一种用于食品中产志贺毒素大肠杆菌检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于食品中产志贺毒素大肠杆菌检测的试剂盒。产志贺毒素大肠杆菌是一类携带了前噬菌体编码一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原菌。现有技术的检测方法耗时耗力，检测不便，而本发明提供了特异性检测产志贺毒素大肠杆菌的试剂盒，试剂盒中含有特异性结合产志贺毒素大肠杆菌的适配子，所述适配子为单链DNA。本发明试剂盒具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
【专利说明】一种用于食品中产志贺毒素大肠杆菌检测的试剂盒 发明领域
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于食品中产志贺毒素大肠杆菌检 测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 产志贺毒素大肠杆菌STEC(Shiga toxin-producing Escherichia coli，简称 STEC)是一类携带了前噬菌体编码一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原 菌，包括大肠杆菌026,以及0157、045、0103、0104、0111、0121、0145等150多种其它血清型的 大肠杆菌。该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽胞，有鞭毛，可以在10-65°C生长，最适生长温度为 33-42°C，具有较强的耐酸性(pH2.5-3.0)，可以抵抗胃酸的消化作用。
[0003] 据不完全统计，美国1983-2002年发生的非0157的STEC感染者中，70%是由026、 045、0103、0121、0111和0145血清型所致;2011年9月，美国农业部食品安全检验局曾发布通 告，强调大肠杆菌026是美国最常见的非157STEC。爱尔兰对肉和乳制品中非0157STEC的分 布特征研究发现，血清型026也是引起人类食源性疾病最主要的非0157血清型。STEC 026已 逐渐成为美国、日本及部分欧盟发达国家引起暴发事件的主要病原菌。
[0004] 肉制品是引发食源性STEC感染的主要高危食品。牛、羊等经济型动物是STEC的天 然宿主，国际相关研究发现牛和羊中STEC携带率可高达71 %甚至以上。美国农业部(USDA) 和欧盟食品安全局(EFSA)也证实养殖场中存在高风险污染的STEC，并且可以通过环境、粪 便、野生动物、土壤等在一定范围内循环存在，最终造成肉制品等污染。1982-2006年多个 国家STEC暴发事件的归因分析表明，最主要原因是肉制品污染（42.2%)，其次是乳制品 (12.2% )。除此之外，生鲜果蔬及其制品等也可能是STEC 026重要的传播介质。通过对美国 1992-2002年期间24起STEC暴发事件统计发现，67 %的疫情是由牛肉制品导致的，其中026 是最主要致病血清型。
[0005] 国际组织及部分国家和地区已对肉制品中的STEC污染高度重视。1999年第32届食 品卫生法典委员会(CCFH)会议上，各国政府对食品中的微生物风险应按"食品一病原"组合 进行风险管理达成共识，其中就包括"牛肉中大肠杆菌0157"。联合国粮农组织/世界卫生组 织食品微生物风险评估联合专家组于2011年发布了风险评估会议报告，为如何控制生牛肉 及牛肉制品中的出血性大肠杆菌提供了科学建议。但是，迄今CCFH尚未对如何应用食品卫 生通则控制牛肉中的出血性大肠杆菌制定相关科学导则，也未制定相关产品的限量标准。
[0006] 2012年3月，USDA宣布强制执行在初加工的牛肉制品中不得检出六大类非 0157STEC(026、045、0103、0121、0111和0145)。2011年德国发生STEC0104暴发事件后，欧盟 也加强了对STEC的监测和评估工作，已连续5年对食品和病人中的STEC进行监测。
[0007] 我国食品安全标准对控制控制高危食品中的产志贺毒素大肠杆菌进行了严格规 定。2013年我国颁布的《食品安全国家标准食品中致病菌限量》(GB 29921-2013)中，对预 包装的"肉制品（仅适用于牛肉的熟肉制品和即食生肉制品)"和"即食果蔬制品（仅适用于 生食果蔬制品)"规定了大肠杆菌0157:H7采样方案及限量标准。也就是说，基于我国目前掌 握的食源性疾病和风险监测资料，对高危食品（牛肉制品和即食果蔬）和高致病性血清型 (0157: H7)进行了严格的规定和限量要求，但未对其他血清型的STEC作明确的要求。
[0008] 目前，国内外在食品中大肠杆菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象 各有不同而各具优缺点。传统检测大肠杆菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法 鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好， 但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技 术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚 合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重 PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩 增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。
[0009] 通过指数富集配体的系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度 在20-100个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基， 经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得 靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等 优点。在临床检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部 结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配 子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。
[0010] 利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类 抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合 成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分 子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基 类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细 胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合 靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高 的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子 在生物医药和食品卫生研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
【发明内容】
[0011] 本发明公开了一种高特异高敏感检测产志贺毒素大肠杆菌STEC的方法，提高了它 的检测和诊断效率。
[0012] 为了解决现有大肠氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本 发明提供一种特异识别产志贺毒素大肠杆菌STEC的试剂盒及其应用。
[0013] 上述试剂盒，适配子可以采用生物素标记。
[0014] 本发明中，所述的核酸适配体能够特异结合产志贺毒素大肠杆菌。
[0015] 本发明另外提供一种产志贺毒素大肠杆菌STEC适配子的筛选方法。
[0016] 随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0017] 随机单链DNA文库：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n36代表36个A、T、C、G碱基中任意一种的36个集合）。
[0018] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0019] 引物Π :5'-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'
[0020]
[0021 ]引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0022] 2.SELEX筛选获得产志贺毒素大肠杆菌STEC特异的寡核苷酸适配子 [0023] 1)SELEX 筛选过程：
[0024] a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA 10yg加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0025] b ·加入lmL产志贺毒素大肠杆菌STEC菌悬液2 · 0 X 108，于37°C摇床lOOrpm结合1 · 2 小时，使单链DNA文库与菌充分作用；
[0026] c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA，室温下离心10 OOOrpm离心10min分 离未与菌结合的单链DNA文库；
[0027] d.弃上清，加入600yL 1 X冲洗缓冲液，离心10 OOOrpm离心10min，重复此过程4 次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
[0028] e ·接上步离心后去上清，加入100yL去离子水99°C加热3min，高速离心18 OOOrpm 离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存备用。
[0029] 2)PCR富集与产志贺毒素大肠杆菌STEC特异结合的寡核苷酸适配子：
[0030] 每轮筛选后获得的与产志贺毒素大肠杆菌STEC特异结合的寡核苷酸适配子文库 通过PCR扩增得到富集；
[0031] a.以上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链 DNA；
[0032] b. PCR扩增条件:95 °C预变性3min，然后进行30循环95 °C变性35s，60 °C退火38s，72 °C延伸35s，最后72 °C延伸lOmin;
[0033] c. PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作 用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涤3次，用lOOmM的新鲜NaOH 37°C变性30min，使不带生物素的单链 DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。 [0034] 3)重复筛选:重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行13轮筛选，其中 第6、8轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。
[0035]特异识别产志贺毒素大肠杆菌STEC的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下：
[0057] 本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别产志贺毒素大肠杆菌 STEC的寡核苷酸适配子(适配体），用于快速、准确检测产志贺毒素大肠杆菌STEC。
[0058] 以上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核苷酸进行 替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或 缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核 酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。
[0059] 本发明的有益效果:本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核苷酸文库。文 库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核苷酸的 多样性。文库固定序列（引物序列）的独特设计能使用高退火温度进行PCR扩增，既能有效获 得目的产物，又能有效抑制非特异性产物。本文库及引物应用于产志贺毒素大肠杆菌STEC 的核酸适配子筛选获得成功，所述的适配子可以用于制备检测试剂盒，从而用于食品中的 产志贺毒素大肠杆菌STEC的检测。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简 单等优点，在食品与卫生安全检测中能够得到广泛应用。
【具体实施方式】
[0060] 实施例1产志贺毒素大肠杆菌STEC菌液的制备
[00611取临床分离的产志贺毒素大肠杆菌STEC 0157:H7菌株，在LB液体培养基试管中， 37摄氏度，180r/min摇动过夜，备用。
[0062]实施例2适配子的获得
[0063] 1、随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0064] 随机单链DNA文库：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n36代表36个A、T、C、G碱基中任意一种的36个集合）。
[0065] 引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0066] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0067] 引物 ΙΠ : 5 地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0068] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0069] 2. SELEX筛选获得产志贺毒素大肠杆菌STEC特异的寡核苷酸适配子 [0070] 1)SELEX 筛选过程：
[0071] a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA 10yg加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0072] b.加入lmL产志贺毒素大肠杆菌STEC菌悬液2.0 X 108，于37°C摇床lOOrpm结合1.2 小时，使单链DNA文库与菌充分作用；
[0073] c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA，室温下离心10 OOOrpm离心10min分 离未与菌结合的单链DNA文库；
[0074] d.弃上清，加入600yL 1 X冲洗缓冲液，离心10 OOOrpm离心10min，重复此过程4 次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
[0075] e ·接上步离心后去上清，加入100yL去离子水99°C加热3min，高速离心18 OOOrpm 离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存备用。
[0076] 2)PCR富集与产志贺毒素大肠杆菌STEC特异结合的寡核苷酸适配子：
[0077] 每轮筛选后获得的与产志贺毒素大肠杆菌STEC特异结合的寡核苷酸适配子文库 通过PCR扩增得到富集；
[0078] a.以上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链 DNA；
[0079] b. PCR扩增条件:95 °C预变性3min，然后进行30循环95 °C变性35s，60 °C退火38s，72 °C延伸35s，最后72°C延伸lOmin;
[0080] c.PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作 用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涤3次，用lOOmM的新鲜NaOH 37°C变性30min，使不带生物素的单链 DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。
[0081] 3)重复筛选:重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行13轮筛选，其中 第6、8轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。
[0082] 4)富集寡核苷酸适配子与菌结合率的测定：
[0083]第7、11、13轮SELEX筛选的产物，以标记地高辛的引物ΙΠ 和标记生物素的引物IV进 行PCR扩增，纯化的PCR产物与链亲和素标记的磁珠充分反应并用NaOH解链，地高辛标记的 单链DNA游离在上清中；
[0084] 5)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析：
[0085] a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pEGM-T载体，转化E. coli DH5a，随机挑取 56个阳性克隆进行DNA序列测定，其中21个为可用序列，见SEQ ID NO: 1-21所示；
[0086] 实施例3结合特性验证
[0087] 将适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的DNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的DNA分子末端。lOnmol放射性 标记的DNA适配子分别与不同浓度的菌体37°C孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤 过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。 计算各个适配子与菌体的解离常数。结果如下：
[0090] 从以上结果可以看出，本发明的21个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合所述的菌体。
[0091] 实施例5菌体的鉴定
[0092]寡核苷酸适配子SEQ ID N0:1-21的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 标记羟基荧光素(FAM)。
[0093] 取5'FAM荧光标记的寡核苷酸适配子SEQ ID N0:l-21(100nM)各300yL，分别与产 志贺毒素大肠杆菌STEC，肠产毒性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌，肠致病性大肠杆菌，肠出 血性大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌（1.5 X 108)于37°C孵育lh，用 IXBB(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM KCl，I00mM NaCl，ImMMgC12)洗涤2次后，将菌体重悬于 500yL IX B B，用BD FACSC alibur流式细胞分析仪检测结合上FAM标记的适配子的菌体 百分率(测三次取平均值），结果显示产志贺毒素大肠杆菌STEC寡核苷酸适配子竞争结合产 志贺毒素大肠杆菌STEC的能力为100%，而针对肠产毒性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌，肠 致病性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌没有结 合率。
[0094]这充分说明，本发明的适配子具有较好的特异性和稳定性。
[0095]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于食品中产志贺毒素大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合产志贺毒 素大肠杆菌的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述核酸适体序列如SEQ ID No :1-21任一 所示。3. -种检测食品中产志贺毒素大肠杆菌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项 所述的试剂盒。
【文档编号】G01N33/569GK106018804SQ201610483857
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】杨国林
【申请人】杨国林