用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂及其检测方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂及其检测方法，所述组合检测试剂包括含有多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液和蛋白沉淀剂。本发明提供的组合检测试剂可以同时分析检测28种磺胺类化合物，检测范围广泛；样品处理中采用蛋白沉淀或液液萃取的方案，对生物样品中的28种磺胺类化合物进行净化和富集；应用本发明所述组合试剂的检测方法具有简便、准确、快速、稳定、样本量少的优点，而且无需衍生化、酶转化等复杂步骤，前处理过程应用的化学试剂少，绿色环保，检测结果不受内源性物质的干扰，假阴性假阳性率低，试剂成本低廉，适用于大量样本的快速分析。
【专利说明】
用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种用于检测磺胺类化合物的组合检测 试剂及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 磺胺类药物（SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，具有抗菌谱 广、疗效强等优点，是目前养殖业中最常使用的抗生素之一。由于SAs在体内的作用时间和 代谢时间较长，通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积，浓度超过一定值后对人 体机能会产生危害。SAs药物毒性作用主要体现在肾损伤、致肿瘤作用、过敏反应、造血机能 破坏、消化系统障碍等。由于磺胺的危害较大，且在养殖中使用较多，因此欧盟、美国、日本 等国家对横胺类药物在动物源性食品中的残留限量要求不断提高，许多磺胺类药物已经被 列为禁用兽药。为了保证食品质量安全，需要快速、准确、廉价的多残留方法检测食品中的 磺胺类药物残留。磺胺类药物残留的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法、气相色 谱-质谱法、高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳法、生物免疫法等。酶联免疫法和放射 免疫法主要用于大规模的筛选工作，容易出现假阳性，一般不用于定量;气相色谱法用电子 捕获检测器进行定量分析，具有较高的特异性，但该方法较为繁琐，不易操作;高效液相色 谱紫外检测法和毛细管电泳法灵敏度低，特异性差，特别是在低浓度检测时样品基质干扰 大，很难准确地定性确认;气相色谱-质谱法虽然灵敏度和特异性都很高，但衍生过程繁琐， 不适用于高通量分析。
【发明内容】
[0003] 针对上述磺胺类药物检测的现状，本发明的目的是提供了一种用于检测磺胺类化 合物的组合检测试剂及其检测方法，本发明提供的组合检测试剂可以检测畜、禽肉、组织及 其相关制品和畜、禽尿、唾液等体液生物样品中多达28种磺胺类药物。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0005] 本发明提供了用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂，所述组合检测试剂包括： 含有多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液和蛋白沉淀剂，含有的每种磺胺类化合物对 照品在有机溶剂溶液中的浓度均为0.1ng_20ng/mL，所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或乙酸乙 酯。
[0006] 进一步的:所述含有多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液为含有28种磺胺类 化合物的体积比为50 %的甲醇溶液;所述28种磺胺类化合物分别为:磺胺甲嘧啶、磺胺甲氧 嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺地索辛、磺胺喹恶啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺 胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、周效磺胺、磺胺甲鰂唑、磺胺 脒、甲氧苄啶、磺胺甲二唑、磺胺间二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嗪、磺胺索嘧啶、 磺胺喹沙啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺、磺胺异鰂唑和磺胺二甲鰂唑。
[0007] 进一步的：所述组合检测试剂还包括流动相添加剂，所述流动相添加剂为甲酸和 甲酸铵的复合。
[0008]进一步的:所述蛋白沉淀剂为乙腈。
[0009]本发明还提供了利用所述的用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂的检测方法， 所述检测方法包括以下步骤：
[0010] (1)生物样品预处理:对待检测样品利用液液萃取法、蛋白沉淀法或滤膜过滤法进 行预处理；
[0011] (2)取所述含有多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液直接进样;获得每种磺 胺类化合物的标准曲线;得到线性方程、相关系数和线性范围；
[0012] (3)对预处理后的待检测样品进行液相色谱串联质谱检测：
[0013] (4)将质谱检测得到的各磺胺类化合物的峰面积，代入步骤(2)中对照品获得的标 准曲线，得到对应磺胺类化合物的含量。
[0014] 进一步的：所述步骤（1)中液液萃取法为:将固体待检测样品粉碎，加水，匀浆，加 入的水体积与样品重量比为1:1-6:1;之后匀浆液用乙酸乙酯萃取，离心，35-45 °C的条件下 将有机相吹干，加入甲醇复融，离心，取上清液用于分析。
[0015] 进一步的：所述步骤（1)中蛋白沉淀法为:将固体待检测样品粉碎，加水，匀浆;之 后匀浆液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样品重量比为1:1 -6 :1;离 心，取上清液，微孔滤膜过滤，取滤液用于分析。
[0016] 进一步的：所述步骤（1)中滤膜过滤法为:将液体待检测样品用微孔滤膜过滤，滤 液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样品重量比为1:1-6:1;离心，取上 清液用于分析。
[0017] 进一步的:所述步骤(3)中色谱条件为:采用硅胶键合相填料柱，流动相由A相+B相 组成:A相为乙腈水，含体积百分比为0.002%-0.1%的甲酸，B相为乙腈，含体积百分比为 0 · 002 % -0 · 1 %的甲酸，A相:B相的体积比为1-99%:99-1%。
[0018]进一步的:所述步骤(3)中质谱条件为：电喷雾电离源ESI，正离子多反应监测扫描 MRM，气帘气35~40psi，离子化电压+5500V，温度450~550°C，喷雾气40~55psi，辅助加热 气40~60psi。
[0019] 本发明的优点和技术效果是：
[0020] 1、本发明提供的检测试剂组合可以同时分析检测28种磺胺类化合物，检测范围广 泛；
[0021] 2、基于检测方法优化的结果，不需要与检测样品一致的空白基质，对照品溶剂无 需处理直接进样分析即可构建标准曲线；
[0022] 3、样品处理中采用蛋白沉淀或液液萃取的方案，对生物样品中的28种磺胺类化合 物进行净化和富集；
[0023] 4、在样品的色谱分离中，采用细口径的色谱短柱和梯度洗脱法，对28种磺胺类化 合物进行快速分离；
[0024] 5、采用甲酸+甲酸铵的复合流动相添加剂，消除基质效应的同时，提高了分析方法 的灵敏度;保证测定结果的正确性情况下，简化了操作步骤。
[0025] 6、应用本发明所述组合试剂的检测方法具有简便、准确、快速、稳定、样本量少的 优点，而且无需衍生化、酶转化等复杂步骤，前处理过程应用的化学试剂少，绿色环保，检测 结果不受内源性物质的干扰，假阴性假阳性率低，试剂成本低廉，适用于大量样本的快速分 析。
【附图说明】
[0026] 图1是本发明中28种磺胺类化合物的提取离子流色谱图；图la、图lb、图lc为所述 28种磺胺类化合物的提取离子流色谱图。
[0027] 图2是本发明实施例2中鸭肉样品中检测到磺胺硝苯的提取离子流色谱。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。该例子仅是应用范例。不 能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
[0029] 实施例1
[0030] 1.实验仪器与试剂
[0031] 1.1实验仪器
[0032] AcQuity? UPLC超高压液相色谱仪、Oasis MCX固相萃取(SPE)小柱（3ml，60mg)均 购自美国Waters，API5500Qtrap质谱仪购自美国AB，漩涡混合器，TTL-DC Π型氮吹仪，IKA高 速组织匀浆机，超纯水仪(Simplicity，默克密理博公司），超声波提取仪(KQ-250B，昆山市 超声仪器有限公司）、IKA T18Basic高速分散机(德国）。
[0033] 1.2实验试剂
[0034]甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯）甲酸纯度为99 %，28种磺胺类化合物（纯度均彡 99%):磺胺甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺地索辛、磺胺喹恶啉、磺胺苯 吡唑、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧 啶、周效磺胺、磺胺甲鰂唑、磺胺脒、甲氧苄啶、磺胺甲二唑、磺胺间二甲嘧啶、磺胺甲氧哒 嗪、磺胺间二甲氧嗪、磺胺索嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺、磺胺异鰂唑、磺胺二 甲鰂挫购自德国Dr · Ehrenstorfer GmbH。
[0035] 2.检测方法
[0036] 2.1待检测样品前处理
[0037]选取鸡肉样品，切块，去筋膜，准确称取1.00g鸡肉样品，加入3ml水，经高速组织分 散机均匀捣碎制成匀浆样品，准确称取lml匀浆样品，置于5mL EP管内，用移液枪加入3mL乙 腈，2000rpm祸旋5min，14000g离心5min，将上清液转移至EP管中，残渣再加入lmL乙腈， 2000rpm祸旋5min，14000g离心5min，重复提取1次，合并上清液。将Waters Oasis MCX(3cc/ 60mg)的固相萃取小柱先用3mL的乙腈和3mL的超纯水活化完毕后，取合并提取液上样过柱， 加5mL超纯水淋洗，再用5mL 4 %氨化乙腈洗脱，洗脱液40 °C下，N2吹干，用10 %乙腈定容至 200yL，2000rpm涡旋60s后，过0.2μπι的微孔滤膜，待UPLC-MS/MS分析。
[0038] 2.2液相色谱串联质谱分析
[0039]色谱条件：色谱柱:ACQUITY UPLC? BEH C18柱（50mmX2.1mm，1.7ym);柱温40Γ; 进样体积5μ1;采用硅胶键合相填料柱，流动相由A相+B相组成:A相为乙腈水（乙睛和水的体 积比为5:95)，含体积比为0.03%的甲酸;B相为乙腈，含体积比为0.03%的甲酸或乙酸;A 相:B相的体积比为（1-99% ): (99-1 % )，流速0.3ml/min;采用梯度洗脱，流动相组成配比随 洗脱时间梯度变化。流动相梯度洗脱程序见表1。
[0040]表1 28种磺胺类化合物的液相洗脱条件
[0042]质谱条件:采用电喷雾电离源ESI正离子的离子化模式，进行多反应监测(MRM)扫 描，气帘气35~40psi，离子化电压+5500V，温度450~550°C，喷雾气40~55psi，辅助加热气 40~60psi，接口加热气On，碰撞气Medium。多反应监测模式(MRM)种，每个化合物检测两对 离子，一对用于定量，一对用于定性。
[0043] 3技术方案的优化
[0044] 3.1、色谱条件优化
[0045] 本发明选用2 · 1 X 50mm，1 · 7μπι的C18色谱柱在相对较短时间内保证28种磺胺类化 合物的有效分离。实验比较甲醇-水、乙腈-水体系作为流动相对28种磺胺类化合物的分离 效果的影响，为了提高分析的效率减少分析时间，采用洗脱能力较强的乙腈-水流动相系 统，实验采用脉冲梯度洗脱方式，结合优化后的流动相添加剂〇. 03 %甲酸和0.03 %甲酸铵， 消除了样品中共流出成分对待分析物的离子抑制作用（基质效应），大大提高了灵敏度，单 个运行过程时间仅需6min，并且还有缩短分析时间的余地。
[0046] 3.2、质谱条件优化
[0047]采用流动注射方式，在正离子和负离子模式下对每种化合物进行一级质谱扫描获 得其分子离子峰;在确定各类化合物的准分子离子峰后分别对其进行二级质谱分析，获得 其碎片离子信息，确定定量离子和定性离子。通过优化碎裂电压(Fragmentor，V)、碰撞电压 (Col 1 ision Energy，eV)等参数，使28种磺胺类化合物的准分子离子与特征碎片离子产生 的离子对灵敏度达到最优;对毛细管电压、雾化压力、干燥气温度、干燥气流量等进行优化， 使每种待测化合物的离子化效率达到最佳。质谱离子源部分优化参数见表2。
[0048]表2 28种磺胺类化合物的质谱离子源部分条件(带*者为定量离子）
[0051] 3.3、样品前处理优化
[0052] 由于磺胺类药物难溶于水，较易溶于稀酸、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷 等有机溶剂。考虑到大多数样品前处理方法的兼容性，经比较，选择乙腈为提取剂，由于方 法灵敏，所需的样本量少，每样品所需化学试剂量少，绿色环保;与乙腈相比用乙酸乙酯、二 氯甲烷、三氯甲烷等提取效率差，提取液中脂肪含量较高，不利于净化处理，提取效率较低。 样品加入乙腈后，振荡混匀后超声提取30min，过0.2μπι有机滤膜后进样检测，结果显示乙腈 对28种磺胺类化合物的提取效率高达90%以上。且样品无需进一步净化，直接用于UPLC-MS/MS检测，即可较好的提取中样品中非法添加药物。
[0053] 4、线性范围与检出限
[0054]受益于分析方法的优化，将28种磺胺类化合物的标准溶液直接进样于UPLC-MS/MS 进行分析即可构建分析所需的标准曲线，取浓度分别为〇.〇78、0.156、0.313、0.625、1.25、 2.5、5、10、20ng/mL的标准溶液经检测后，绘制28种磺胺类化合物的标准曲线，相关系数均 大于0.99(见表3)。标准曲线线性良好r多0.99(η = 5)。鸡肉中28种磺胺类化合物的代表性 色谱图见图1。
[0055] 28种磺胺类化合物总离子流图见图1所示，从图1中可以看出，磺胺甲嘧啶保留时 间为2.31min;磺胺甲氧嗪磺胺甲嘧啶保留时间为2.41min;磺胺氯哒嗪磺胺甲嘧啶保留时 间为2.49min;磺胺苯酰磺胺甲嘧啶保留时间为2.64min;磺胺地索辛磺胺甲嘧啶保留时间 为2.64min;磺胺喹恶啉磺胺甲啼啶保留时间为2.63min;磺胺苯吡唑磺胺甲啼啶保留时间 为2.66min;磺胺硝苯磺胺甲嘧啶保留时间为2.77min;磺胺嘧啶磺胺甲嘧啶保留时间为 2.21min;磺胺醋酰磺胺甲嘧啶保留时间为0.86min;磺胺吡啶磺胺甲嘧啶保留时间为 2.2 5 m i η;磺胺噻唑磺胺甲啼啶保留时间为2.3 6 m i η;磺胺二甲啼啶磺胺甲啼啶保留时间为 2.37min;磺胺间甲氧啼啶磺胺甲啼啶保留时间为2.42min;周效磺胺磺胺甲啼啶保留时间 为2.49min;磺胺甲鰂唑磺胺甲嘧啶保留时间为2.53min;磺胺脒磺胺甲嘧啶保留时间为 0.8 4m i η;甲氧节啶磺胺甲啼啶保留时间为2.2 0 m i η;磺胺甲二唑磺胺甲啼啶保留时间为 2.06min;磺胺间二甲啼啶磺胺甲啼啶保留时间为2.28min;磺胺甲氧?达嗪磺胺甲啼啶保留 时间为2.43min;磺胺间二甲氧嗪磺胺甲啼啶保留时间为2.63min;磺胺索啼啶磺胺甲啼啶 保留时间为2.6 9m i η;磺胺喹沙啉磺胺甲啼啶保留时间为2.3 6 m i η;磺胺对甲氧啼啶磺胺甲 嘧啶保留时间为2.37min;磺胺磺胺甲嘧啶保留时间为2.14min;磺胺异鰂唑磺胺甲嘧啶保 留时间为2.36min;磺胺二甲鰂唑磺胺甲嘧啶保留时间为2.75min。
[0056]表3 28种磺胺类化合物在鸡肉中的定量限、线性范围和相关系数
[0059] 5、回收率与精密度
[0060] 本发明考察了该方法的回收率及精密度，在空白样品中添加3个不同水平（1、6、 20ng/mL)的28种磺胺类化合物按实验方法测定回收率，每个水平重复测定6次。结果显示， 28种磺胺类化合物的平均回收率为85.0%~107%，相对标准偏差均小于2.25% (结果见表 4)〇
[0061 ]表4方法加标回收率及精密度
[0064]实施例2、待检测样品的具体检测分析
[0065]实际待检测样品从山东省市场购买，处理后，储存在4°C的冰箱中备用。用本发明 检测方法对购买的10份鸭肉样品进行检测，发现1例阳性样品，检测出，磺胺硝苯含量为 0.52ng/mL，见图 2。
[0066]本实施例具体检测方法如下：
[0067] (1)生物样品预处理:本实施例预处理采用蛋白沉淀法(使用所述组合检测试剂中 的蛋白沉淀剂)进行处理。选取鸭肉样品，切块，去筋膜，准确称取1. 〇〇g鸭肉样品，加入3mL 水，经高速组织分散机均匀捣碎制成匀浆样品，准确称取lmL匀浆样品，置于5mL EP管内，用 移液枪加入3mL乙腈，2000rpm祸旋5min，14000g离心5min，将上清液转移至EP管中，残渣再 加入lmL乙腈，2000rpm祸旋5min，14000g离心5min，重复提取1次，合并上清液。
[0068] (2)取所述组合检测试剂中的含有多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液直接 进样;获得每种磺胺类化合物的标准曲线;得到线性方程、相关系数和线性范围。
[0069] (3)对预处理后的待测样品进行液相色谱串联质谱分析：将Waters Oasis MCX (3cc/60mg)的固相萃取小柱先用3mL的乙腈和3mL的超纯水活化完毕后，取合并提取液上样 过柱，加5mL超纯水淋洗，再用5mL 4%氨化乙腈洗脱，洗脱液40°C下，N2吹干，用10%乙腈定 容至200yL，2000rpm涡旋60s后，过0.2μπι的微孔滤膜，待UPLC-MS/MS分析。
[0070] 液相色谱、质谱条件同实施例中的2.2,质谱离子源部分优化参数见实施例1中的 表2。
[0071] (4)将质谱检测得到的各化合物的峰面积，代入步骤(2)中的标准曲线，得到对应 磺胺类化合物的含量。
[0072] 本发明采用高效液相色谱串联质谱技术建立了 28种磺胺类化合物的分析方法。该 方法操作简便快速、灵敏度高、专属性强、重复性好，可同时测定28种磺胺类化合物，实现了 其高通量分析，可满足中28种磺胺类化合物的监控要求。
[0073] 上述内容虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂，其特征在于所述组合检测试剂包括:含有 多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液和蛋白沉淀剂，含有的每种磺胺类化合物对照品 在有机溶剂溶液中的浓度均为0.1 ng-20 ng/mL，所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或乙酸乙 酯。2. 根据权利要求1所述的组合检测试剂，其特征在于:所述含有多种磺胺类化合物对照 品的有机溶剂溶液为含有28种磺胺类化合物的体积比为50%的甲醇溶液;所述28种磺胺类 化合物分别为:磺胺甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺苯酰、磺胺地索辛、磺胺喹恶啉、 磺胺苯吡唑、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲 氧嘧啶、周效磺胺、磺胺甲鰂唑、磺胺脒、甲氧苄啶、磺胺甲二唑、磺胺间二甲嘧啶、磺胺甲氧 哒嗪、磺胺间二甲氧嗪、磺胺索嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺、磺胺异鰂唑和磺 胺二甲鰂唑。3. 根据权利要求1所述的组合检测试剂，其特征在于:所述组合检测试剂还包括流动相 添加剂，所述流动相添加剂为甲酸和甲酸铵的复合。4. 根据权利要求1所述的组合检测试剂，其特征在于:所述蛋白沉淀剂为乙腈。5. 利用权利要求1所述的用于检测磺胺类化合物的组合检测试剂的检测方法，其特征 在于所述检测方法包括以下步骤： (1) 生物样品预处理:对待检测样品利用液液萃取法、蛋白沉淀法或滤膜过滤法进行预 处理； (2) 取所述含有多种磺胺类化合物对照品的有机溶剂溶液直接进样;获得每种磺胺类 化合物的标准曲线;得到线性方程、相关系数和线性范围； (3) 对预处理后的待检测样品进行液相色谱串联质谱检测： (4) 将质谱检测得到的各磺胺类化合物的峰面积，代入步骤(2)中对照品获得的标准曲 线，得到对应磺胺类化合物的含量。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述步骤（1)中液液萃取法为:将固体 待检测样品粉碎，加水，匀浆，加入的水体积与样品重量比为1:1-6:1;之后匀浆液用乙酸乙 酯萃取，离心，35-45° C的条件下将有机相吹干，加入甲醇复融，离心，取上清液用于分析。7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述步骤（1)中蛋白沉淀法为:将固体 待检测样品粉碎，加水，匀浆;之后匀浆液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体 积与样品重量比为1:1-6:1;离心，取上清液，微孔滤膜过滤，取滤液用于分析。8. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述步骤（1)中滤膜过滤法为:将液体 待检测样品用微孔滤膜过滤，滤液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入体积与样 品重量比为1:1-6:1;离心，取上清液用于分析。9. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述步骤(3)中色谱条件为:采用硅胶 键合相填料柱，流动相由A相+B相组成:A相为乙腈水，含体积百分比为0.002%-0.1%的甲酸， B相为乙腈，含体积百分比为0.002%-0.1 %的甲酸，A相:B相的体积比为1 -99%: 99-1 %。10. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述步骤(3)中质谱条件为：电喷雾 电离源ESI，正离子多反应监测扫描MRM，气帘气35~40 psi，离子化电压+5500 V，温度450~ 550 °C，喷雾气40~55 psi，辅助加热气40~60 psi。
【文档编号】G01N30/02GK106018602SQ201610347829
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】李鹰飞
【申请人】青岛蓥康食品检测技术服务有限公司