一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒。肾透明细胞癌是肾癌中比例较高的癌症，但是检测方法具有一定的局限性，不适宜廉价的大面积推广。本发明提供的试剂盒能够特异性的检测样本中的DUSP?9蛋白的含量，从而能够快速高效的检测肾透明细胞癌。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用。
【专利说明】
一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肾癌又称为肾细胞癌，起源于泌尿小管上皮。肾癌约占成人恶性肿瘤的80%-90 %。通常将肾细胞癌分为4型：透明细胞型、颗粒细胞型、混合细胞型、未分化细胞型。其 中，肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)占肾癌的70%_80%，其癌 细胞常排列成片状、条索状、腺泡状或管状，很像肾小管，早期常无症状，或只有发热、乏力 等全身症状，肿瘤体积增大时才被发现(J.C.Cheville，et al .Comparisons of outcome and prognostic features among histologic subtypes of renal cell carcinoma.The American journal of surgical pathology 27(2003)612-624)。肾细胞癌的发病率在过 去的30年里一直在稳步上升。
[0003] 由于肾癌缺乏有效的化疗手段，临床目前只能依赖于手术治疗。肾癌不化疗的原 因，首先是由于肾癌中一些多药耐药基因的高表达，导致其对化疗药物不敏感，其次虽然化 疗在治疗肾癌能快速抑制症状，但是化疗抑制肾癌细胞的同时对正常细胞也会造成损伤， 化疗带来的毒副作用多数患者难以忍受，因个体差异，多数患者在化疗过程中会出现全身 乏力，容易受感染，倦怠，脱发，机体免疫力下降等。目前靶向治疗肾癌的药物均针对HIFl-a 下游靶基因，包括索拉非尼、贝伐珠等药物已用晚期肾癌的靶向治疗并取得一定成绩，但是 肾癌的药物治疗效果仍然不尽如人意，主要表现在病情复发、生存率提高甚微、毒副作用大 等方面。
[0004] 而癌症在初始期被检测发现之后，对于治疗具有非常重要的意义，据统计，肿瘤在 初期被检测发现之后经过治疗，生存期普遍可以提高3-5年左右。DUSP_9(双特异性磷酸酶_ 9)属于双特异性蛋白磷酸酶亚科。DUSP-9是促分裂原活化蛋白激酶家族中的一个负调节酶 (如:ERK，JNK，p38)，它与细胞的增殖和分化相关。大规模平行测序研究已经证明了 ccRCC患 者中DUSP-9的表达是下调的。并且也证实了 DUSP-9是肾透明细胞癌的特异性的标志物。现 有技术已经有检测DUSP-9蛋白的量一般通过抗体结合之后通过酶联免疫反应进行定量检 测，但是该检测方法需要自备相应的抗体，由于抗体的制备要求比较高，并且制备复杂，在 检测中存在着巨大的局限。
[0005] SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可 以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是 体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合 的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮 的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的 核酸分子被洗去，而与革G物质有强未和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯 度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体 后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技术，筛选特定的结合DUSP-9的适配体具有较为重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的技术方案通过以下步骤实现：
[0007] 本发明的目的是提供一种DUSP-9的核酸适配体序列。
[0008]本发明中，所述的DUSP-9的核酸适配体(序列1-22)能够特异结合DUSP-9。
[0009] 本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序 列应用，可进一步用于制备特异性结合DUSP-9的试剂盒。
[0010] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5 '-TTGACAGGGAGCATTAGCAT-N35-GCATTACCATGAAGTTGCAC-3'），其中N35为35个随机寡核苷酸;从中筛选出与DUSP-9特异结合 的核酸适配体；将筛选出的序列用引物PI : TTGACAGGGAGCATTAGCAT ;引物P2 : GTGCAACTTCATGGTAATGC，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司）， 转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司）；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒 并测序反应，上测序仪测序。
[0011]本发明采用核酸适配体的体外筛选（SELEX)技术，以DUSP-9为正筛靶标筛选与 DUSP-9特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合DUSP-9的序列，本发明中命名为适配体 DUSP-9-1~22。序列如下：
[0056]本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检 测DUSP-9。
[0057]本发明的有益效果：获得了一种能够特异检测DUSP-9的试剂盒，该试剂盒制备简 单，可以大面积推广使用。
【具体实施方式】
[0058]实施例1:蛋白的获得
[0059] 按照现有技术的真核表达方法，获得相应的蛋白。比如采用(利用昆虫杆状病毒表 达DUSP1及其对肿瘤细胞的影响）中的相似的方法，收获蛋白，通过蛋白浓缩技术，获得 DUSP-9蛋白浓度为50mg/mL的蛋白储存液。
[0060] 实施例2核酸适配体筛选
[0061] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5 '-TTGACAGGGAGCATTAGCAT-N35-GCATTACCATGAAGTTGCAC-3 '），其中N35为35个随机寡核苷酸；
[0062] 引物PI: TTGACAGGGAGCATTAGCAT;引物P2 :GTGCAACTTCATGGTAATGC。
[0063] (l)DUSP-9蛋白 lmg溶于200μ1 PBS后加入96孔ELISA板中，4°C过夜。
[0064] (2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200μ1 3%BSA(购自上海生工），孵育2小时。 同时，空白96孔ELISA板中加入200μ1 3%BSA 37°C孵育2小时。
[0065] (3)将随机 ssDNA 文库（首轮用量为 800pmol)溶于 200μ1 1*SHCMK，95°C 变性 5min。 立即置于冰上lOmin，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
[0066] (4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小时。
[0067] (5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37 °C孵育2小时后PBS洗涤6次。
[0068] (6)结合了 ssDNA的酶标孔用200i 11洗脱缓冲液重悬，95 °C加热5min，取上清，经过 乙醇沉淀DNA，溶于Mi 11 ipore水中，作为下一轮筛选的模板。
[0069] (7)取5μ1 PCR产物上样于5wt%琼脂糖(购自上海生工），观察条带位置是否正确。 从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行15个循环。
[0070]第15轮筛选产物的扩增和纯化:将第15轮筛选得到的ssDNA序列，用引物P1，引物 P2进行扩增。100μΙ PCR扩增后体系加入500pl结合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)， 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/L CaCl2，lmm〇l/L MgCl2，l%BSA)，充分混匀。将上一 步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室温放置lmin，12000rpm离心60s，倒 掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB(结合液ΒΒ+0 · 05%Tween20)，12000rpm离心30s，弃 掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收集管中， 12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 20pmol 65°C水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12，OOOrpm离心lmin。将得到的溶液 重新加入吸附柱中，再次离心lmin。
[0071] PCR纯化产物的克隆:取ΙμL扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接， 再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)的LA平 板，倒置培养皿，于37°C培养12-16小时进行"蓝-白斑筛选"。测序：用接种环挑取筛选平板 上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37°C培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后 送上海生工测序。
[0072]测序结果发现其中有22个核酸适配体序列与DUSP-9具有非常强的亲和性，该21个 序列分别是:SEQ ID NO :1-22所示。
[0073]实施例2特异性高亲和力的DUSP-9结合适配子的性能测定 [0074] 将适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32Ρ]ΑΤΡ于去磷酸化的适配体分子末端。lOnmol放 射性标记的适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的DUSP-9蛋白37°C孵育30min，各组反应液经 硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品 平行做两次测定。计算各个适配子与DUSP-9蛋白的解离常数。结果如下：
[0077]从以上结果可以看出，本发明的22个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合DUSP-9蛋白。
[0078]实施例3降解活性分析
[0079] 分别采用人血白蛋白，DUSP-1蛋白、DUSP-10蛋白、DUSP-14与22条适配子进行特异 性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与DUSP-9蛋白结合保 持较高的特异性。
[0080] 将所述的适配子，取〇.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0081 ]实施例4临床试验分析
[0082] 取40组ccRCC肿瘤样本和相邻正常肾组织样本。进行检测分析 [0083] 将22个适配子分别与标准品DUSP-9蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检 测的标准曲线。然后将40组临床样本经过处理后取10μ1加入到无菌离心管中，加入PBS溶液 震荡溶解。分别将偶联有磁珠的22组适配子与40组处理液混合孵育20分钟，而后磁分离，即 可获得相应的分离的DUSP-9蛋白，通过标准曲线浓度检测发现，40组ccRCC肿瘤样本的 DUSP-9蛋白浓度与正常组织相比，分别下调80-100%，蛋白表达量与ccRCC的病程严重程度 呈现负相关。在5例ccRCC晚期的患者样本中，没有检测到DUSP-9蛋白的存在。由此可见，本 发明的适体可以用于检测蛋白浓度的表达情况，进而判断肿瘤病程的严重程度。
[0084]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒，其特征在于其包括能特异性检测肾透明细胞 癌的适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，所述适体为SEQ ID No. 1-22任一条序列所示，或者在该 序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。3. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒在检测肾透明细胞癌的应用。4. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒用于制备检测肾透明细胞癌的试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/574GK106018809SQ201610364488
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月29日
【发明人】孟繁好
【申请人】孟繁好