一种食品中毒黄素的快速检测方法
【专利摘要】本发明开发了一种基于固相萃取?高效液相色谱法，快速检测食品中毒黄素残留的方法。食品样品采用纯水溶解、超声提取，以固相萃取小柱(HLB)对样品进行净化、实现目标分析物毒黄素的富集，通过体积分数为80％的甲醇水溶液作为洗脱液对固相萃取小柱进行洗脱，并经N2吹干，水溶解定容后得到上机液。该前处理条件实现了检测样品中毒黄素残留时，有效减少了干扰化合物对毒黄素准确定量的影响、消除了溶剂效应对毒黄素色谱行为的不利影响。流动相以甲醇和水梯度洗脱,增强了毒黄素在反相色谱柱中的保留，实现了样品色谱分析时毒黄素与其他干扰物的有效分离，从而达到准确定量分析的目的。该发明检测成本低，有毒试剂无消耗对环境友好，方法准确性好、灵敏度高、结果重现性好，适用于多种食品中毒黄素残留检测。
【专利说明】
一种食品中毒黄素的快速检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品安全技术领域，尤其涉及一种食品中毒黄素的快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 毒黄素(toxoflavin)(CAS: 84-82-2)的结构式为：
[0004] 它是由椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的一种可引起食物中毒的细菌毒素。常见的 污染食品主要为谷类发酵制品、薯类制品及银耳等。椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒多 发生在夏秋(主要5~8月）阴雨潮湿的季节，因食物储存不当而引发椰毒假单胞菌快速繁殖 生长，食用受其污染的食物会引发中毒，表现为上腹不适、恶心、呕吐、头晕及全身无力等症 状，严重可出现肝脾肿大、皮下出血、血尿及休克等，死亡率高达40~100%。多年来关于椰 毒假单胞菌中毒引发多起死亡的报道较多，最早发现于1953年酵米面引起的食物中毒，后 陆续在全国各地均发现有椰毒假单胞菌引起的食物中毒事件。2014年广南"吊浆粑"椰毒假 单胞菌食物中毒事件就引发多人死亡，2015年春节辽阳发生酸汤子中毒事件，疑因米酵菌 酸和毒黄素中毒致4人死亡。
[0005] 目前，关于毒黄素的检测方法，尚无相应的国家标准或行业标准。近年来国内外关 于食品中毒黄素检测技术的研究，也鲜有报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有检测技术的不足，提供了一种食品中毒黄素的快速检 测方法。本发明能够检测谷类发酵制品（包括发酵玉米面、糯米粉、吊浆粑、玉米淀粉、醋凉 粉等）、银耳及其制品、薯类制品（如马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)等食品中毒黄素残 留。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种食品中毒黄素的快速检测方 法，包括以下步骤：
[0008] (1)样品提取条件:称取20~25g样品和100mL蒸馏水混合后，超声提取20min，取提 取液，5000r/min离心5min，得到上清液。
[0009] (2)样品净化:取步骤1获得的上清液5 . OmL，过HLB(6cc，200mg)小柱进行净化(上 样前，小柱分别用5mL甲醇和5mL水进行活化）；净化后，将小柱用5mL水淋洗，挤干，弃去全部 流出液。然后用5. OmL体积分数为80 %的甲醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用N2 吹干，再1. OmL纯水定容，涡旋溶解后得到上机液。
[0010] (3)色谱分析条件：将步骤2获得的上机液经配有DAD检测器的四元低压或二元高 压液相色谱系统进行色谱分析，色谱柱:0DS反相色谱柱(例如0DS C18)，250*4.6mm，5μπι;流 动相为：甲醇与水梯度洗脱，体积比为(0~l〇min，7:93;10.1~20min，98:2;20.1~27min， 7:93);进样量:20μ1;流速：1. OmL/min;柱温:30 °C。检测波长:258nm。
[0011] (4)样品定性分析:根据步骤3色谱分析得到的保留时间及特征光谱图，与标样的 保留时间及特征光谱图进行比对，若两者吻合，则表明含有毒黄素。
[0012] (5)样品定量分析:标样配制:将毒黄素溶于水，配制成浓度分别为0.05,0.1，0.2， 0.4,1.0,2.0,5.0,10.0 μg/ml系列标准使用液。以标样响应峰面积作为纵坐标，标样浓度为 横坐标(μg/ml)，绘制校正曲线。根据步骤3色谱分析获得的响应峰面积，采用外标法，对样 品中毒黄素含量进行定量分析。
[0013]进一步地，所述浓度分别为 0.05,0.1，0.2,0.4，1.0,2.0,5.0，10.0μg/ml 系列标准 使用液的配制方法如下:称取O.OlOOg毒黄素标准品于l〇ml容量瓶中，甲醇溶解后，定容至 刻度，配制成l.〇mg/ml标准母液。放置于-18°C冰箱中，可以保存3个月。使用前，取出放置室 温后，取200yL标准母液于10ml容量瓶中，水定容至刻度，摇匀，配制成20.0μg/ml的中间使 用液。分别取25yL，50yL，100yL，200yL，500yL，1. OmL中间使用液以及50yL，100yL标准母液 于lOmL容量瓶中，水定容至刻度，
[0014]进一步地，所述检测食品为谷类发酵制品（包括发酵玉米面、糯米粉、吊浆粑、玉米 淀粉、醋凉粉等）、银耳及其制品、薯类制品（如马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)等。
[0015] 本发明的有益效果是，采用一种检测成本低、净化效果及回收率能够满足检测要 求的固相萃取技术，通过优化前处理过程中提取条件(提取溶剂及提取时间）和净化富集步 骤中洗脱条件，选择80%甲醇水(体积比）作为毒黄素的洗脱液，实现了目标物毒黄素的有 效洗脱，减少了强极性杂质成分在色谱分析中对毒黄素的干扰。另外，本发明对色谱条件进 行了改进，建立了以甲醇和水梯度洗脱为流动相有效实现了样品检测时目标分析物毒黄素 与其他干扰组分的分离。本发明在实际检测中，无有毒试剂消耗对环境友好，检测成本低， 灵敏度好，易于推广应用，并适用于多种食品样品中毒黄素残留分析。
【附图说明】
[0016] 图 1 为标样的校正曲线（Y= 142529 ·9χ+12501· 41，R2 = 0.9998，R=0.9999);
[0017] 图2为毒黄素标样色谱图（保留时间为10.785min);
[0018] 图3为毒黄素光谱图；
[0019] 图4为80%甲醇水溶解毒黄素的色谱图；
[0020] 图5为90%甲醇溶解毒黄素的色谱图；
[0021] 图6为100%甲醇溶解毒黄素的色谱图；
[0022]图7为发酵玉米面样品色谱图（阴性）；
[0023]图8为发酵玉米面样品光谱图（对应保留时间为10.637min);
[0024] 图9为体积分数80%的乙腈水为提取溶剂时的色谱图；
[0025] 图10为体积分数10%甲醇水为提取溶剂时的色谱图（过柱后的流出液a及洗脱液 b)；
[0026] 图11为添加水平为0.2mg/kg的发酵玉米面色谱图；
[0027]图12为添加水平为0.5mg/kg的发酵玉米面色谱图；
[0028]图13为添加水平为1.5mg/kg的发酵玉米面色谱图；
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0030] 实施例1:绘制响应峰面积-毒黄素浓度的校正曲线。
[0031] (1)称取O.OlOOg毒黄素标准品于10mL容量瓶中，甲醇溶解后，定容至刻度，配制成 1.0mg/mL标准母液。放置于-18°C冰箱中，可以保存3个月。使用前，取出放置室温后，取200μ L标准母液于10mL容量瓶中，水定容至刻度，摇勾，配制成20.0μg/ml的中间使用液。分别取 2541^，5(^1^10(^1^20(^1^，50(^1^，1.011^中间使用液以及5(^1^，10(^1^标准母液于101111容量 中，水定容至刻度。配制成浓度分别为0.05,0.1，0.2,0.4，1.0,2.0,5.0，10.0μg/ml系列标 准使用液。
[0032]同时，该部分对定容溶液进行了优化，比较了体积分数80 %的甲醇水溶液（附图 4)、90%甲醇水溶液(附图5)、100%甲醇(附图6)在色谱分析中对毒黄素色谱行为的影响， 发现在定容溶液中甲醇体积分数80 %以上时，在色谱分析时，毒黄素色谱峰形成两个分叉 峰。从结构式分析，毒黄素为中等极性化合物，溶剂效应强，采用强极性水作为定容溶剂可 消除毒黄素的溶剂效应从而形成尖锐的对称色谱峰。由于毒黄素酸性条件下(pH〈2时)不稳 定，本研究部分在流动相条件及定容溶液中均未采用有机酸。
[0033] (2)以标样响应峰面积作为纵坐标，标样浓度为横坐标(μg/ml )，绘制校正曲线。如 图1所示。保留时间如图2所示，特征光谱图如图3所示。
[0034]实施例2:本实施例通过以下方法检测发酵玉米面中的毒黄素：
[0035] (1)样品提取条件：称取20~25g发酵玉米面和100mL蒸馏水混合后，超声提取 20min，取提取液，5000r/min离心5min，得到上清液。
[0036] (2)样品富集、净化:取步骤1获得的上清液5. OmL，过HLB(6cc，200mg)小柱净化(上 样前，小柱分别用5mL甲醇和5mL水进行活化）；待样品流完后，将小柱用5mL水淋洗，挤干，弃 去全部流出液。然后用5. OmL体积分数为80 %的甲醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱 液用N2吹干，再1. OmL纯水定容，涡旋溶解后得到上机液。
[0037] (3)色谱分析条件:将步骤2获得的上机液经配有DAD检测器的四元低压或二元高 压液相色谱系统进行色谱分析，色谱柱:0DS反相色谱柱(例如0DS C18)，250*4.6mm，5μπι;流 动相为：甲醇与水梯度洗脱（（〇~1〇11^11，7:93 ;10.1~2〇1^11，98:2;20.1~271^11，7:93) ;进 样量:20yL;流速：1. OmL/min;柱温：30 °C。检测波长:258nm。
[0038] 该部分对流动相条件进行了优化，比较了流动相中加入一定比例的乙酸时对毒黄 素色谱保留的影响。乙酸属强极性有机酸，流动相中加入乙酸相当于增强了流动相的极性， 从而减少了毒黄素在反相色谱柱中的保留时间，不利于样品分析时毒黄素和干扰化合物的 分离。本部分采用甲醇:水梯度洗脱流动相，有利于中等极性化合物毒黄素和其他干扰化合 物的有效分离，从而达到准确定量的目的。
[0039] (4)样品定性分析:根据步骤3色谱分析，得到的保留时间如图7所述，特征光谱图 如图8所示，与实施例1获得的标样的保留时间（图2)及特征光谱图（图3)进行比对后发现， 本实施例中检测的发酵米面特征光谱图（图8)与标样的特征光谱图（图3)不吻合，表明不含 有毒黄素。
[0040] 实施例3:本实施例在实施例2中，同时通过玉米面中加入毒黄素标准品制备阳性 发酵玉米面样品一份，并用相同方法进行检测。其中步骤1中，本部分对提取试剂进行了试 验，选择了蒸馏水、不同体积分数甲醇水（10 %，20 %，40 %，60 %，80 % )、不同体积分数乙腈 水（10%，20%，40%，60%，80% )对阳性样品发酵玉米面的提取效率进行了比较，在实施本 部分试验时，直接移取提取后得到的上清液3.0ml通过N2吹干浓缩后上机分析(未通过固相 萃取小柱净化，从而排除小柱回收率的影响）。结果发现，采用蒸馏水提取、乙腈水体积分数 为80% (附图9)以及甲醇水体积分数10% (附图10)时，提取效率最高。具体结果见表1所示。 但在提取溶剂中加入有机溶剂时，一方面样品中脂溶性物质如色素等干扰组分较大，另一 方面采用固相萃取小柱净化时，毒黄素难被保留，无法实现净化或富集的目的。因此，本部 分经试验后采用蒸馏水作为提取溶剂，为后续的研究提供了可行性。
[0041]表1不同提取溶剂提取时测得的毒黄素含量(以峰面积表示）
[0043] 实施例4:本实施例在实施例3中，同时对步骤1研究了超声提取时间对提取效率的 影响。采用阳性样品发酵玉米面，以蒸馏水作为提取溶剂，选择了超声时间〇min，5min， lOmin，20min，30min，40min，通过与步骤2固相萃取小柱结合，分析了超声提取时间的影响。 发现超声提取20min时能够实现目标分析物毒黄素的有效提取。具体结果见表2所示。
[0044] 表2超声提取时间对毒黄素提取效率的影响（以峰面积表示）
[0046] 实施例5:本实施例在实施例2中，对步骤2洗脱溶剂分别采用体积分数为5%、 10%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行洗脱。采用浓度为2 .Oyg/mL的毒黄素 标准溶液5. OmL过固相萃取小柱，以上述体积分数的甲醇水(各取5.0ml)分别进行洗脱，不 同洗脱条件下测得的峰面积如表3所示。其中以100%甲醇洗脱后得到的甲醇溶液，经N2吹 干后，采用5. OmL水溶解后进行分析。
[0047] 表3不同洗脱溶剂对洗脱效率的影响（以峰面积表示）
[0050]从上表可以看出，当洗脱溶剂为甲醇体积分数80%时，可以实现毒黄素的充分洗 脱。
[0051 ]实施例6:本实施例在实施例2的发酵玉米面中分别加入0.2mg/kg(图11)、0.5mg/ kg(图12)及1.5mg/kg(图13)毒黄素，并用相同方法进行检测，每个添加浓度采用平行测定6 份样品，考察不同添加浓度的加标回收率、精密度及本方法的检出限。
[0052] 根据色谱分析获得的响应峰面积，采用外标法，结合图1，对样品中毒黄素含量进 行定量分析，测得的结果如表4所示。本方法回收率为75%以上，精密度小于3%。经多次重 复测定发现，该方法准确性高，稳定性好，以信噪比（S/N)不低于3计算该方法的检出限为 0.2mg/kg〇
[0053] 表4发酵玉米面中不同添加水平回收率及精密度测定(n = 6)
【主权项】
1. 一种食品中毒黄素的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品提取条件：称取20~25g样品和lOOmL蒸馏水混合后，超声提取20min，取提取 液，5000r/min离心5min，得到上清液。 (2) 样品净化:取步骤1获得的上清液5. OmL，过HLB (6cc，200mg)小柱进行净化(上样前， 小柱分别用5mL甲醇和5mL水进行活化）；净化后，将小柱用5mL水淋洗，挤干，弃去全部流出 液。然后用5. OmL体积分数为80 %的甲醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用N2吹干， 再1. OmL纯水定容，涡旋溶解后得到上机液。 (3) 色谱分析条件:将步骤2获得的上机液经配有DAD检测器的四元低压或二元高压液 相色谱系统进行色谱分析，色谱柱:0DS反相色谱柱(例如ODS C18)，250*4.6mm，5μπι;流动相 为：甲醇与水梯度洗脱，体积比为（〇~l〇min，7 :93;10.1~20min，98:2;20.1~27min，7: 93);进样量:20μ1;流速：1. OmL/min;柱温：30 °C。检测波长:258nm。 (4) 样品定性分析:根据步骤3色谱分析得到的保留时间及特征光谱图，与标样的保留 时间及特征光谱图进行比对，若两者吻合，则表明含有毒黄素。 (5) 样品定量分析:标样配制:将毒黄素溶于水，配制成浓度分别为0.05,0.1，0.2,0.4， 1.0. 2.0.5.0.10.0μg/ml系列标准使用液。以标样响应峰面积作为纵坐标，标样浓度为横坐 标(μg/ml)，绘制校正曲线。根据步骤3色谱分析获得的响应峰面积，采用外标法，对样品中 毒黄素含量进行定量分析。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述浓度分别为0.05,0.1，0.2,0.4， 1.0. 2.0.5.0.10.0μg/ml系列标准使用液的配制方法如下：称取0.0100g毒黄素标准品于 l〇ml容量瓶中，甲醇溶解后，定容至刻度，配制成1.0mg/ml标准母液。放置于-18°C冰箱中， 可以保存3个月。使用前，取出放置室温后，取200yL标准母液于10ml容量瓶中，水定容至刻 度，摇匀，配制成20 · 0μg/ml的中间使用液。分别取25yL，50yL，100yL，200yL，500yL，1 · OmL中 间使用液以及50yL，100yL标准母液于1 OmL容量瓶中，水定容至刻度。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测食品为谷类发酵制品（包括 发酵玉米面、糯米粉、吊浆粑、玉米淀粉、醋凉粉等）、银耳及其制品、薯类制品（如马铃薯粉 条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)等。
【文档编号】G01N30/89GK106018659SQ201610301876
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月7日
【发明人】李红艳, 翁晨辉, 黄海智, 沈潇冰, 盛华栋, 张东雷, 张慧, 王瑾
【申请人】浙江省质量检测科学研究院