一种降钙素、叶酸、维生素d联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体公开了一种降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括塑料板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、样本垫和吸水垫，所述玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的降钙素抗体、叶酸抗体和25羟基维生素D3抗体的混合物；硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，检测线1上包被有降钙素二抗，检测线2上包被有叶酸二抗，检测线3上包被有25羟基维生素D3抗原，控制线上包被有羊抗鼠lgG。该试剂盒，利用双抗体/抗原夹心原理以及竞争法检测原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法对降钙素、叶酸和维生素D进行快速、灵敏的联合检测。
【专利说明】
一种降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用免疫层析试剂盒及其 制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种降钙素、叶酸、维生素D联合检 测用免疫层析试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 降钙素是甲状腺的滤泡旁细胞（明亮细胞或C细胞)产生和分泌，它由32个肽组成。 主要生理功能是降低血钙、血磷的水平。血浆中钙离子浓度过高，胃泌素(gastrin)和五肽 胃泌素(Pentagastrin)的升高可促进降钙素的分泌。降钙素影响了钙离子和磷酸盐的代谢 过程，其功能多半是拮抗甲状旁腺素的作用。健康男性血浆中降钙素的平均浓度为〇~ 14ng/L，女性血浆中降钙素的平均浓度为0~28ng/L。临床研究发现患有恶性肿瘤，如燕麦 细胞癌、肺癌、胰腺癌、子宫癌、前列腺癌，某些异位内分泌综合征，严重骨病，肾脏疾病、嗜 铬细胞瘤等疾病是会出现血浆中降钙素升高，而且通过血浆中降钙素的浓度对起源于滤泡 旁细胞的甲状腺髓样癌的诊断、判断手术疗效和观察术后复发等有重要意义。另外，临床上 甲状腺手术切除、重度甲状腺功能亢进的病患，会出现血浆中降钙素浓度降低。
[0003] 叶酸(f〇1 ic acid)也叫维生素B9，是一种水溶性维生素。叶酸由蝶啶、对氨基苯甲 酸和L-谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸，它是B族维生素的一种。它在被发现后曾被命名为:维 生素M、维生素Bc、R因子等，1941年，因为从菠菜中发现了这种生物因子，所以被命名为叶 酸。叶酸富含于新鲜的水果、蔬菜、肉类食品中，食物中的叶酸若经长时间烹煮，可损失50% ~90 %。叶酸主要在十二指肠及近端空肠部位吸收，人体内叶酸储存量为5~20mg，叶酸主 要经尿和粪便排出体外，每日排出量为2~5ug。叶酸是水溶性的维生素，一般超出成人最低 需要量20倍之内也不会引起中毒。但凡超出的叶酸的量均从尿中排出。天然叶酸广泛存在 于动植物类食品中，尤以酵母、肝及绿叶蔬菜中含量比较多。
[0004] 临床研究表明叶酸在体内以四氢叶酸的形式起作用，具有如下生理功能：
[0005] 1)作为体内生化反应中一碳单位转移酶系的辅酶，起着一碳单位传递体的作用；
[0006] 2)作为辅酶参与核酸合成中嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步合成DNA和RNA;
[0007] 3)参与氨基酸代谢，参与二碳氨基酸和三碳氨基酸相互转化，在甘氨酸与丝氨酸、 组氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化过程中充当一碳单位的载体；
[0008] 4)参与血红蛋白及甲基化合物如肾上腺素、胆碱、肌酸等的合成:人体缺少叶酸可 导致红血球的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白血球减少；
[0009] 5)帮助蛋白的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球 不可缺少的物质；
[0010] 6)也作为干酪乳酸菌及其他微生物的促进增殖因子而起作用；
[0011] 7)是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现 低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。如果在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可引起胎儿神经管发育缺 陷，而导致畸形。因此，准备怀孕的女性，可在怀孕前就开始每天服用100微克到300微克叶 酸。
[0012] 维生素D(vitamin D)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目 前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2(麦角钙化 醇)和VD3(胆钙化醇）。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物，植物不含维 生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。维生素D是一种脂溶性维生素，有五种化合物， 对健康关系较密切的是维生素D2和维生素D3，它们有以下三点特性：它存在于部分天然食 物中；人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为维生素 D3;适当的日光浴足以满足人体对维生素D的需要。
[0013] 维生素D缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。佝偻病多发于婴幼儿，主要表 现为神经精神症状和骨骼的变化。神经精神症状上表现为多汗、夜惊、易激惹。骨骼的变化 随年龄、生长速率及维生素D缺乏的程度等因素有关。可出现卢骨软化、肋骨串珠等。骨软化 症多发生于成人，多见于妊娠多产的妇女及体弱多病的老人。最常见的症状是骨痛、肌无力 和骨压痛。维生素D主要用于组成和维持骨骼的强壮，它被用来防治儿童的佝偻病和成人的 软骨症，关节痛等等，患有骨质疏松症的人通过添加合适的维生素D和镁可以有效的提高钙 离子的吸收度。除此以外，维生素D还被用于降低结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的机率，对免疫 系统也有增强作用。
[0014] 研究表明维生素D的前体(生成维生素D的原料)存在于皮肤中，当阳光直射时会发 生反应转化为维生素D3，D3分子被运送到肝脏并且转化为维生素D的另一种形式25位单脱 氧胆固醇，这种形式的效用更大。然后25位单脱氧胆固醇又被转运到肾形矿脉并在那里被 转化为1，25位二羟胆钙化（留）醇，这种形式是维生素D最有效的状态。然后维生素D将和甲 状旁腺激素以及降血钙素协同作用来平衡血液中钙离子和磷的含量，特别是增强人体对钙 离子的吸收能力。维生素D不应该用于血钙过高的病人，或者血液中钙离子含量偏高的人。 另外对患有肾结石和动脉硬化的病人来说也必须小心使用，因为维生素D可能会引起他们 的甲状旁腺疾病，削弱肾功能甚至引起心脏疾病。皮质类固醇对维生素D的作用有抵消作 用，消胆胺和矿物油会抑制人体对维生素D的吸收，所以应避免一起食用。苯妥英钠和安眠 药可能增加维生素D的效果而降低血压。缺乏维生素D除了会引起少儿的佝偻病和成人的软 骨病外，其它的典型症状还包括肌肉萎缩，痢疾腹泻，失眠，紧张等等。居住在地球南北极的 人和一些常年室内工作的人往往无法自身合成足够的维生素D，还有一些疾病也影响维生 素D的吸收，比如克罗恩氏病(Crohn's disease)等等。
[0015] 因此，研究开发出一种检测方法和手段实现对降钙素、叶酸和维生素D的联合检 测，有助于整体评估孕妇的健康状况，包括骨质状况、贫血以及钙吸收功能等机能，快速准 确的诊断有利于及时对孕妇进行整体的有效治疗。
【发明内容】
[0016] 为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简 便、成本低的降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒，实现对降钙素、叶酸和维生素D抗体 三种成分的同时联合检测。
[0017] 本发明的目的还在于提供一种降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒的制备方 法。
[0018] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0019] -种降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒，包括塑料板、设置在塑料板上的玻 璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本 垫，对应的另一端设有吸水垫，所述玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的降钙素抗体、量子 点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素D3抗体的混合物;所述硝酸纤维素膜上设 置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，所述检测线1上包被有降钙素二抗，所述检测线2 上包被有叶酸二抗，所述检测线3上包被有25羟基维生素D3抗原，所述控制线上包被有羊抗 鼠 lgG。
[0020] 所述玻璃纤维上包被的量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子 点标记的维生素D抗体的混合物中量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量 子点标记的25羟基维生素D3抗体的质量比为1:1:1。
[0021 ] 所述量子点为硒化锦或硫化锦量子点。
[0022] 所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检 测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。
[0023] 上述降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒的制备方法，包括以下操作步骤：
[0024] 1)原材料的制备：
[0025] A:制备玻璃纤维素膜:将量子点标记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体、量子 点标记的25羟基维生素D3抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；
[0026] B:制备硝酸纤维素膜:取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和 控制线，然后将降钙素二抗、叶酸二抗、25羟基维生素D3抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤 维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭 液中封闭，干燥，备用；
[0027] 2)组装:在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，然后在步骤1)制备的玻璃 纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应 的另一端放置吸水垫，干燥，即完成。
[0028] 步骤A中还包括首先制备量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量 子点标记的维生素D抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：
[0029] a:在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳 复合物悬浊液；
[0030] b:在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯 化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬池液；
[0031] c:在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15 分钟，纯化，之后加入降钙素抗体，混匀2~4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封 闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的降钙素抗体；
[0032] d:按照上述步骤a~c同样的方法制备量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维 生素D抗体，然后将量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25轻 基维生素D3抗体混合，备用；
[0033] 所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。
[0034] 所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐。
[0035] 步骤c中所述量子点-改性环糊精-胶乳复合物与活化剂的质量比为1:10。
[0036] 步骤B中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。
[0037] 步骤c中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。
[0038] 步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20:1;步骤b中所述量子点与环糊 精-乳胶复合物的质量比为10:1;步骤c中所述降钙素抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合 物的质量比为1:20。
[0039]步骤a中胶乳颗粒使用前进行纯化处理，所述纯化处理的具体方法为:取胶乳颗粒 加入第一缓冲液中，离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，然后再离心分 离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，4°C保存备用。
[0040] 上述纯化后的胶乳颗粒在使用时取胶乳颗粒，采用第二缓冲液将胶乳颗粒稀释成 浓度为l〇mg/ml。
[0041] 上述步骤b中还包括首先将步骤a中制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用 第二缓冲液稀释成浓度为l〇mg/ml的悬浊液，然后再加入量子点。
[0042] 上述步骤c中还包括首先将步骤b中制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊 液，采用第二缓冲液稀释成浓度为l〇mg/ml的悬浊液，然后再加入活化剂活化。
[0043] 步骤C中所述封闭后进行纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心15min，弃去上 清，沉淀复溶于分散液中。
[0044] 步骤A中将量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体、量子点标记的25轻 基维生素D3抗体混合包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将将量子点标记的降钙素抗 体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素D3抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤 维素膜上。
[0045] 步骤a和步骤b中所述纯化的具体方法为:8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀用 第一缓冲液进行重悬，之后在SOOOrpm条件下离心，弃去上清，沉淀复溶于第一缓冲液中。
[0046] 步骤c中活化后纯化的具体方法为:8000rpm条件下离心弃去上清，沉淀用第一缓 冲液进行重悬。
[0047] 步骤B中将降钙素二抗、叶酸二抗、维生素D抗原、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维 素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为:分别取浓度均为lmg/ml的降 钙素二抗、叶酸二抗、25羟基维生素D3抗原和羊抗鼠IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分别喷 涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。
[0048] 步骤1)和步骤2)中所述的干燥为37°C干燥3~5小时。
[0049] 上述第一缓冲液为0.02M，pH7.4的1?缓冲液。上述第二缓冲液为0.02M，pH6.1的 MES缓冲液。
[0050]上述降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒在使用时，将待测样品加入试剂盒 的样品垫上，玻璃纤维素膜上的量子化标记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体、量子点 标记的25羟基维生素D3抗体混合物首先特异性的捕捉到待测样品中的降钙素、叶酸和25羟 基维生素D3抗体，然后在达到检测线3时，量子点标记的维生素D抗体-25羟基维生素D3结合 物与检测线3上的25羟基维生素D3抗原特异性结合;在检测线2时，量子点标记的叶酸抗体-叶酸结合物与检测线2上的叶酸二抗特异性结合;在检测线1时，量子点标记的降钙素抗体-降钙素结合物与检测线1上的降钙素二抗特异性结合;之后通过检测检测线1、检测线2和检 测线3上结合的量子点的荧光效应，定量和定性判断待测样品中降钙素、叶酸和维生素D。
[0051] 本发明降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒，以量子化标记的降钙素抗体、量 子点标记的叶酸抗体、量子点标记的25羟基维生素D3抗体混合物包被在玻璃纤维素膜上， 作为检测探针，利用双抗体/抗原夹心原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层 析的方法对降钙素、叶酸和维生素D进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。本发明降钙素、 叶酸、维生素D联合检测用试剂盒检测线低，检测灵敏度高。
[0052] 本发明降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒的制备方法，操作简便，易于控 制，适于工业化推广应用。
[0053]进一步优选的，本发明制备方法中，创新量子点标记技术，采用羧甲基化或氨基化 改性的环糊精修饰量子点，然后将降钙素抗体、叶酸抗体、25羟基维生素D3抗体分别结合在 改性环糊精的羧甲基基团或氨基基团上，实现制备获得量子点标记的降钙素抗体、量子点 标记的叶酸抗体、量子点标记的25羟基维生素D3抗体。
【附图说明】
[0054]图1是采用实施例1制备的试剂盒检测降钙素的发光值与实际浓度的标注曲线；
[0055] 图2是采用实施例1制备的试剂盒检测叶酸的发光值与实际浓度的标注曲线；
[0056] 图3是采用实施例1制备的试剂盒检测维生素D的发光值与实际浓度的标注曲线。
【具体实施方式】
[0057] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0058] 实施例1
[0059] 本实施例降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒，包括塑料板、设置在塑料板上 的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有 样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述玻璃纤维素膜上包被有质量比为1:1:1的量子点标 记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素D3抗体的混合物； 所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，所述检测线1上包被有降 钙素二抗，所述检测线2上包被有叶酸二抗，所述检测线3上包被有25羟基维生素D3抗原，所 述控制线上包被有羊抗鼠lgG;所述量子点为硒化锦量子点。
[0060] 本实施例降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒的制备方法，具体操作步骤为：
[0061] 1)制备玻璃纤维素膜：
[0062] a:取lml未标记胶乳颗粒加入10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液中；离心机lOOOOrpm离 心20min;去掉上清液，再用10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液重悬沉淀颗粒物；之后再离心机 lOOOOrpm离心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4JB缓冲液重悬沉淀颗粒物，4°C保存待 用；
[0063] b:取步骤a制备的胶乳颗粒用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将胶乳颗粒稀释至10mg/ ml，取0.05ml稀释后的胶乳颗粒悬浊液加入10mg羧甲基化改性环糊精，混匀24小时后，离心 机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的1?缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机 8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得羧甲基化改性环 糊精-胶乳复合物悬浊液；
[0064] c:取步骤b制备的羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES 缓冲液将其稀释至l〇mg/ml，取20ml稀释后的羧甲基化改性环糊精-胶乳复合悬浊液，加入 20mg硒化镉量子点，混匀24小时，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓 冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M， pH7.4的PB缓冲液中，得量子点-羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
[0065] d:取步骤c制备的量子点-羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M， pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，然后按照量子点-改性环糊精-胶乳复合物与活化 剂的质量比为1:10,加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15分钟后， 8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的1?缓冲液重悬沉淀物颗粒，之后按照降钙素抗 体:量子点-羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物=1:20的比例加入降钙素抗体，混匀3小时 后，8000rpm离心15分钟，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混勾1小时，之后8000rpm离心 15min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的降|丐素抗体；
[0066] e:按照上述步骤a~c同样的方法制备量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25 羟基维生素D3抗体，然后将量子点标记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标 记的25羟基维生素D3抗体混合，喷涂于玻璃纤维素模上，37°C干燥4小时，即得量子点标记 的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素D3抗体混合物标记的 玻璃纤维素膜；
[0067] 2)制备硝酸纤维素膜:取硝酸纤维素膜，间隔6mm依次划分检测线3、检测线2、检测 线1和控制线，之后取浓度均为lmg/ml的降钙素二抗、叶酸二抗、25羟基维生素D3抗原、羊抗 鼠IgG，以lul/ Cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维膜的检测线1、检测线2、检测线3和控 制线上，之后将硝酸纤维素膜放入牛血清白蛋白溶液中封闭，37°C干燥3小时，即得所述的 硝酸纤维素膜；
[0068] 3)组装:在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，在步骤1)制备的玻璃纤维 素膜上放置步骤2)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另 一端放置吸水垫，37 °C干燥5小时，即完成。
[0069] 实施例2
[0070] 本实施例降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，采 用的量子点为硫化镉量子点，采用的改性环糊精为氨基化干性环糊精，制备降钙素抗体、量 子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素D3抗体的过程中，在活化的量子点-改 性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为2小时，其他同实施例1。
[0071] 实施例3
[0072] 本实施例降钙素、叶酸、维生素D联合检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，制 备降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素D3抗体的过程中，在 活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为4小时，其他同实 施例1。
[0073] 试验例：
[0074]将降钙素稀释为 7 · 8125ug/L、15 · 625ug/L、31 · 25ug/L、62 · 5ug/L、125ug/L、250ug/ L;叶酸稀释为3.90625ug/L、7.8125ug/L、15.625ug/L、31.25ug/L、62.5ug/L、125ug/L、 250ug/L; 25羟基维生素D3稀释为1 · 5625ug/L、3 · 125ug/L、6 · 25ug/L、12 · 5ug/L、25ug/L、 50ug/L、1 OOug/L、200ug/L作为标准品溶液，并同时配制空白溶液。
[0075]分别取各浓度的标准品lOOul分别加入到实施例1制备的试剂盒的样品垫上，5min 后将显色完成的试剂盒放入荧光免疫层析读数仪(南京美宁康诚生物科技有限公司）重，读 取相应检测线的发光值，并记录各浓度标准样品检测的发光值与实际浓度之间的对应关 系，绘制标准曲线，如图1~图3所示，降钙素的标准曲线回归方程为：y = -0.00009x2+ 0 · 04228χ-0 · 01248，R2 = 0 · 99956;叶酸的标准曲线回归方程为：y = -0 · 00008x2+0 · 03915x+ 0.09601，R2 = 0.99928;维生素 D 的标准曲线回归方程为：y = -0.00007x2+0.02681x+ 0.06104，R2 = 0.99885;由该标准曲线可知本发明制备的试剂盒针对降钙素的最低检测限 为lng/L、叶酸的最低检测限为2yg/L、维生素D的最低检测限为2yg/L。
[0076] 另外，取空白溶液加入到实施例1制备的试剂盒中，未检测到荧光效应。
[0077] 取100例随机的临床样本，采用本发明实施例1制备的试剂盒对降钙素、叶酸和维 生素D的浓度进行联合检测。检测方法为：lOOul待测样品（50ul样品+50ul样品稀释液)滴入 试剂盒样本垫上，5min后将显色完成的标准品与待测样品的试纸条放入荧光免疫层析读数 仪(南京美宁康诚生物科技有限公司）中，读取T/C线的发光值，并记录，将待测样品T/C值带 入标准曲线中，得到降钙素、叶酸和维生素D的浓度，结果如下表1所示：
[0078] 表 1
[0085] 由此可见，本方法可以直接定量检测降钙素、叶酸、维生素D，不需专业培训，操作 方便，快速，l〇min即可获得结果，适合在基层医院和体检中心推广和运用。
[0086] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和 范围。
【主权项】
1. 一种降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒，包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃 纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫， 对应的另一端设有吸水垫，其特征在于，所述玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的降钙素 抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维生素 D3抗体的混合物;所述硝酸纤 维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，所述检测线1上包被有降钙素二抗， 所述检测线2上包被有叶酸二抗，所述检测线3上包被有25羟基维生素 D3抗原，所述控制线 上包被有羊抗鼠 lgG。2. 如权利要求1所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒，其特征在于，所述玻 璃纤维上包被的量子点标记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基 维生素 D3抗体的混合物中量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记 的25羟基维生素 D3抗体的质量比为1:1:1。3. 如权利要求1所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒，其特征在于，所述量 子点为硒化锦或硫化锦量子点。4. 如权利要求1~3任一项所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒，其特征在 于，所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1 与控制线之间的间隔均不小于5_。5. -种如权利要求1所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒的制备方法，其 特征在于，包括以下操作步骤： 1) 原材料的制备： A:制备玻璃纤维素膜:将量子点标记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体、量子点标 记的25羟基维生素 D3抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用； B:制备硝酸纤维素膜:取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制 线，然后将降钙素二抗、叶酸二抗、25羟基维生素 D3抗原、羊抗鼠 lgG分别包被在硝酸纤维素 膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中 封闭，干燥，备用； 2) 组装:在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，然后在步骤1)制备的玻璃纤维 素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另 一端放置吸水垫，干燥，即完成。6. 如权利要求5所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒的制备方法，其特征在 于，步骤A中还包括首先制备量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标 记的25羟基维生素 D3抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤： a:在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合 物悬浊液； b:在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化， 得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬池液； c:在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟， 纯化，之后加入降钙素抗体，混匀2~4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液 重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的降钙素抗体； d:按照上述步骤a~c同样的方法制备量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素 D 抗体，然后将量子点标记的降钙素抗体、量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的25羟基维 生素 D3抗体混合，备用。7. 如权利要求6所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。8. 如权利要求6所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒的制备方法，其特征在 于，步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20:1;步骤b中所述量子点与环糊精-乳 胶复合物的质量比为10:1;步骤c中所述降钙素抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的 质量比为1:20。9. 如权利要求6所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒的制备方法，其特征在 于，步骤A中将量子点标记的降|丐素抗体、量子点标记的叶酸抗体、量子点标记的维生素 D抗 体混合包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为:将量子点标记的降钙素抗体、量子点标记的 叶酸抗体和量子点标记的维生素 D抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。10. 如权利要求6所述的降钙素、叶酸、维生素 D联合检测用试剂盒的制备方法，其特征 在于，步骤B中将降钙素二抗、叶酸二抗、25羟基维生素 D3抗原、羊抗鼠 lgG分别包被在硝酸 纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为:分别取浓度均为lmg/ml 的降钙素二抗、叶酸二抗、25羟基维生素 D3抗原和羊抗鼠 IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分 另IJ喷涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。
【文档编号】G01N33/558GK106018791SQ201610326772
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】金鑫, 曾滨, 赵正道
【申请人】北京美康基因科学股份有限公司