伊血安颗粒的质量控制方法
【专利摘要】本发明公开了一种伊血安颗粒的质量控制方法，以原儿茶酸为参照物，采用高效液相色谱进行梯度洗脱获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的指纹图谱。指纹图谱共有色谱峰21个，它能充分反应伊血安颗粒的化学成分，信息量丰富，方法精密度、重现性和稳定性好，对伊血安颗粒的质量控制和临床疗效具有重要意义。
【专利说明】
伊血安颗粒的质量控制方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物检测领域，特别是一种伊血安颗粒的质量控制方法。
【背景技术】
[0002] 伊血安颗粒是一种治疗妇科血症的中成药，主要成份为滇桂艾纳香、益母草、延胡 索、甘草等，具有活血止血、行气止痛等功效。临床上用于产后恶露不绝，人工流产后子宫出 血不净，中医辩证属血瘀证者。
[0003] 为保证伊血安颗粒的质量及临床用药的安全有效，其质量标准的研究和建立日益 重要。现行的伊血安颗粒的质量标准，包括滇桂艾纳香、延胡索、甘草的薄层鉴别，用高效液 相色谱法测定原儿茶酸的含量，但该方法缺乏对益母草的鉴别，对延胡索、甘草的测定也仅 限于定性测量。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种伊血安颗粒的质量控制方法，包含对滇桂艾纳香、益母草的薄 层鉴别方法，以及伊血安颗粒的指纹图谱，为伊血安颗粒的质量控制提供了重要参考。
[0005] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0006] -种伊血安颗粒的质量控制方法，包括以下步骤：
[0007] (1)以原儿茶酸和原儿茶醛为对照，以氯仿、乙酸乙酯、甲酸混合溶液为展开剂鉴 别伊血安颗粒中的滇桂艾纳香成分；
[0008] (2)以盐酸水苏碱为对照，以丙酮、乙酸乙酯、盐酸混合溶液为展开剂鉴别伊血安 颗粒中的益母草成分；
[0009] (3)以原儿茶酸为参照物，用高效液相色谱检测伊血安颗粒提取液，获得伊血安颗 粒的指纹图谱;其中，伊血安颗粒提取液的提取工艺:取伊血安颗粒，加水溶解，加稀盐酸调 节PH，搅匀，静置，滤过，加水饱和正丁醇萃取3~6次，分取出正丁醇提取液，合并正丁醇提 取液，静置，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇溶解，离心，取上清液，得伊血安颗 粒提取液。调节pH的稀盐酸是质量分数为9.5%~10.5%的盐酸。
[0010] 进一步的，所述步骤(1)的具体操作方法为：
[0011] (11)滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液的准备:取伊血安颗粒，加水，使伊血安颗粒 溶解，加稀盐酸，搅拌均匀，滤过，加乙醚萃取2~3次，获得乙醚提取液，合并乙醚提取液，加 水洗涤2次后，弃去水液，分取乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇使之溶解，作为滇桂艾纳香薄 层鉴别供试品溶液;其中，稀盐酸是质量分数为9.5%~10.5%的盐酸；
[0012] (12)原儿茶酸对照品溶液:原儿茶酸对照品加甲醇制成原儿茶酸对照品溶液；
[0013] (13)原儿茶醛对照品溶液:原儿茶醛对照品加甲醇制成原儿茶醛对照品溶液；
[0014] (14)取上述滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液、原儿茶酸对照品溶液、原儿茶醛对 照品溶液点于同一硅胶薄层板上，以体积比为6:3:5的氯仿、乙酸乙酯、甲酸混合溶液为展 开剂展开，取出，晾干，在紫外灯下检视。
[0015] 进一步的，所述步骤(2)的具体操作方法为：
[0016] (21)益母草薄层鉴别供试品溶液的准备:取伊血安颗粒，加无水乙醇，振摇提取， 滤过，所获得的滤液蒸干，残渣加入无水乙醇溶解，作为益母草薄层鉴别供试品溶液；
[0017] (22)盐酸水苏碱对照品溶液:盐酸水苏碱对照品加无水乙醇制成盐酸水苏碱对照 品溶液；
[0018] (23)取上述益母草薄层鉴别供试品溶液、盐酸水苏碱对照品溶液，点于同一硅胶 薄层板上，以体积比为6:6:1的丙酮、乙酸乙酯、盐酸混合溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷 以改良碘化铋钾试液，加热使斑点显色清晰，益母草薄层鉴别供试品溶液色谱在与盐酸水 苏碱对照品溶液色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
[0019] 进一步的，所述步骤(3)的具体操作方法为：
[0020] (31)参照物溶液的准备:原儿茶酸标准品，加入甲醇定容，制得参照物溶液。
[0021] (32)伊血安颗粒提取液的准备；
[0022] (33)高效液相色谱仪的色谱条件：
[0023] 流动相：甲醇-0.1%冰乙酸；
[0024]梯度洗脱程序:时间梯度
[0025] 0min^llmin^l6min^29min^30min^35min^45min^55min^70min^95min ； 对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相BO. 1 %冰乙酸组成，流动相A的体 积百分数梯度5 % -16 % -17 % -30 % -34% -34% -35 % -45 % -45 % -70 %，流动相B 的体积百分数梯度95% -84% -83% -70% -66% -66% -65% -55% -55% -30% ; [0026] 紫外检测波长：256nm;
[0027] 流速：1 .OmL · min-S
[0028] 柱温：25 Γ。
[0029] (34)测定:吸取伊血安颗粒提取液注入高效液相色谱仪，按照步骤(33)的色谱条 件测定，得到指纹图谱。
[0030] 优选的，所述伊血安颗粒提取液提取的具体操作方法为:称取伊血安颗粒3~8g， 加水50mL溶解，加稀盐酸0.2~0.4mL，搅勾，静置15~30min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5~ 6次，每次15~20mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1~1.5h，分取获得正丁醇液，回收正丁 醇，残渣加甲醇4~6mL，离心，取上清液，得伊血安颗粒提取液。更优选的，所述伊血安颗粒 提取液提取的具体操作方法为:称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.3mL，搅匀， 静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，静置lh，分 取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得伊血安颗粒提取液。
[0031] 进一步的，所述指纹图谱共有色谱峰21个，其平均保留时间分别为：
[0032] 1 号峰 3.234min、2号峰 5.962min、3号峰11.023min、4 号峰 15.353min、5号峰 16.521111丨11、6号峰24.498111丨11、7号峰27.158111丨11、8号峰30.877111丨11、9号峰32.29111丨11、10号峰 34 · 752min、11号峰 36 · 182min、12 号峰 37 · 968min、13 号峰 38 · 708min、14 号峰 56 · 509min、15 号峰58.989111丨11、16号峰59.67〇111丨11、17号峰66.895111丨11、18号峰68.358111丨11、19号峰 69.31911^11、20号峰85.2171^11、21号峰91.0161^11。更进一步的，所述伊血安颗粒的组分包括 滇桂艾纳香、益母草、延胡索和甘草，其中1号峰~21号峰来源于滇桂艾纳香，9号峰来源于 益母草，10、11号峰来源于延胡索，6、14、15、16号峰来源于甘草。
[0033] 优选的，所述步骤（33)中，色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱（4 · 6_X 250mm，5y m)，保护柱为Phenomenex C18(4X3.0mm)〇
[0034] 优选的，所述步骤(33)中，理论塔板数以原儿茶酸峰计，不低于5000。
[0035] 以上所述的伊血安颗粒的质量控制方法，优化了滇桂艾纳香的薄层色谱鉴别方 法，补充了益母草的薄层色谱鉴别方法，同时确定了伊血安颗粒的指纹图谱建立方法。伊血 安颗粒的指纹图谱建立方法中，以原儿茶酸为参照物，通过高效液相色谱仪，采用甲醇-0.1%冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，获得了指纹图谱，指纹图谱中共有色谱峰21个，其中 21个共有峰来源于滇桂艾纳香，1个共有峰来源于益母草，2个共有峰来源于延胡索，4个共 有峰来源于甘草，能充分反应伊血安颗粒中四种原料药的化学成分，可用于整体评价四种 原料药的质量和鉴别四种原料药的优劣，为控制伊血安颗粒的质量提供了有力的理论依 据。本发明采用薄层色谱鉴别和指纹图谱相结合的方法，对伊血安颗粒进行快速分析，方法 重现性、稳定性好，对伊血安颗粒的质量控制和临床疗效具有重要意义。
【附图说明】
[0036] 图1是实施例1中采用Welchrom C18柱(4.6mmX250mm，5ym)得到的色谱图；
[0037] 图2是实施例1中采用Hypersil C18柱(4.6mmX250mm，5ym)得到的色谱图；
[0038] 图3是实施例1 中米用Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX250mm，5ym)得到的色谱 图；
[0039] 图4是实施例1中采用甲醇-水为流动相得到的色谱图；
[0040] 图5是实施例1中采用乙腈-水为流动相得到的色谱图；
[0041] 图6是实施例1中采用甲醇-0.1%磷酸为流动相得到的色谱图；
[0042]图7是实施例1中采用甲醇-0.05%冰乙酸为流动相得到的色谱图；
[0043]图8是实施例1中采用甲醇-0.1%冰乙酸为流动相得到的色谱图；
[0044]图9是实施例1中采用乙腈-0.1 %冰乙酸为流动相得到的色谱图；
[0045] 图10是实施例1中波长为230nm得到的色谱图；
[0046] 图11是实施例1中波长为256nm得到的色谱图；
[0047] 图12是实施例1中波长为280nm(0~20min)-279nm(20~30min)得到的色谱图；
[0048] 图13是实施例1中波长为320nm得到的色谱图；
[0049] 图14是实施例1中波长为360nm得到的色谱图；
[0050] 图15是实施例1中柱温为20°C得到的色谱图；
[0051] 图16是实施例1中柱温为25°C得到的色谱图；
[0052]图17是实施例1中柱温为30°C得到的色谱图；
[0053]图18是实施例1中柱温为35°C得到的色谱图；
[0054]图19是实施例1中流速为0.8mL · min-1得到的色谱图；
[0055]图20是实施例1中流速为l.OmL · mirT1得到的色谱图；
[0056]图21是实施例1中流速为1.2mL · min-1得到的色谱图；
[0057] 图22是实施例2中以水为提取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0058] 图23是实施例2中以甲醇为提取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0059]图24是实施例2中以乙醇为提取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0060] 图25是实施例2中以水饱和正丁醇为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0061] 图26是实施例2中以氯仿为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0062] 图27是实施例2中以乙醚为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0063]图28是实施例2中以乙酸乙酯为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；
[0064]图29是实施例3中伊血安颗粒的指纹图谱；
[0065]图30是实施例3中参照物的色谱图；
[0066]图31是实施例3中滇桂艾纳香药材色谱图；
[0067]图32是实施例3中益母草药材色谱图；
[0068]图33是实施例3中延胡索药材色谱图；
[0069]图34是实施例3中甘草药材色谱图；
[0070]图35是滇桂艾纳香薄层色谱鉴别方法获得的色谱图；
[0071 ]图36是益母草薄层色谱鉴别方法获得的色谱图；
[0072] 图37是实施例5中10个批号的伊血安颗粒的匹配图。
【具体实施方式】
[0073] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实 施例：
[0074] 以下实施例的实验材料、仪器和试剂准备如下：
[0075] 实验材料：原儿茶酸标准品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号： 110809-200503)。
[0076] 仪器:安捷伦Agilentl260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、四元 梯度栗(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、可变波长检测器 (G-1314B)、Agilentl260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司）；SB3200T超声波 清洗仪(上海必能信超声有限公司）；Millipore Simplicity-185超纯水仪(美国密里博公 司）；LG16-W高速微量离心机(北京医用离心机厂）；BT224S电子分析天平(北京赛多利斯仪 器系统有限公司）。
[0077] 试剂：甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；冰乙酸(HPLC，天津市科 密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水;其它试剂均为分析纯。
[0078]实施例1指纹图谱:色谱条件的优化
[0079]伊血安颗粒提取液的准备方法：称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸 0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合 并，静置lh，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得伊血安颗 粒提取液。
[0080] 1-1色谱柱的选择
[0081 ] 高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了Welchrom C18柱(4.6mmX 250mm，5y m)、Hypersil C18柱（4.6mmX250mm，5ym)和Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX250mm，5y m)三种色谱柱，所得到的色谱图分为如图1、图2、图3所示，由图3可以看出，Phenomenex Gemini C18柱(4·6mmX250mm，5μηι)分离度最好，峰形对称和尖锐，基线较平稳。
[0082] 1-2流动相的选择
[0083]高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷 酸、甲醇-0.05%冰乙酸、甲醇-0.1%冰乙酸、乙腈-0.1%冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，所 得到的色谱图分别如图4、图5、图6、图7、图8、图9所示，经比较可以看出，以甲醇-0.1%冰乙 酸系统为流动相的色谱图吸收峰分离较好，基线较平稳。
[0084] 1-3检测波长的选择
[0085] 高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了 230nm、256nm、280nm、320nm、360nm 吸收波长下的色谱图，色谱图分别如图10、图11、图12、图13和图14所示，经比较可以看出， 在256nm处色谱图显示有较多的峰信息，且信号较好，所得色谱图中各峰形较好、基线平稳。 [0086] 1-4柱温的选择
[0087]高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了 20°(：、25°(：、30°(：、35°(：不同的柱温， 色谱图分别如图15、图16、图17和图18所示，经比较可以看出，25 °C时各峰分离效果最好。 [0088] 1-5流速的选择
[0089] 高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了0.8mL · π?ΓΤ^Ι .OmL · mirT1、 1.2mL · mirT1不同流速，色谱图分别如图19、图20和图21所示，经比较可以看出，流速为 1 .OmL · mirT1时各峰分离效果最好。
[0090] 实施例2指纹图谱:样品前处理方法的优化
[0091 ] 高效液相色谱仪的色谱条件：色谱柱采用Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX 250mm，5ym);保护柱采用Phenomenex C18(4X3.0mm);流动相：甲醇-〇· 1%冰乙酸；梯度洗 脱程序:时间梯度
[0092] 0min^llmin^l6min^29min^30min^35min^45min^55min^70min^95min ； 对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相BO. 1 %冰乙酸组成，流动相A的体 积百分数梯度5 % -16 % -17 % -30 % -34% -34% -35 % -45 % -45 % -70 %，流动相B 的体积百分数梯度95%484%483%470%466%466%465%455%455%-30%;; 检测波长:256nm;流速：1. OmL · min-1;柱温：25 °C ;进样量:5yL。
[0093] 2-1提取溶剂的选择
[0094]称取伊血安颗粒5g，选用水、甲醇和乙醇三种提取溶剂，采用相同的提取方法对伊 血安颗粒进行提取，提取完成经同样的萃取、浓缩、溶解处理后，通过高效液相色谱仪进行 检测，所得到的色谱图分别如图22、图23、图24所示，经比较可以看出，以水为提取溶剂时， 显示有较多的峰信息，样品的有效物质完全溶解，峰分离度好。
[0095] 2-2萃取溶剂的选择
[0096]称取伊血安颗粒5g，以水为提取溶剂获得提取液后，选用水饱和正丁醇、氯仿、乙 醚、乙酸乙酯为萃取溶剂进行萃取，萃取方法相同，萃取完成经同样的浓缩、溶解处理后，通 过高效液相色谱仪进行检测，所得到的色谱图分别如图25、图26、图27和图28所示，经比较 可以看出，氯仿萃取的样品，峰信息很少，乙醚萃取的样品，峰信息较少且峰面积较小，乙酸 乙酯与水饱和正丁醇萃取所得图谱较为相似，但峰面积较小，且乙酸乙酯萃取时较易乳化， 故水饱和正丁醇萃取效果最佳。
[0097] 2-3萃取次数的选择
[0098]称取伊血安颗粒5g，以水为提取溶剂，以水饱和正丁醇为萃取溶剂萃取，分别考察 了萃取3次、4次、5次、6次，其他萃取方法相同，萃取完成经同样的浓缩、溶解处理后，通过高 效液相色谱仪进行检测，实验表明萃取5次与萃取6次的原儿茶酸在峰面积上无较大差异； 由此表明，萃取5次已基本可以把伊血安颗粒水溶性成分完全萃取，故萃取以5次为宜。 [0099] 2-4萃取量的选择
[0100]称取伊血安颗粒5g，以水为提取溶剂，以水饱和正丁醇为萃取溶剂萃取5次，其他 萃取方法相同，考察萃取量分别为10mL、15mL、20mL的萃取效果，萃取完成经同样的浓缩、溶 解处理后，通过高效液相色谱仪进行检测，实验表明萃取量为15mL与萃取量为20mL的原儿 茶酸在峰面积上无较大差异。由此表明，萃取量为15mL已基本可以把伊血安颗粒水溶性成 分完全萃取。
[0101] 实施例3伊血安颗粒的质量检测
[0102] 3-1参照物溶液的准备:称取原儿茶酸标准品0.81mg置10mL容量瓶中，加甲醇适量 使溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为〇.〇81mg · mL-1的原儿茶酸标准品溶液
[0103] 3-2伊血安颗粒提取液的准备：称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸 0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合 并，静置lh，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得伊血安颗 粒提取液。
[0104] 3-3高效液相色谱仪的色谱条件：
[0105] 色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX250mm，5ym);
[0106] 保护柱：Phenomenex C18(4X 3·0mm);
[0107] 流动相：甲醇-0.1%冰乙酸；
[0108] 梯度洗脱程序:时间梯度
[0109] 0min^llmin^l6min^29min^30min^35min^45min^55min^70min^95min ； 对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相BO. 1 %冰乙酸组成，流动相A的体 积百分数梯度5 % -16 % -17 % -30 % -34% -34% -35 % -45 % -45 % -70 %，流动相B 的体积百分数梯度95% -84% -83% -70% -66% -66% -65% -55% -55% -30% ; [0110] 紫外检测波长：256nm;
[0111] 流速：1 .OmL · min-S
[0112] 柱温：25°C。
[0113] 3-4伊血安颗粒提取液的测定:吸取伊血安颗粒提取液10yL注入高效液相色谱仪， 按照步骤3-3的色谱条件测定，得到指纹图谱，如图29所示。借助《中药色谱指纹图谱相似度 评价系统A版》软件，对指纹图谱的相关参数进行自动匹配，标定伊血安颗粒的21个指纹共 有峰，其平均保留时间分别为：1号峰3.234min、2号峰5.962min、3号峰11.023min、4号峰 15.353111丨11、5号峰16.521111丨11、6号峰24.498111丨11、7号峰27.158111丨11、8号峰30.877111丨11、9号峰 32 · 29min、10号峰34 · 752min、11号峰36 · 182min、12号峰37 · 968min、13号峰38 · 708min、14号 峰 56 · 509min、15 号峰 58 · 989min、16 号峰 59 · 670min、17 号峰 66 · 895min、18 号峰 68 · 358min、 19 号峰 69.319min、20 号峰 85.217min、21 号峰 91.016min。
[0114] 3-5参照物溶液的测定;精密吸取5yL参照物溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤 3-3的色谱条件测定，得参照物的图谱，如图30所示，原儿茶酸色谱峰与供试品指纹图谱中5 号峰的保留时间一致，作为参照峰。
[0115] 3-6指纹共有峰的标定
[0116]分别按3-2制作滇桂艾纳香、益母草、延胡索和甘草药材的供试品溶液，按3-3色谱 条件进样分析，根据各色谱峰保留时间和紫外吸收光谱特征对共有峰进行认定，结合图31 所示，1号峰~21号峰来源于滇桂艾纳香，结合图32所示，9号峰来源于益母草，结合图33所 示，10、11号峰来源于延胡索，结合图34所示，6、14、15、16号峰来源于甘草。
[0117] 3-7滇桂艾纳香的薄层色谱鉴别方法：
[0118]滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液的准备：取三个批号的伊血安颗粒各5g，加水 30mL，使伊血安颗粒溶解，加稀盐酸0.25mL，搅拌均匀，滤过，加乙醚萃取3次，每次15mL，合 并乙醚提取液，加水洗涤2次，每次15mL，弃去水液，分取乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇lmL 使之溶解，作为滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液；
[0119] 原儿茶酸对照品溶液:原儿茶酸对照品加甲醇制成0.30mg · mL-1溶液；
[0120] 原儿茶醛对照品溶液:原儿茶醛对照品加甲醇制成0.30mg · mL-1溶液；
[0121] 阴性对照溶液:取缺滇桂艾纳香的阴性伊血安颗粒样品按滇桂艾纳香薄层鉴别供 试品溶液制备方法同法制成阴性对照溶液。
[0122] 照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述滇桂艾纳香薄层 鉴别供试品溶液、原儿茶酸对照品溶液、原儿茶醛对照品溶液各15yL点于同一硅胶薄层板 上，以体积比为6:3:5的氯仿、乙酸乙酯、甲酸混合溶液为展开剂展开，置于展开剂预饱和的 展开缸内，展开，取出，瞭干，在紫外光灯(254nm)下检视，检视结果如图35所不，A为3-7项的 阴性对照溶液，B为原儿茶酸对照品溶液，C为原儿茶醛对照品溶液，D、E、F为三个批号的滇 桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液，可见滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液色谱在与原儿茶酸对 照品、原儿茶醛对照品色谱在相应位置上，显示有相同颜色的斑点，且分离效果好，重现性 好。
[0123] 3-8益母草的薄层色谱鉴别方法：
[0124] 益母草薄层鉴别供试品溶液的准备:取三个批号的伊血安颗粒各15g，研磨至100 ~300目，加入无水乙醇50ml，振摇提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇lml使溶 解，作为益母草薄层鉴别供试品溶液；
[0125] 盐酸水苏碱对照品溶液的准备:每lml无水乙醇溶解盐酸水苏碱0. lmg制成盐酸水 苏碱对照品溶液；
[0126] 阴性对照样品溶液的准备：取缺益母草的伊血安颗粒，按照益母草薄层鉴别供试 品溶液的准备方法进行制得阴性对照样品溶液。
[0127] 照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VI B)试验，取上述益母草薄层鉴别供 试品溶液、盐酸水苏碱对照品溶液各l〇yL，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为6:6:1的丙 酮、乙酸乙酯、盐酸混合溶液为展开剂展开，置于展开剂预饱和的展开缸内，取出，晾干，喷 以改良碘化铋钾试液，加热使斑点显色清晰，如图36所示，G、H、I为本实施例的三个批次的 益母草薄层鉴别供试品溶液，J为本实施例的盐酸水苏碱对照品溶液，K为3-8项的阴性对照 样品溶液，益母草薄层鉴别供试品溶液色谱在与盐酸水苏碱对照品溶液色谱相应的位置 上，显示相同颜色的斑点，且分离效果好，重现性好。
[0128] 实施例4指纹图谱建立方法的方法学考察
[0129] 4-1参照物溶液的准备:称取原儿茶酸标准品0.81mg置10mL容量瓶中，加甲醇适量 使溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为〇.〇81mg · mL-1的原儿茶酸标准品溶液
[0130] 4-2伊血安颗粒提取液的准备：称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸 0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合 并，静置lh，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得伊血安颗 粒提取液。
[0131] 4-3高效液相色谱仪的色谱条件：
[0132] 色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱（4.6mmX250mm，5ym);
[0133] 保护柱：Phenomenex C18(4X 3·0mm);
[0134] 流动相：甲醇-0.1%冰乙酸；
[0135] 梯度洗脱程序:时间梯度
[0136] 0min^llmin^l6min^29min^30min^35min^45min^55min^70min^95min ； 对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相BO. 1 %冰乙酸组成，流动相A的体 积百分数梯度5 % -16 % -17 % -30 % -34% -34% -35 % -45 % -45 % -70 %，流动相B 的体积百分数梯度95% -84% -83% -70% -66% -66% -65% -55% -55% -30% ;
[0137] 紫外检测波长：256nm;
[0138] 流速：1 .OmL · min-S
[0139] 柱温：25°C。
[0140] 4-4精密度实验
[0141] 取伊血安颗粒(批号120303)，按4-2的伊血安颗粒提取液的准备制备同一伊血安 颗粒提取液，按4-3的色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，考察仪器的精密度。结果见 表1、表2，结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.02 %~1.13 %之间，各色谱峰相对 峰面积RSD值在1.02%~2.92%之间，表明仪器的精密度良好。
[0142] 表1伊血安颗粒指纹图谱精密度实验-相对保留时间
[0145]表2伊血安颗粒指纹图谱精密度实验-相对峰面积
[0147]
[0148] 4-5重复性实验
[0149] 取6份伊血安颗粒(批号120303)，按4-2的伊血安颗粒提取液的准备制备同一伊血 安颗粒提取液，按4-3的色谱条件测定，记录色谱图，考察试验方法的重复性。结果见表3、表 4,6份样品中各色谱峰的相对保留时间RSD值在1.03%~1.64%之间，各色谱峰相对峰面积 RSD值在1.04%~3.09%之间，表明实验方法的重复性良好。
[0150] 表3伊血安颗粒指纹图谱重复性实验-相对保留时间
[0152]
[0153] 表4伊血安颗粒指纹图谱重复性实验-相对峰面积
[0156] 4-6稳定性实验
[0157] 取伊血安颗粒(批号120303)，按4-2的伊血安颗粒提取液的准备制备同一伊血安 颗粒提取液，按4-3的色谱条件测定，分别在0、2、4、8、16、2处进行检测，考察伊血安颗粒提 取液的稳定性。结果见表5、表6，各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.07 %~1.76 %之间，各 色谱峰的相对峰面积RSD值在1.45%~3.11 %之间，表明伊血安颗粒提取液24h内稳定性良 好。
[0158] 表5伊血安颗粒指纹图谱稳定性实验-相对保留时间
[0160]
[0161 ]表6伊血安颗粒指纹图谱稳定性实验-相对峰面积
[0164] 实施例5 10批次伊血安颗粒指纹图谱的采集
[0165] 取10个批号的伊血安颗粒，按实施例4中4-2的伊血安颗粒提取液的准备制备同一 伊血安颗粒提取液，按4-3的色谱条件测定，记录10个批号伊血安颗粒HPLC色谱图，以《中药 注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定，建立伊血安颗粒指纹图谱，10个批号的伊血 安颗粒的匹配图见图37。
[0166] 相似度评价:采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 2004A版，对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见表7。
[0167] 表7伊血安颗粒HPLC指纹图谱相似度计算结果
[0169] 按实施例3中3-5的方法确定参照峰(S)，以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分 别计算指纹共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表8、表9。
[0170] 表8 10个批号伊血安颗粒色谱图共有峰相对保留时间
[0172]
[0173] 表9 10个批号伊血安颗粒色谱图共有峰相对峰面积
[0175]
[0176] 实验数据显示，供试品共有峰相对峰面积RSD%值普遍偏高，且10批伊血安颗粒 HPLC指纹图谱的相似度都只大于0.82,未达到《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂 行)》规定中大于0.9的要求。可能是原料药材受到了地域、气候、环境、采收时间、储藏等的 影响或是产品制剂工艺不稳定等原因造成各组分含量比例差异。应进一步研究其影响因 素，规范化种植，保持药材质量稳定，加强生产工艺中产品质量控制，才能有效地保证制剂 的质量稳定。
【主权项】
1. 一种伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 以原儿茶酸和原儿茶醛为对照，以氯仿、乙酸乙酯、甲酸混合溶液为展开剂鉴别伊 血安颗粒中的滇桂艾纳香成分； (2) 以盐酸水苏碱为对照，以丙酮、乙酸乙酯、盐酸混合溶液为展开剂鉴别伊血安颗粒 中的益母草成分； (3) 以原儿茶酸为参照物，用高效液相色谱检测伊血安颗粒提取液，获得伊血安颗粒的 指纹图谱；其中，伊血安颗粒提取液的提取工艺：取伊血安颗粒，加水溶解，加稀盐酸调节 PH，搅匀，静置，滤过，加水饱和正丁醇萃取3~6次，分取出正丁醇提取液，合并正丁醇提取 液，静置，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇溶解，离心，取上清液，得伊血安颗粒 提取液。2. 根据权利要求1所述伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述步骤(1)的具体操作方法为： (11) 滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液的准备：取伊血安颗粒，加水，使伊血安颗粒溶 解，加稀盐酸，搅拌均匀，滤过，加乙醚萃取2~3次，获得乙醚提取液，合并乙醚提取液，加水 洗涤2次后，弃去水液，分取乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇使之溶解，作为滇桂艾纳香薄层 鉴别供试品溶液； (12) 原儿茶酸对照品溶液:原儿茶酸对照品加甲醇制成原儿茶酸对照品溶液； (13) 原儿茶醛对照品溶液:原儿茶醛对照品加甲醇制成原儿茶醛对照品溶液； (14) 取上述滇桂艾纳香薄层鉴别供试品溶液、原儿茶酸对照品溶液、原儿茶醛对照品 溶液点于同一硅胶薄层板上，以体积比为6:3:5的氯仿、乙酸乙酯、甲酸混合溶液为展开剂 展开，取出，晾干，在紫外灯下检视。3. 根据权利要求1所述伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述步骤(2)的具体操作方法为： (21) 益母草薄层鉴别供试品溶液的准备:取伊血安颗粒，加无水乙醇，振摇提取，滤过， 所获得的滤液蒸干，残渣加入无水乙醇溶解，作为益母草薄层鉴别供试品溶液； (22) 盐酸水苏碱对照品溶液:盐酸水苏碱对照品加无水乙醇制成盐酸水苏碱对照品溶 液； (23) 取上述益母草薄层鉴别供试品溶液、盐酸水苏碱对照品溶液、点于同一硅胶薄层 板上，以体积比为6:6:1的丙酮、乙酸乙酯、盐酸混合溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以改 良碘化铋钾试液，加热使斑点显色清晰，益母草薄层鉴别供试品溶液色谱在与盐酸水苏碱 对照品溶液色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。4. 根据权利要求1所述伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述步骤(3)的具体操作方法为： (31) 参照物溶液的准备:原儿茶酸标准品，加入甲醇定容，制得参照物溶液。 (32) 伊血安颗粒提取液的准备； (33) 高效液相色谱仪的色谱条件： 流动相：甲醇-0.1%冰乙酸； 梯度洗脱程序：时间梯度Omin-l lmin- 16min429min430min435min-45min4 55min470min-95min;对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相BO. 1 %冰 乙酸组成，流动相A的体积百分数梯度5 % -16 % -17 % -30 % -34 % -34 % -35 % -45 % 445%470%，流动相8的体积百分数梯度95%484%483%470%466%466%-65% -55%-55%-30% ; 紫外检测波长:256nm; 流速：1 · OmL · min-1 ； 柱温：25°C。 (34)测定：吸取伊血安颗粒提取液注入高效液相色谱仪，按照步骤(33)的色谱条件测 定，得到指纹图谱。5. 根据权利要求1或4所述的伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述伊血安颗粒提取液提取的具体操作方法为：称取伊血安颗粒3~8g，加水50mL溶 解，加稀盐酸〇. 2~0.4mL，搅勾，静置15~30min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5~6次，每次15 ~20mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1~1.5h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲 醇4~6mL，离心，取上清液，得伊血安颗粒提取液。6. 根据权利要求1所述的伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述指纹图谱共有色谱峰21个，其平均保留时间分别为： 1 号峰 3.234min、2 号峰 5.962min、3 号峰11.023min、4 号峰15.353min、5 号峰16.521min、 6 号峰 24.498min、7 号峰 27.158min、8 号峰 30.877min、9 号峰 32.29min、10 号峰 34.752min、ll 号峰36.182min、12号峰37.968111丨11、13号峰38.708111丨11、14号峰56.509111丨11、15号峰 58.989111丨11、16号峰59.670111丨11、17号峰66.895111丨11、18号峰68.358111丨11、19号峰69.319111丨11、20 号峰 85.217min、21 号峰 91.016min。7. 根据权利要求6所述的伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述伊血安颗粒的组分包括滇桂艾纳香、益母草、延胡索和甘草，其中1号峰~21号峰 来源于滇桂艾纳香，9号峰来源于益母草，10、11号峰来源于延胡索，6、14、15、16号峰来源于 甘草。8. 根据权利要求4所述的伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述步骤(33)中，色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱(4.6mmX250mm，5ym)，保护柱为 Phenomenex C18(4X3.0mm)。。9. 根据权利要求4所述的伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述步骤(33)中，理论塔板数以原儿茶酸峰计，不低于5000。10. 根据权利要求1、4、5任一项所述的伊血安颗粒的质量控制方法，其特征在于： 所述伊血安颗粒提取液提取的具体操作方法为:称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加 稀盐酸0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取 液，合并，静置lh，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得伊血 安颗粒提取液。
【文档编号】G01N30/02GK106018587SQ201610315836
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】慕丽群, 李修善, 毛金玲, 农常东
【申请人】广西万寿堂药业有限公司