一种建立葵花盘hplc标准指纹图谱的方法
【专利摘要】本发明涉及一种建立葵花盘HPLC标准指纹图谱的方法，包括采用HPLC方法对多批次葵花盘的提取液进行检测，得到指纹图谱，然后采用软件对所述指纹图谱进行分析，得到葵花盘的标准指纹图谱的步骤；本发明标准指纹图谱建立过程中充分重视各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，通过对葵花盘提取物制备方法和HPLC液相条件的优化，使得到的标准指纹图谱能够有效、准确地表征葵花盘的质量，有利于全面监控葵花盘的质量，实现快速、准确鉴别产品真伪优劣的目的。
【专利说明】
一种建立葵花盘HPLC标准指纹图谱的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种建立葵花盘HPLC标准指纹图谱的建 立方法。
【背景技术】
[0002] 现在中药材产量越来越少，急待开发新的材料。葵花盘是向日葵脱去籽实后的向 日葵盘，是向日葵的副产品，产量约占向日葵籽实产量的20%，在向日葵主产区是一项巨大 资源。
[0003] 葵花盘治头痛，目昏，牙痛，胃、腹痛，妇女月经痛，疮肿。药理作用表明葵花盘的乙 醇浸出液对麻醉猫静脉注射，可有显著的降低血压作用。临床用药表明，取葵花盘适量，加 水煎成膏状，外敷对无名肿毒、风湿性关节炎、肩关节周围炎有一定疗效;取葵花盘晒干切 碎，炒焦，研末。用白酒或开水加糖冲服，可用于治疗乳腺炎；用葵花盘3两和凤尾草2两，水 杨梅(全草)2两，水煎1~2小时成半胶冻状，口服，对肿瘤有一定的疗效;且有动物实验证 明，葵花盘乙醇浸出液有显著的降压作用。
[0004] 指纹图谱技术已成为国际公认的控制重要或天然药物质量的最有效手段之一，它 可以较全面、准确、直观地反应多种成分在中药或其制剂中的分布，是一种综合的、宏观的、 可量化的鉴别方法。运用指纹图谱技术，通过对谱图中主要特征峰的识别和/或比例的测 定，可有效鉴别药材的真伪。但是，有关葵花盘的指纹谱图尚未见报道。
[0005] 因此，建立起葵花盘的指纹图谱方法，对于评价葵花盘的质量具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种建立葵花盘HPLC标准指纹图谱的方法，具体采用 如下技术方案：
[0007] 一种建立葵花盘HPLC标准指纹图谱的方法，包括采用HPLC方法对5-15个批次葵花 盘的提取物进行检测获得指纹图谱的步骤，所述HPLC方法以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱 柱填充剂，以乙腈为流动相A相，0.2-0.6%磷酸水溶液为流动相B相，按如下条件进行梯度 洗脱：
[0009]其中，所述梯度洗脱中，30
~35min，"9-80"代表的含义是，流动相A的比例由9 % 逐渐增加至80%，"91-20"代表的含义是，流动相B的比例由91%逐渐降低至20% ;其他时 间段的含义与之类似。
[0010]标准指纹图谱确定过程中，要充分注重各个构成指纹特征峰的前后顺序，相互关 系，以及整体面貌特征，发明人对葵花盘提取物的制备方法进行了大量研究，发现提取物的 制备方法对最终标准指纹图谱的形态有着很大的影响，具体而言，当只用水方法提取时，存 在着提取得到的成分过多，所得到的图谱色谱峰过多，峰与峰之间不能有效分离的问题；当 只以醇提取时，存在着部分成分不能有效被提取出来，所得到的图谱存在着色谱峰过少的 问题。此外，提取成分过多不利用于病人服用，提取成分过少则不能达到治疗目的。
[0011] 发明人经过研究，最终确定了如下葵花盘提取物的提取方法，即：先用水提取葵花 盘，然后用乙醇沉淀所得的提取液，取上清液浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得。
[0012] 以采用此种方法提取得到的物质作为供试品进行检测，最终得到的标准指纹图谱 中各特征指纹峰的前后峰之间能有效分离，符合检验要求，该标准指纹图谱能够更加准确 地表征葵花盘的质量，有利于全面监控产品的质量，为药品的质量检测提供可靠的依据。且 本发明所述的方法具有操作简单，色谱峰之间分离度符合要求的特点。
[0013] 优选地，所述葵花盘的提取物通过如下方法提取得到:粉碎葵花盘至粒径为0.5-1.5cm，加入相当于葵花盘重量8-10倍的水，提取2-4次，每次l-3h，浓缩提取液，向所得浓缩 液中加入乙醇沉淀，离心，取上清液，除去乙醇浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得。
[0014] 进一步优选地，所述葵花盘的提取物通过如下方法提取得到:取葵花盘，粉碎至粒 径为lcm，分别加入相当于葵花盘重量10、8、8倍的水，提取3次，每次2小时；分别滤过，合并 滤液，浓缩至相对密度1.06(20°C )，加乙醇使含醇量为65%，静置24小时，离心，取上清液， 除去乙醇浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得。
[0015] 其中，所述"含醇量"指的乙醇在溶液中的体积百分数。
[0016] 本发明所述的HPLC方法采用紫外检测器，检测波长为320-330nm;和/或，流速为 0 · 8-1 · 2mL/min;和/或，柱温为28-32 °C。
[0017] 优选地，检测波长为327nm，流速为1 · OmL/min，柱温为30°C。
[0018] 最优选地，本发明建立所述标准指纹图谱的方法包括如下步骤：
[0019] (1)供试品溶液的制备:称取5-15个批次的葵花盘提取物，分别以甲醇为溶剂，配 制成浓度为10_50mg/mL的供试品溶液；
[0020] (2)HPLC测定:采用如下HPLC方法对5-15个所述供试品溶液进行检测，得到指纹图 谱；
[0021 ]以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以乙腈为流动相A相，0.4%磷酸水溶 液为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱;紫外检测波长为327nm，流速为1 .OmL/min，柱温 为 30°C;
[0023] (3)标准指纹图谱的建立:采用软件对步骤(2)的指纹图谱进行分析，得到葵花盘 的标准指纹图谱。
[0024]其中，所述批次的个数优选为10个。
[0025]所述软件可采用本领域常用的软件，本发明优选采用中国药典委员会推荐的中药 色谱指纹图谱相似性评价系统软件。
[0026] 本发明的第二个目的是提供上述任意一种方法建立得到的葵花盘HPLC标准指纹 图谱。
[0027] 所述标准指纹图谱由9个共有峰构成，按照保留时间由小到大排序，各共有峰与第 7个保留时间对应的峰的相对保留时间分别为:第1号峰:0.16±5% ;第2号峰:0.21 ±5% ; 第3号峰:0.29±5%;第4号峰:0.52±5%;第5号峰:0.55±5% ;第6号峰:0.79±5%;第7号 峰：1.00;第8号峰：1.21±5% ;第9号峰：1.28±5%。
[0028] 其中，所述第7个保留时间对应的峰为绿原酸峰。本发明以绿原酸作为对照品，以 指纹图谱中绿原酸对应的峰为参照峰，计算其他共有峰相对于绿原酸峰的相对保留时间。 指纹图谱中绿原酸峰通过对照品溶液进行定位，其中所述对照品溶液的配制方法是将绿原 酸溶于甲醇中，配制成浓度为10_30yg/mL的溶液，采用与测定供试品溶液相同的HPLC方法 进行测定。
[0029]本发明的第三个目的是提供一种检测葵花盘质量的方法，具体为:首先，建立葵花 盘HPLC标准指纹图谱;其次，采用与建立标准指纹图谱相同的HPLC方法对待测葵花盘的提 取物进行检测，获取指纹图谱；最后，对所述指纹图谱和葵花盘HPLC标准指纹谱图进行分 析，二者相似度大于〇. 95为合格产品，小于等于0.95为不合格产品。
[0030]其中，葵花盘HPLC标准指纹图谱的建立方法可按照上述任意一种方法进行。待测 葵花盘的提取物可按照前文任一项所述的方法提取。
[0031 ]最优选地，检测葵花盘质量的方法包括如下步骤：
[0032] (1)供试品溶液的制备:粉碎葵花盘至粒径为0.5-1.5cm，加入相当于葵花盘重量 8-10倍的水，提取2-4次，每次l_3h，浓缩提取液，向所得浓缩液中加入乙醇沉淀，离心，取上 清液，除去乙醇浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得葵花盘提取物；向所述葵花盘提取物中加入甲 醇，配制成浓度为10_50mg/mL的供试品溶液；
[0033] (2) HPLC测定:采用HPLC方法对按照步骤（1)所述方法制备得到的5-15个批次的供 试品溶液进行检测，得指纹图谱；
[0034]所述HPLC法以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以乙腈为流动相A相， 0.2 % -0.6 %磷酸水溶液为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：
[0036] (3)标准指纹图谱的建立:采用软件对步骤(2)的指纹图谱进行分析，生成葵花盘 HPLC标准指纹图谱；
[0037] (4)待测样品指纹图谱的获得:按照步骤（1)的操作对待测葵花盘进行处理，制取 待测样品溶液，按照与步骤(2)相同的HPLC法对所述待测样品溶液进行检测，得到待测葵花 盘的指纹图谱；
[0038] (5)质量判断:采用软件对待测葵花盘的指纹图谱和葵花盘HPLC标准指纹谱图进 行分析，相似度大于〇. 95为合格产品，小于等于0.95为不合格产品。
[0039] 其中，所述的软件优选为中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件。
[0040] 本发明的质量检测方法能够有效地监控葵花盘的质量，保证其质量的稳定、均一、 可控，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别产品的真 伪优劣。
【附图说明】
[0041 ]图1为绿原酸的液相色谱图；
[0042]图2为10个批次葵花盘提取物的液相色谱图；
[0043]图3为葵花盘HPLC标准指纹图谱；
[0044] 图1-3中，横坐标为响应时间(min)，纵坐标为响应强度(单位:UV)。
【具体实施方式】
[0045] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0046] 以下实施例中涉及到的葵花盘的提取物均是通过如下方法提取得到的：取葵花 盘，粉碎至粒径为lcm，分别加入相当于葵花盘重量10、8、8倍的水，提取3次，每次2小时，分 别滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.06(20°C)，加乙醇使含醇量为65%，静置24小时，离 心，取上清液，除去乙醇浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得。
[0047] 实施例中使用的液相色谱仪为岛津LC-20A高效液相色谱仪(二元高压梯度栗，在 线脱气机，柱温箱(柱温30°C)，自动进样器，紫外检测器）。
[0048] 采用的绿原酸对照品购自中国药品生物制品鉴定所，液相色谱分析用试剂为色谱 纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
[0049 ]实施例1葵花盘HPLC标准指纹图谱的建立
[0050] (1)供试品溶液的制备：称取葵花盘提取物0.55g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲 醇40ml，超声处理(功率300W，频率25kHz )45分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤 液，即得(避光保存）。
[0051] (2)HPLC测定:采用如下HPLC方法对10个所述供试品溶液进行检测，得到指纹图谱 (如图2所示）；
[0052] 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Ci8(5ym，4.6X250mm)，以乙腈为流动相A相，0.4% 磷酸水溶液为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱;紫外检测波长为327nm，流速为1. OmL/ min，柱温为30°C;
[0054] (3)标准指纹图谱的建立:采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对步骤(2) 的指纹图谱进行分析，确定共有特征峰，得到葵花盘的标准指纹图谱(如图3所示）。
[0055] 本申请的标准指纹图谱以绿原酸作为参照品，其中，绿原酸对照品溶液是将绿原 酸溶于甲醇中配制成浓度为20yg/mL的溶液，然后采用上述步骤(2)的条件进行检测，得到 对照品的液相色谱图（如图1所示）。然后，以标准指纹图谱中绿原酸峰为参照峰，计算得到 了其他各共有峰相对于绿原酸峰的相对保留时间。葵花盘HPLC标准指纹图谱中各共有峰的 保留时间、相对保留时间和峰面积如表1所示：
[0056]表1葵花盘HPLC标准指纹图谱中共有峰的保留时间、相对保留时间和峰面积
[0058]实施例2葵花盘的质量评价方法
[0059] (1)待测样品溶液的制备:取3批待测葵花盘，按照前述方法制备得到待测葵花盘 提取物，分别取lg葵花盘提取物，至具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率 250W，频率25kHz)45分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤 液，即得待测样品溶液(避光保存）；
[0060] (2)待测样品指纹图谱的获得:采用与实施例1步骤(2)相同的HPLC方法对步骤(1) 的3个样品进行检测，得指纹图谱；
[0061] (3)质量判断:采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对实施例1得到的标准 指纹图谱和待测样品的指纹图谱进行分析，相似度分别为0.985、0.994、0.989，均为合格产 品。
[0062]方法学评价方法 [0063] 精密度
[0064] 实验方法:对照品溶液的制备：取绿原酸对照品7.027mg，精密称定，置100ml量瓶 中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至 刻度。连续进行6次，记录色谱图，结果如表2所示。
[0065]表2:精密度实验结果
[0067]实验结果：由上述试验可知，该分析方法，对绿原酸的含量测定中间精密度良好， 满足其检测要求。
[0068] 稳定性
[0069]实验方法：供试品溶液的制备：称取葵花盘提取物0.55g，精密称定，置50ml量瓶 中，加甲醇40ml，超声处理(功率300W，频率25kHz)45分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过， 取续滤液，即得(避光保存）。
[0070] 分别在0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时，12小时，24小时吸取?ομL注入液 相色谱仪中，记录色谱图。结果如表3所示：
[0071] 表3:溶液稳定性试验结果
[0073] 实验结果：由上可知，此分析方法对葵花盘粉中绿原酸峰面积稳定性良好。
[0074] 重复性
[0075] 实验方法:对照品溶液的制备：取绿原酸对照品7.027mg，精密称定，置100ml量瓶 中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至 刻度。
[0076] 供试品溶液的制备：取装量差异项下内容物，混匀，称取0.55g，精密称定，置50ml 量瓶中，加甲醇40ml，超声处理(功率300W，频率25kHz )45分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，即得(避光保存）。
[0077] 分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，测定，记录色谱 图。结果如表4所示：
[0078] 表4:重复性实验结果
[0081]实验结果：由上述试验可知，该分析方法，对葵花盘粉中绿原酸的峰面积重复性良 好，满足其检测要求。
[0082]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种建立葵花盘HPLC标准指纹图谱的方法，其特征在于：包括采用HPLC方法对5-15 批次葵花盘的提取物进行检测获得指纹图谱的步骤； 所述HPLC方法以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以乙腈为流动相A相，0.2 % - 0.6 %磷酸水溶液为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葵花盘的提取物通过如下方法提取得 到:用水提取葵花盘，用乙醇沉淀所得的提取液，取上清液浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葵花盘的提取物通过如下方法提 取得到:粉碎葵花盘至粒径为〇. 5-1.5cm，加入相当于葵花盘重量8-10倍的水，提取2-4次， 每次l-3h，浓缩提取液，向所得浓缩液中加入乙醇沉淀，离心，取上清液，除去乙醇浓缩成稠 膏，干燥，粉碎，即得； 优选地，加入乙醇使其在溶液中的体积百分含量为60-70 %。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于:所述HPLC方法采用紫外检测器， 检测波长为320-330nm;和/或，流速为0.8-1.2mL/min;和/或，柱温为28-32 °C。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 供试品溶液的制备:称取5-15批次葵花盘的提取物，分别以甲醇为溶剂，配制成浓 度为10-50mg/mL的供试品溶液； (2) HPLC测定:采用如下HPLC方法对5-15个所述供试品溶液进行检测，得到指纹图谱； 以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以乙腈为流动相A相，0.4%磷酸水溶液为 流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱;紫外检测波长为327nm，流速为I .OmL/min，柱温为30 °C；(3) 标准指纹图谱的建立:采用软件对步骤(2)的指纹图谱进行分析，得到葵花盘的标 准指纹图谱； 优选地，所述软件为中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件。6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述批次的数量为10个。7. 权利要求1-6任一项所述的方法建立得到的葵花盘HPLC标准指纹图谱，其特征在于， 所述葵花盘HPLC标准指纹图谱由9个共有峰构成，按照保留时间由小到大排序，各共有峰与 第7个保留时间对应的峰的相对保留时间分别为：第1号峰：0.16 ± 5 % ;第2号峰：0.21 土 5% ;第3号峰：0.29±5% ;第4号峰：0.52±5% ;第5号峰：0.55±5% ;第6号峰：0.79±5% ; 第7号峰：1.00;第8号峰：1.21 ±5%;第9号峰：1.28±5%。8. 根据权利要求7所述的葵花盘HPLC标准指纹图谱，其特征在于:所述第7号峰对应的 物质为绿原酸。9. 一种检测葵花盘质量的方法，其特征在于：首先，建立葵花盘HPLC标准指纹图谱；其 次，采用与建立标准指纹图谱相同的HPLC方法对待测葵花盘的提取物进行检测，获取指纹 图谱;最后，对所述指纹图谱和葵花盘HPLC标准指纹谱图进行分析，二者相似度大于0.95为 合格产品，小于等于0.95为不合格产品。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 供试品溶液的制备:粉碎葵花盘至粒径为0.5-1.5cm，加入相当于葵花盘重量8-10 倍的水，提取2-4次，每次l-3h，浓缩提取液，向所得浓缩液中加入乙醇沉淀，离心，取上清 液，除去乙醇浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得葵花盘提取物；向所述葵花盘提取物中加入甲 醇，配制成浓度为10_50mg/mL的供试品溶液； (2) HPLC测定:采用HPLC方法对按照步骤（1)所述方法制备得到的5-15个批次的供试品 溶液进行检测，得指纹图谱； 所述HPLC方法以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以乙腈为流动相A相，0.2 % - 0.6 %磷酸水溶液为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：(3) 标准指纹图谱的建立:采用软件对步骤(2)的指纹图谱进行分析，生成葵花盘HPLC 标准指纹图谱； (4) 待测样品指纹图谱的获得:按照步骤（1)的操作对待测葵花盘进行处理，制取待测 样品溶液，按照与步骤(2)相同的HPLC法对所述待测样品溶液进行检测，得到待测葵花盘的 指纹图谱； (5) 质量判断：采用软件对待测葵花盘的指纹图谱和葵花盘HPLC标准指纹谱图进行分 析，相似度大于〇. 95为合格产品，小于等于0.95为不合格产品； 优选地，所述软件为中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件。
【文档编号】G01N30/88GK106018647SQ201610541603
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】丁爱英, 李艳茹, 张颖, 陈卓, 王珊珊
【申请人】吉林益民堂制药有限公司