一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤。本发明采用极性溶剂和非极性溶剂分别萃取烟草花粉极性代谢物和非极性代谢物，采用保留指数和质谱谱图库定性鉴定气相色谱质谱所采集的所有代谢物，采用非靶标定量分析方法定量分析所采集的所有代谢物。该方法的建立为开展烟草花粉代谢组学相关研究提供了重要的参考。
【专利说明】
一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢 组学分析方法。
【背景技术】
[0002] 代谢组学是对生物系统因病理生理刺激以及基因、环境等改变所致动态多参数代 谢应答的定性定量研究。代谢组学是近年来迅速发展的一个研究领域，从1997年提出代谢 组学的概念以来，在植物、动物和微生物研究领域取得了卓有成效的成绩，尤其在植物代谢 组学研究方面许多国内外知名大学和研究单位都开展了相关研究工作。
[0003] 代谢组学研究所采用的分析方法主要有核磁共振光谱法、液相色谱质谱法、气相 色谱质谱法等。到目前为止，气相色谱质谱由于其操作成本低、定性定量能力强以及对代谢 物的覆盖面广等特点，已经成为植物代谢组学研究最重要的分析方法之一。
[0004] 烟草是植物生物学研究非常重要的一种模式植物，也是非常重要的一种经济植物。 目前，人们已在烟草品质、抗病、抗虫等方面开展了大量的研究，这些研究主要是从基因、环境 等方面展开，而从代谢组学的角度开展研究的相关报道却较少。这主要是因为代谢组学目前 仍是一种不断完善和发展的研究方法。由于烟叶是烟草的主要经济器官，人们对于烟草的研 究主要集中在烟叶上。烟草花粉是烟草繁殖的重要载体，与烟草杂交育种直接相关，是不同品 种烟草间杂交亲和性研究的直接对象。因此建立烟草花粉的代谢组学研究方法具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法。
[0006] 本发明的目的是这样实现的，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、 代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括： A、 样品前处理:将新鲜的烟草花粉样品置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到 冻干烟草花粉样本，于4 °C进行保存； B、 色谱质谱分离： 1) 极性代谢物的提取及衍生化:准确称取20.0 mg的冻干烟草花粉样本于1.5 mL离心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去离子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL内标溶液，超声，离 心，取下清液600此，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒温肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转 至气相色谱质谱仪分析，进样量1 yL; 2) 非极性代谢物的提取:准确称取100.0 mg冻干烟草花粉样本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 yL二氯甲烷复溶， 复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量1 yL; C、 代谢物结构鉴定:采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合 的方法进行化合物定性； D、 代谢物的定量分析:将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息， 具体计算公式如下：
其中，CjPCi分别代表代谢物X和内标的含量，yg/g; 八、和&分别代表代谢物X和内容的色谱峰面积； E、 数据分析:将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统 计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用 T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。
[0007] 本发明采用极性溶剂和非极性溶剂分别萃取烟草花粉极性代谢物和非极性代谢 物，采用保留指数和质谱谱图库定性鉴定气相色谱质谱所采集的所有代谢物，采用非靶标 定量分析方法定量分析所采集的所有代谢物。该方法的建立为开展烟草花粉代谢组学相关 研究提供了重要的参考。
【附图说明】
[0008] 图1为云烟87和云烟97花粉的主成分分析得分图（左)和载荷图（右）； 图2为云烟87和云烟97花粉代谢物无监督聚类分析图； 图3为云烟87和云烟97花粉代谢物的T检验结果火山图； 图4为烟草花粉极性代谢物的气相色谱质谱分析总离子流图； 图5为烟草花粉非极性代谢物的气相色谱质谱分析总离子流图。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以 限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0010] 本发明所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，包括样品前处 理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括： A、 样品前处理:将新鲜的烟草花粉样品置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到 冻干烟草花粉样本，于4 °C进行保存； B、 色谱质谱分离： 1) 极性代谢物的提取及衍生化:准确称取20.0 mg的冻干烟草花粉样本于1.5 mL离心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去离子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL内标溶液，超声，离 心，取下清液600此，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒温肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转 至气相色谱质谱仪分析，进样量1 yL; 2) 非极性代谢物的提取:准确称取100.0 mg冻干烟草花粉样本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 yL二氯甲烷复溶， 复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量1 yL; C、 代谢物结构鉴定:采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合 的方法进行化合物定性； D、 代谢物的定量分析:将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息， 具体计算公式如下：
其中，CjPCi分别代表代谢物X和内标的含量，yg/g; 八、和&分别代表代谢物X和内容的色谱峰面积； E、 数据分析:将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统 计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用 T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。
[0011] A步骤中研磨后的样品粒径为小于40目。
[0012] A步骤中冷冻干燥的真空度为0.18 mbar，温度为-6°C〇 [0013] B步骤1冲所述的内标溶液为100 yg/mL的对羟基香豆酸水溶液。
[0014] B步骤1)中超声的频率为25~45 kHz，时间为20~30 min。
[0015] B步骤1)中离心的离心力彡5000g。
[0016] B步骤1)中冻干机离心浓缩的真空度为0.18 mbar，温度为-6°C。
[0017] B步骤1)中所述的甲氧胺溶液的浓度为20 mg/ml。
[0018] B步骤2)中所述的内标溶液为100 yg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液;所述的离心的离 心力彡10000g。
[0019] B步骤中色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)，程 序升温条件为60°C保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;进样口温度为250 °C; 进样体积为1 yL;载气为氦气;柱流量为1.1 mL/min;分流比为20:1;质谱分析条件为:传输 线温度为230 °C;离子源温度210 °C;非极性代谢物的溶剂延迟时间为2 min，极性衍生化 样品的溶剂延迟时间为7 min;质量扫描范围为m/z 35-400;质谱扫描速度为5 Hz。
[0020]下面以盛开期烟草花的花粉为例进行分析，具体为： 1、样品前处理 1.1实验试剂及装置 甲醇（色谱级）购买于德国Merck公司；超纯水由Mi 11 ipore纯化系统制备。对羟基香豆 酸和桃醛（内标化合物)购买于百灵威公司；〇#轻质柴油（用于保留指数计算)购自当地加油 站。PE Clarus 600 GC-MS气相色谱质谱仪(美国PE公司）；SB-50D超声波提取仪(宁波新芝 生物科技股份有限公司）；DB-5 MS毛细管色谱柱（30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)(美国 Agilent公司）；MILLI-Q纯水机(MILLIP0RE公司）；LD5-2A离心机(北京京立离心机有限公 司）；CP2245分析天平(感量0.0001g，德国Sartorious公司）。
[0021] 1.2样品前处理 样品制备：将新鲜的烟草花粉样品放入研钵，加液氮冷冻，并迅速研磨粉碎（小于40 目）。磨好样品迅速转入冻干机进行冷冻干燥（真空度0.18 mbar，温度-6 °C，冻干时间72 h)，除去水分，置于4°C冰箱保存。
[0022]样品提取及衍生化:将烟草花粉中代谢物分为极性代谢物和非极性代谢物。其中 极性代谢物的提取和衍生化方法为:准确称取20.0 mg的冻干烟草花粉样本于1.5 mL离心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去离子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL内标溶液(对羟基香 豆酸水溶液100 yg/mL)，超声30 min，离心（离心力彡5000g)，取下清液600 yL，放入冻干机 (真空度0.18 mbar，温度-6 °C )离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 yL甲氧胺溶 液（20 mg/mL，吡啶溶液），37 °C恒温肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量1 yL。
[0023] 非极性代谢物的提取方法:准确称取100.0 mg冻干烟草花粉样本，加入4.9 mL二 氯甲烧和100 yL内标溶液(桃醛的二氯甲烧溶液，100 yg/mL)，超声30 min，离心(离心力彡 10000g)，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 yL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱 质谱仪分析，进样量1 yL。
[0024] 1.3色谱质谱分析条件 为方便极性代谢物与非极性代谢物对比，本方法中两种代谢物的色谱分离条件和质谱 分析条件基本相同（除溶剂切割时间），具体的色谱质谱条件如下： 色谱分析条件:色谱柱为DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)，程序升温条件为60 。(:保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;进样口温度为250 °C;进样体积为1 yL; 载气为氦气;柱流量为1.1 mL/min;分流比为20:1。
[0025] 质谱分析条件:传输线温度为230 °C ;离子源温度210 °C ;非极性代谢物的溶剂延 迟时间为2 min，极性衍生化样品的溶剂延迟时间为7 min;质量扫描范围为m/z 35-400;质 谱扫描速度为5 Hz。
[0026] 1.4代谢物的结构鉴定 由于代谢组学关注的是某种方法能检测到的所有代谢物的变化情况，而其中绝大多数 代谢物很可能是传统的代谢物分析中未关注的，因此对未知代谢物的结构鉴定是代谢组学 十分重要的研究内容。本实验采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相 结合的方法进行化合物定性。
[0027] 质谱去卷积和谱图库检索：由于气相色谱无法将所有代谢物彻底分离，因此气相 色谱质谱分析仪得到的某一时间点的质谱图实际上可能是几种化合物的质谱图的混合。本 实验采用AMDIS(V 2.7)软件进行质谱图去卷积和峰识别，获得去除了基质背景和重叠峰的 纯净质谱图。米用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib数据库、wileyregistry8e 数据库 和fiehn代谢组学数据库进行代谢物的初步结构定性。
[0028] 保留指数定性：由于代谢物在相同类型气相色谱柱上的保留指数相对稳定，本实 验采用保留指数进行辅助结构定性。具体方法为:将碳数连续的直链烷烃(〇#柴油）按照本 实验的色谱质谱方法进行分析，获得这些烷烃的保留时间，然后根据以下公式进行代谢物 的保留指数计算：
其中X指保留时间在碳数为η和n+1之间的某个代谢物的保留指数;η代表直链烷烃 的碳数;tx、tn、tn+1分别指代谢物X、碳数为η的直链烧烃、碳数为η+1的直链烧烃等的保留时间。
[0029] 标准化合物验证:对经质谱库和保留指数定性的化合物进行标准化合物验证。即 对标准化合物按照本实验的色谱质谱方法进行分析，将得到的保留时间和质谱图与烟草花 粉样品中待定化合物进行比对，如果两者均能吻合，则最终确定该化合物的定性结果。
[0030] 1.5代谢物的定量分析方法 由于无法或者难以获得所有代谢物的标准化合物，以及代谢组学通常无需绝对定量， 代谢物的定量分析采用相对定量的方法。即假设代谢物在检测器上的响应与内标物一致， 将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息。具体计算公式如下：
其中，Cx和Cl分别代表代谢物X和内标的含量，Αχ和Αι分别代表代谢物X和内标的色谱峰面积。 [0031] 1.6数据分析 将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果整合成一个Excel数据 表(峰表），峰表中某一个代谢物的定量信息被归入特定的一列（行），以便于多样本间代谢 物含量的统计分析。采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，研究样本之间的相 对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。
[0032]下面以具体实施案例对本发明做进一步说明： 实施例1 一一不同品种(云烟87和云烟97)烟草花粉代谢组学研究 实验材料:盛开期的云烟87和云烟97品种烟草花的花粉样本各6个，样品制备按照"样 品前处理"部分所描述方法进行。
[0033]实验方法： 极性代谢物的提取和衍生化方法为:准确称取20.0 mg的冻干烟草花粉样本于1.5 mL 离心管，加入370 yL甲醇、480 yL去离子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL内标溶液(对羟 基香豆酸水溶液100 yg/mL)，超声30 min，离心(离心力彡5000g)，取下清液600 yL，放入冻 干机(真空度0.18 mbar，温度-6°C)离心浓缩2小时，去掉溶剂，取出样品加入100 yL甲氧胺 溶液（20 mg/mL，吡啶溶液），37°C水浴加热90 min，加入80 yL MSTFA，37°C水浴30 min，衍 生完的样品转至气相色谱质谱分析仪分析，进样量1 yL。
[0034] 非极性代谢物的提取方法:准确称取100.0 mg的冻干烟草花粉样本，加入4.9 mL 二氯甲烧和100 yL内标溶液(桃醛的二氯甲烧溶液，100 yg/mL)，超声30 min，离心(离心力 彡10000g)，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 yL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色 谱质谱分析仪分析，进样量1 yL。
[0035] 色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)程序升温条件 为60°C保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;进样口温度为250 °C;进样体积为1 yL;载气为氦气;柱流量为1.1 mL/min;分流比为20:1。
[0036] 质谱分析条件:传输线温度为230 °C ;离子源温度210 °C ;非极性代谢物的溶剂延 迟时间为2 min，极性衍生化样品的溶剂延迟时间为7 min;质量扫描范围为m/z 35-400;质 谱扫描速度为5 Hz。采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方 法进行化合物定性。采用内标相对定量的方法进行定量。
[0037] 代谢物的结构鉴定:采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相 结合的方法进行化合物定性。采用AMDIS(V 2.7)软件进行质谱图去卷积和峰识别，获得去 除了基质背景和重叠峰的纯净质谱图。采用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib数据库、 wileyregistry8e数据库和fiehn代谢组学数据库进行代谢物的初步结构定性。采用保留指 数进行辅助结构定性。具体方法为:将碳数连续的直链烷烃(〇#柴油)按照本实验的色谱质谱 方法进行分析，获得这些烷烃的保留时间，然后根据以下公式进行代谢物的保留指数计算：
其中:RIX指保留时间在碳数为η和n+1之间的某个代谢物的保留指数;η代表直链烷烃的 碳数;tx、tn、tn+1分别指代谢物X、碳数为η的直链烷烃、碳数为η+1的直链烷烃等的保留时间。
[0038] 代谢物的定量分析：由于无法或者难以获得所有代谢物的标准化合物，以及代谢 组学通常无需绝对定量，代谢物的定量分析采用相对定量的方法。即假设代谢物在检测器 上的响应与内标物一致，将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息。具 体计算公式如下：
其中，Cx和&分别代表代谢物X和内标的含量，Αχ和六:分别代表代谢物X和内标的色谱 峰面积。
[0039] 数据分析:采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，研究样本之间的相 对关系研究，采用Τ检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。
[0040] 实验结果:实验结果列于表1、表2、图1、图2、图3中。从图1可以看出云烟87与云烟 97在主成分分析得分图（图1左）的二维平面上有明显的分离，说明这两种烟草的花粉代谢 物存在着明显的差异，而具体的差异代谢物在主成分分析得分图（图1右)上得到体现。
[0041] 对代谢物数据进行聚类分析（图2)发现，云烟97和云烟87两个品种形成两个明显 的聚类，而两个大类中个别样本间的层次关系也在图2中得到充分体现。
[0042]为了进一步找到和验证差异性代谢物，对所有代谢物进行Τ检验分析，将分析的到 的Ρ值和类间均值比（云烟87除以云烟97)做成火山图（图3)，取ρ值小于0.05,且均值比大于 2或小于0.5的代谢物在图中用黄色标出。从火山图上可以直观看到云烟87与云烟97两种烟 草花粉的显著差异性代谢物。
[0043]表1部分花粉代谢物的结构定性结果
表2部分花粉代谢物的相对定量分析峰表
【主权项】
1. 一种基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在于包括样品前处 理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括： A、 样品前处理:将新鲜的烟草花粉样品置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到 冻干烟草花粉样本，于4 °C进行保存； B、 色谱质谱分离： 1) 极性代谢物的提取及衍生化:准确称取20.0 mg的冻干烟草花粉样本于1.5 mL离心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去离子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL内标溶液，超声，离 心，取下清液600此，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒温肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转 至气相色谱质谱仪分析，进样量I yL; 2) 非极性代谢物的提取:准确称取100.0 mg冻干烟草花粉样本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 yL二氯甲烷复溶， 复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量I yL; C、 代谢物结构鉴定:采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合 的方法进行化合物定性； D、 代谢物的定量分析:将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息， 具体计算公式如下：其中，CjPCi分别代表代谢物X和内标的含量，yg/g; AjPA1*别代表代谢物X和内容的色谱峰面积； E、 数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统 计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用 T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。2. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于A步骤中研磨后的样品粒径为小于40目。3. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于A步骤中冷冻干燥的真空度为0.18 mbar，温度为-6 °C。4. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤1)中所述的内标溶液为100 yg/mL的对羟基香豆酸水溶液。5. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤1)中超声的频率为25~45 kHz，时间为20~30 min。6. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤1)中离心的离心力彡5000g。7. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤1)中冻干机离心浓缩的真空度为0.18 mbar，温度为-6°C。8. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤1)中所述的甲氧胺溶液的浓度为20 mg/ml。9. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤2)中所述的内标溶液为100 yg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液;所述的离心的离心力多 1000 Og010. 根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草花粉代谢组学分析方法，其特征在 于B步骤中色谱分析条件为:色谱柱为DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μL?)，程序升温 条件为60°C保持I min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;进样口温度为250 °C;进样体 积为I yL;载气为氦气;柱流量为I. I mL/min;分流比为20:1;质谱分析条件为:传输线温度 为230 °C ;离子源温度210 °C ;非极性代谢物的溶剂延迟时间为2 min，极性衍生化样品的 溶剂延迟时间为7 min;质量扫描范围为m/z 35-400;质谱扫描速度为5 Hz。
【文档编号】G01N30/02GK106018627SQ201610608837
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】李勇, 逄涛, 师君丽, 杨大海
【申请人】云南省烟草农业科学研究院