo--血清样品B的体积；
[0131 ] C 血清样品加入A液后的检测浓度；
[0132] Co 血清样品B的检测浓度；
[0133] Cs--A液的浓度。
[0134] 3.线性
[0135] 将接近线性范围上限的高值样本按照一定比例用样本稀释液稀释，将这8个样本 重复检测2次，计算浓度平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并 计算线性相关系数r。
[0136] 4.重复性
[0137] 用高低浓度的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值(M)和标准差 (SD)，根据公式(2)得出变异系数(CV)。
[0138] CV = SD/MX100%............................................................(2)
[0139] 式中:CV-变异系数；
[0140] Μ -10次测量结果的平均值；
[0141] SD -10次测量结果的标准差。
[0142] 胃蛋白酶原I(PGI)检测报告
[0144]
[0145] 胃蛋白酶原Π (PGII)检测报告
[0147]
[0148] 目前市场上的试剂盒根据产品的不同存在全自动加样与半自动手动加样模式之 分，由于本产品试剂盒采用全自动加样模式，相对于其他手工加样的试剂盒，排除了人为加 样存在的误差，在一定程度上将人为干扰因素降到最低。检测报告数据显示，本产品试剂盒 在最低检出限、准确度、线性以及重复性等指标中均符合质检标准。且胃蛋白酶原I的最低 检出限、准确度、重复性与胃蛋白酶原Π的最低检出限、准确度、线性等性能指标均优于对 照产品试剂盒，而存在差距的两项指标中，其差距仍然在质检标准范围内，并不影响试剂盒 的产品性能。综合各项指标均可证明本产品试剂盒具有灵敏度高、重复性强、线性优、人为 干扰因素小等优势。
[0149] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种胃蛋白酶原l/π测定试剂盒，包括测PGI/Π 磁微粒、测PGI/Π 示踪结合物和PG Ι/Π 校准品，其特征在于:所述测PGI/Π 磁微粒为标记有胃蛋白酶原Ι/Π 单克隆抗体的磁 性微球和磁微粒保存液;测PGI/ Π 示踪结合物为标记有胃蛋白酶原1/ Π 抗体的示踪标记物 和示踪结合物稀释液，所述示踪标记物为吖啶酯及其衍生物;PGI/Π 校准品包括胃蛋白酶 原I/ Π 溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。2. 根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I/Π 测定试剂盒，其特征在于:所述磁性微球 为Fe2〇3或Fe3〇4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体。3. 根据权利要求2所述的一种胃蛋白酶原PGI/ Π 测定试剂盒，其特征在于:所述磁性微 球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团包括但不限于-OH，-C00H，-NH2，-CH0，-S0 3H。4. 根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原PGI/Π 测定试剂盒，其特征在于:所述胃蛋白 酶原I/Π 抗体为一种或多种单克隆抗体和/或多克隆抗体。5. 根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原PGI/Π 测定试剂盒，其特征在于:所述PGI/Π 校准品还包括PGI/Π 抗原和保护蛋白溶液，所述保护蛋白包含但不限于新生牛血清、牛血 清白蛋白、酷蛋白。6. 根据权利要求5所述的一种胃蛋白酶原PGI/ Π 测定试剂盒，其特征在于:所述PGI/ Π 校准品中保护蛋白质量浓度为1-30 %。7. 根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原PGI/Π 测定试剂盒，其特征在于:所述磁微粒 保存液和示踪结合物稀释液包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂和pH缓冲剂。8. 根据权利要求7所述的一种胃蛋白酶原PGI/Π 测定试剂盒，其特征在于:所述pH缓冲 剂包括TBS缓冲系统、HAC-NAC缓冲系统、PBS缓冲液系统、MES缓冲系统、HEPES缓冲系统中的 一种或几种，所述pH缓冲剂的缓冲能力为调节pH值6.0-8.5，所述pH缓冲剂的浓度范围为 0·01-0·2mol/L。9. 一种权利要求1-8任意一项所述胃蛋白酶原PGI/Π 测定试剂盒的制备方法，具体步 骤如下： 1) 测PGI/ Π 磁微粒的制备，包括磁微粒保存液的配制和磁微粒标记PGI/ Π 抗体的制 备； 2) 测PGI/Π 示踪结合物的制备，包括示踪物稀释液的配制和吖啶酯标记PGI/Π 抗体的 制备； 3. PGI/ Π 校准品的制备，包括校准品稀释液的配制和校准品的配制。10. 根据权利要求9所述的一种胃蛋白酶原PGI/Π 测定试剂盒的制备方法，其特征在 于:所述步骤1)中磁微粒保存液的配制包括如下步骤： 1.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量的 纯化水搅拌使其完全溶解； 1.2用移液器移取lmL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述1L的 容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀； 1.3调节PH计测量溶液PH，使其控制在7.2-7.4之间； 1.4称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解； 1.5定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2-8°C无菌环境下贮存。 所述步骤1)中磁微粒标记PGI/ Π 抗体的制备包括如下步骤： 1.6将带羧基的磁微粒与碳二亚胺(EDC)分别按质量比1:1-3的比例混合； 1.7按每毫克磁微粒分别加入5-40yg抗体的比例加入PGI/ Π 单抗，磁微粒与抗体质量 比为100:1; 1.8在混匀情况下20-28 °C分别标记0.5-2小时； 1.9标记后采用终浓度25mM的甘氨酸封闭多余的位点，22-26 °C反应0.5小时，至少洗涤 三次，用磁微粒保存液进行保存； 1.10采用方阵滴定法调试最佳浓度，用磁微粒保存液按照最佳浓度稀释磁微粒标记PG I / Π 得到测PGI / Π 磁微粒，于2-8 °C贮存； 所述步骤2)中示踪物稀释液的配制包括如下步骤： 2.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量的 纯化水搅拌，用移液器移取lmL Tween-20搅拌使其完全溶解； 2.2用移液器移取11111^口1'〇(31;[11 300于1〇11^纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述1]^的 容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀； 2.3调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2-7.4之间； 2.4称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解； 2.5定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2-8°C无菌环境下贮存； 所述步骤2)中吖啶酯标记PGI/ Π 抗体的制备包括如下步骤： 2.6分别取10111〇1?61/11单抗，按照每10111〇1抗体分别加入吖啶酯25-200111 〇1标记； 2.7戊二醛使用浓度分别为0.75-1.5%，分别在20-28°C反应0.5-2小时； 2.8用？!17.2-7.4的0.011?83透析，至少换液三次，透析后加入等体积甘油-20°(：存 放； 2.9采用方阵滴定法确定吖啶酯标记PGI/Π 抗体的最适工作浓度，用示踪结合物稀释 液进行稀释，混匀即得到测PG I / Π 示踪结合物，置2-8 °C存放。 所述步骤3)中校准品稀释液的配制包括如下步骤： 3.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量的 纯化水搅拌，用移液器移取lmL Tween-20搅拌使其完全溶解； 3.2用移液器移取11111^口1'〇(31;[11 300于1〇11^纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述1]^的 容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀； 3.3调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2-7.4之间； 3.4称取牛血清白蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解； 3.5定容至1L，用0.2μπι滤器过滤，过滤后贴好标签于2-8°C无菌环境下贮存。 所述步骤3)中校准品的配制包括如下步骤： 3.6用校准品稀释液稀释PGI纯品的工作浓度范围为0.5-500ng/mL; 3.7稀释PG Π 纯品的工作浓度范围为0.1-lOOng/mL，配成PGI/ Π 校准品1和PGI/ Π 校准 品2，校准品测定值应在范围之内，PG I校准品1的浓度范围为47.83 2-60.833ng/mL，PG I校准 品2的浓度范围为：291 · 300-365 · 103ng/mL;PG Π 校准品1的浓度范围为：8 · 788-11 · 018ng/ mL，PG Π 校准品2的浓度范围为：53.289-67.494ng/mL。
【文档编号】G01N33/577GK106018388SQ201610330619
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】蒙红胜, 乔文革, 梁宁, 孙凡婷, 胡晓明
【申请人】威海威高生物科技有限公司