一种通过选择发育潜能良好的胚胎来改善试管婴儿临床结局的方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过选择发育潜能良好的胚胎来改善试管婴儿临床结局的方法，包括五个步骤：主要根据移植前胚胎培养液中的IL?8来选择发育潜能良好的移植胚胎，具体用液相芯片高通量的蛋白质分析技术来检测标本中IL?8的含量，选择其培养液中IL?8阳性的胚胎结合形态学评估法来进行移植；用移植前人胚胎培养液中IL?8阳性的结合形态学上优质胚胎移植，妊娠率可提高8％以上，达60.76％；较现有的单用形态学方法选择胚胎来进行移植，妊娠率可提高8?12％以上，用本方法结合现有的形态学方法选择优质胚胎，或优质胚胎和普通胚胎移植给体外受精者，还可以提高胚胎种植率，增加婴儿活产数，提高患者临床妊娠率及降低流产率。
【专利说明】
一种通过选择发育潜能良好的胚胎来改善试管婴儿临床结局 的方法
技术领域
[0001] 本发明是属于生殖医学科学，试管婴儿移植领域，具体涉及在进行试管婴儿移植 前，通过测定人胚胎移植前培养待移植胚胎的培养液中白细胞介素-8(IL-8)的含量来选择 发育潜能良好的移植胚胎，以改善妊娠结局。
【背景技术】
[0002] 随着辅助生殖技术，或者是说试管婴儿技术在全世界范围应用增加，既快又非创 伤性地选择最好的移植胚胎仍然是生殖医学面临的一个重要问题。对大多数进行试管婴儿 的病人而言，为获得较高的胚胎种植率（IRs)和妊娠率，每次移植需移植多个胚胎，而移植 多个胚胎会导致多胎妊娠。体外受精（IVF/IVSI)所致的多胎妊娠的增加，使社会面临一系 列重大的健康问题，并加重了卫生部门的负担。随着人们对多胎妊娠所带来的医学和社会 经济问题的认识增加，预防多胎妊娠已成为辅助生殖技术的一个中心任务。选择性单胚胎 移植被认为是防止体外受精周期中多胎妊娠的唯一选择。既要选择单胎移植的又不降低妊 娠率，就必须提高胚胎IRs及寻找一种识别移植前最高种植潜能的胚胎的方法。目前，形态 学评估法仍然是评价胚胎质量的主要方法。形态学评估法主要是根据胚胎的细胞数及其形 态学外观来选择移植胚胎，这种方法不能够很好地预测胚胎的种植潜能。由于用形态学评 估法评价评价胚胎质量有一定的局限性，许多研究者一直在寻求评价胚胎生殖潜能的其它 方法。目前正在研究的评价胚胎的方法(胚胎移植)包括测定胚胎培养液中的葡萄糖、乳酸、 丙酮酸或氨基酸的含量;测定胚胎的耗氧量；以及基因组学和蛋白组学等方法。近年来，非 创伤性方法被认为是预测辅助生殖技术后临床结局最为有希望的方法。已有研究者用非创 伤性方法检测发育胚胎的数项代谢学指标，而检测结果表明，胚胎培养液中代谢物与患者 的临床妊娠结局相关。通过时差显微镜(time-lapse device)摄像，非创伤性地观察胚胎的 发育，是一种评价胚胎质量的较好方法;现有的研究表明，用这种方法选择胚胎来进行移 植，能够获得良好的临床结局。然而，由于缺乏大样本及随机的临床研究，研究者很难判断 用动力学参数选择胚胎法能改善临床结局，以及很难判断哪一种动力学参数在评价胚胎质 量上更有价值。
[0003] 细胞因子是细胞分泌的一类蛋白。在生理或病理状况下，该蛋白作为激素调控器， 在纳摩尔至皮摩尔(nano to picomolar)浓度下即可调控细胞和组织的功能。细胞因子的 基本功能是改变大量细胞和组织的性能。细胞因子可以通过自分泌、旁分泌或远距离分泌 (特定情况下)起作用。细胞因子和细胞膜上特定的受体结合，诱导信号通路的级联反应，结 果致细胞和组织发生效应。在生殖免疫学，细胞因子不仅参与月经、排卵、分娩和胚胎种植 等生理过程，还参与早产和子宫内膜异位症等病理过程。
[0004] 多年来，研究者一直企图用移植前胚胎培养液中的细胞因子来预测胚胎的质量和 妊娠结局。20世纪90年代，学者检测人胚胎培养液中白细胞介素-1 (I L-1 )、白细胞介素-6 (IL-6)、集落刺激因子-l(CSF-l)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)和转化生长因子0(TGF_i3)的含 量，并提出用胚胎培养液中的这些细胞因子来预测IVF/IVSI病人妊娠结局的可能性。在 2012年，一篇文献表明，妊娠妇女组与非妊娠妇女比较，人类移植前胚胎培养液中肿瘤坏死 因子a(TNF-a)的浓度在妊娠妇女组较低，而人类移植前胚胎培养液中白血病抑制因子 (LIF)在妊娠妇女组则较高，揭示LIF可能是胚胎种植所需要的因子，而TNF-α可作为预测胚 胎种植失败的一个指标。而我们用液相芯片高通量的蛋白质分析技术(LHTPA)来检测人类 移植前胚胎培养液中TNF-a、IL-6、IL-li3及GM-CSF的含量，结果并没有发现这几种细胞因子 可以预测胚胎的发育潜能及临床结局，因此这个资料未发表。本研究者继续研究测定人胚 胎移植前培养待移植胚胎的培养液中白细胞介素-8 (IL-8)的含量，并分析和研究IL-8的浓 度与胚胎质量和妊娠结局的关系，得到了令人鼓舞成果。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供了一种评价体外受精受者的移植胚胎质量的新方法。本发明通 过研究得出，测定人胚胎移植前培养待移植胚胎的培养液中IL-8的含量来选择发育潜能良 好的胚胎的方法，以改善体外受精受者的临床结局。
[0006] 本方法包括以下步骤：
[0007] (1)在移植的当天，收集每个体外受精受者的每次胚胎移植前的培养待移植胚胎 的培养液。在体外受精后的第一天，在确认受精后，将每个体外受精受者的每个受精卵分别 放置在30-50yL 10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中，置37 °C、5 % C02的培养箱中继续培养2 天，至胚胎移植前;现在，胚胎在体外已培养至第3天，在进行胚胎移植前的4h-6h，根据以卵 裂率和形态学为基础的形态学评估法评价每个体外受精受者待移植胚胎的质量，每个体外 受精受者每次移植2-3个胚胎;每个体外受精受者的待移植的胚胎选定后，将待移植的胚胎 移走，即收集已培养待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的卵裂液液滴，即培养待移植胚 胎的培养液;鉴于每个体外受精受者每次移植2-3个胚胎，每个胚胎在移植前均放置在一个 30-50yL含10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中培养2日，每个体外受精受者的每次胚胎移植 前的培养待移植胚胎的培养液为分别培养2-3个待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的 卵裂液液滴，收集每个体外受精受者每次胚胎移植前培养待移植胚胎的这2-3个液滴，组成 一份标本，每一份标本含25yL-40yL培养液;收集在同样条件下培养的没有放置胚胎的培养 液作为阴性对照；
[0008] (2)用液相芯片高通量的蛋白质分析技术(LHTPA)来检测每一份标本中白细胞介 素-8(IL_8)的含量；
[0009] (3)根据形态学评估法和标本中白细胞介素-8(IL-8)的含量来选择移植胚胎，将 选择的移植胚胎移植给体外受精受者;可用移植胚胎形态学上质量相同或相似，则选择其 培养液中IL-8阳性，即培养液中IL-8浓度范围在0.19pg/ml至10.32pg/ml之间的胚胎来进 行移植；
[0010] (4)如果可用移植胚胎与形态学上质量不相同或不相相似，则选择其培养液中IL-8阳性，即培养液中IL-8浓度范围在0.19pg/ml至10.32pg/ml之间的胚胎和/或选择胎形态 学上质量较好的胚胎来进行移植。
[0011] (5)从收集标本到检测出IL-8的时间为4h_6h，故在胚胎移植的当天即可用该方法 来筛选发育潜能较好的胚胎来进行移植。
[0012] 本发明的有益效果是，根据移植前胚胎培养液中的细胞因子来选择发育潜能良好 的移植胚胎，以改善妊娠结局。妊娠妇女组与非妊娠妇女比较，人类移植前胚胎培养液中肿 瘤坏死因子a(TNF-a)的浓度在妊娠妇女组较低，而人类移植前胚胎培养液中白血病抑制因 子(LIF)在妊娠妇女组则较高，揭示LIF是胚胎种植所需要的因子，而肿瘤坏死因子a(TNF-α)可作为预测胚胎种植失败的一个指标。用移植前人胚胎培养液中IL-8阳性的形态学上优 质胚胎移植给IVF/ICSI患者，妊娠率(pregnancy rate)可提高8%以上，达60.76%;用移植 前人胚胎培养液中IL-8阳性的优质胚胎和普通胚胎移植给IVF/ICSI患者，妊娠率可提高 12 %以上，达47.37 %。因而，用本方法结合现有的形态学方法选择胚胎来进行移植，较现有 的单用形态学方法选择胚胎来进行移植，妊娠率可提高8-12%以上。用本方法结合现有的 形态学方法选择优质胚胎，或优质胚胎和普通胚胎移植给IVF/ICSI患者，还可以提高胚胎 种植率，增加患者的婴儿活产数，提高患者临床妊娠率及降低患者的流产率。
【附图说明】
[0013] 图1.用LHTPA法测定移植前胚胎的培养液中IL-8的浓度（IL-8C〇nCentrati 〇n)〇
[0014] *Ρ = 0·003,0·000和0·000,与阴性对照组（negative control group)、研究组 (study group)和LI-8阴性组（LI_8negative group)比较。★? = 0·000,与LI-8阴性组比较 (LI-8negative group)。根据样本中检测到的LI-8的值的高低将研究组分为LI-8阳性组 (LI-8positive group)和LI-8阴性组，在LI-8阳性组中，样本中检测到的LI-8的值的均高 于0.19pg/ml，而在LI-8阴性组中，样本中检测到的LI-8的值的均低于0.19pg/ml。每一份标 本由每一病人本次新鲜移植周期中所有移植胚胎的培养液组成;收集在同样条件下培养的 没有放置胚胎的培养液作为阴性对照。结果以均数±标准误(mean±SEM)表示。n =总的被 检测样本数。
[0015] 图2.用移植前人胚胎的培养液中的IL-8来预测体外受精受者的临床结局
[0016] LI-8阳性组（LI_8positive group)和LI-8阴性组（IL_8negative group)间妊娠 率（pregnancy rate)、胚胎种植率（imp lan tation rate)、临床妊娠率（clinical pregnancy rate)、流产率（abortion rate)、生化妊娠率（chemical pregnancy rate)、与 活产率（live-birth rate)比较。
[0017] ★? = 〇.〇22，*卩=0.020，与1^1-8阴性组比较。
【具体实施方式】
[0018] 实施方法，本方法包括以下步骤：
[0019] (1)在移植的当天，收集每个体外受精受者的每次胚胎移植前的培养待移植胚胎 的培养液。在体外受精后的第一天，在确认受精后，将每个体外受精受者的每个受精卵分别 放置在30 -50yL 10%人血清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc.;Trumbull，CT， USA)的卵裂液（ART-1026,SAGE In-Vitro Fertilization，Inc. ;Trumbull，CT,USA)液滴 中，置37 °C、5 % C02的培养箱中继续培养2天，至胚胎移植前;现在，胚胎在体外已培养至第3 天，在进行胚胎移植前的4h-6h，根据以卵裂率和形态学为基础的形态学评估法评价每个体 外受精受者待移植胚胎的质量，每个体外受精受者每次移植2-3个胚胎;每个体外受精受者 的待移植的胚胎选定后，将待移植的胚胎移走，即收集已培养待移植胚胎2日的含10%人血 清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·;Trumbull，CT，USA)的卵裂液（ART-1026， SAGE In-Vitro Fertilization，Inc. ;Trumbull，CT,USA)的液滴(培养待移植胚胎的培养 液）。鉴于每个体外受精受者每次移植2-3个胚胎，每个胚胎在移植前均放置在一个30-50yL 含 10%人血清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·;Trumbull，CT，USA)的卵裂液 (ART-1026，SAGE In-Vitro Fertilization,Inc. ;Trumbull，CT,USA)液滴中培养2日，每个 体外受精受者的每次胚胎移植前的培养待移植胚胎的培养液为分别培养2-3个待移植胚胎 2 日的含 10%人血清白蛋白（SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·; Trumbull，CT，USA)的卵 裂液(ART-1026，SAGE In-Vitro Fertilization，Inc ·;Trumbull，CT，USA)液滴，收集每个 体外受精受者每次胚胎移植前培养待移植胚胎的这2-3个液滴，组成一份标本，每一份标本 含25yL-40yL培养液;收集在同样条件下培养的没有放置胚胎的培养液作为阴性对照。
[0020] 体外受精受者:2014年1月至12月，于我中心进行体外受精治疗的不孕夫妇。进行 辅助生殖治疗的适应症包括输卵管因素、子宫内膜异位症、男性因素或特发性不孕以及免 疫学因素或前试管婴儿移植周期不明原因失败者。
[0021] (2)用液相芯片高通量的蛋白质分析技术(LHTPA)来检测每一份标本中白细胞介 素-8(IL_8)的含量。
[0022] (3)根据形态学评估法和标本中白细胞介素-8(IL_8)的含量来选择移植胚胎，将 选择的移植胚胎移植给体外受精受者;可用移植胚胎形态学上质量相同或相似，则选择其 培养液中IL-8阳性，即培养液中IL-8浓度范围在0.19pg/ml至10.32pg/ml之间的胚胎来进 行移植。
[0023] (4)如果可用移植胚胎形态学上质量不相同或不相相似，则选择其培养液中IL-8 阳性，即培养液中IL-8浓度范围在0.19pg/ml至10.32pg/ml之间的胚胎和/或选择胎形态学 上质量较好的胚胎来进行移植。
[0024] (5)从收集标本到检测出IL-8的时间为4h_6h，故在胚胎移植的当天即可用该方法 来筛选发育潜能较好的胚胎来进行移植。
[0025] 下面结合具体实施例进一步说明本发明，
[0026] 实施例1
[0027] 2714(病历编号）不孕夫妇女方姓名，陈X，33岁，男方姓名，秦XX，诊断：继发不孕： 左输卵管梗阻Lap术后；宫腔粘连宫腔镜术后；女方于2014年1月17日取卵，于2014年1月20 日行胚胎移植手术;在行胚胎移植手术前测定移植胚胎的培养液中IL8的浓度为0.21pg/ ml，所移植胚胎级别为2/5和2/7;女方行胚胎移植手术后14天测血hCG阳性，于2014年9月25 日剖宫产一活男婴，体重3.2千克。
[0028] 实施例2
[0029] 5124(病历编号）不孕夫妇女方姓名，杨XX，30岁，男方姓名，方X，诊断：原发不孕： 盆腔重度粘连分离术后;盆腔腔结核(陈旧性）；女方于2014年1月18日取卵，于2014年1月21 日行胚胎移植手术;在行胚胎移植手术前测定移植胚胎的培养液中IL8的浓度为0.27pg/ ml，所移植胚胎级别为1/5和1/7;女方行胚胎移植手术后14天测血hCG阳性，于2014年10月5 日剖宫产一活男婴，体重3.1千克。
[0030] 实施例3
[0031] 5120(病历编号）不孕夫妇女方姓名，柳X，27岁，男方姓名，谢X，诊断：右侧输卵管 妊娠保守治疗后；左侧输卵管妊娠保守术后;RSA;丈夫弱畸精子症;女方于2014年1月19日 取卵，于2014年1月22日行胚胎移植手术;在行胚胎移植手术前测定移植胚胎的培养液中 IL8的浓度为0.55pg/ml，所移植胚胎级别为1/8和1/7;女方行胚胎移植手术后14天测血hCG 阳性，于2014年10月4日剖宫产一活男婴，体重3.5千克。
[0032] 实施例4
[0033] 5110(病历编号）不孕夫妇女方姓名，贺XX，男方姓名，龙XX，诊断：原发不孕:右侧 输卵管梗阻Lap术后;双侧卵巢开窗Lap术后;女方于2014年1月19日取卵，于2014年1月22日 行胚胎移植手术;在行胚胎移植手术前测定移植胚胎的培养液中IL-8的浓度为0.52pg/ml， 所移植胚胎级别为1/8和1/8;女方行胚胎移植手术后14天测血hCG阳性，于2014年10月4日 剖宫产一活女婴，体重3.15千克。
[0034] 实施例5
[0035] 5119(病历编号）不孕夫妇女方姓名，付XX，男方姓名，陈XX，诊断:继发不孕:卵巢 储备功能减退;丈夫弱精子症；乙肝病毒携带者；女方于2014年1月20日取卵，于2014年1月 23日行胚胎移植手术；在行胚胎移植手术前测定移植胚胎的培养液中IL-8的浓度为 6.58pg/ml，所移植胚胎级别为1/8和1/8;女方行胚胎移植手术后14天测血hCG阳性，于2014 年10月9日剖宫产一活女婴，体重2.9千克。
[0036] 实施例6
[0037] 5769(病历编号)不孕夫妇女方姓名，徐XX，男方姓名，原发不孕:丈夫弱精子症；月 经不调；一次AIH术后;女方于2014年7月12日取卵，于2014年7月15日行胚胎移植手术;在行 胚胎移植手术前测定移植胚胎的培养液中IL-8的浓度为0.52pg/ml，所移植胚胎级别为1/8 和1/8;女方行胚胎移植手术后14天测血hCG阳性，于2014年10月9日平产一活女婴和一活男 婴，体重分别为1.99千克和1.73千克。
[0038]对于330例的情况作综合说明效果：
[0039] (1)移植前人胚胎的培养液中可以检测到IL-8。移植前人胚胎的培养液中LI-8的 阳性率为32.42% (107/330)，而阴性对照组LI-8的阳性率为0% (0/9)，（表1和图1)。
[0040] 表1.人移植前胚胎培养液中IL-8的浓度
[0042] 注:*P = 0.003，0.000和0.000，与阴性对照组、研究组和LI-8阴性组比较。= 0.000，与LI -8阴性组比较。
[0043] (2)移植前胚胎培养液中的IL-8与体外受精受者结局的关系
[0044] 在LI-8阳性组，妊娠率和胚胎种植率别为54.21 % (58/107)和27.62% (66/239); 在LI-8阴性组，妊娠率和胚胎种植率别为40.81 % (91/223)和19.92% (97/487) ;LI-8阳性 组和在LI-8阴性组间妊娠率和胚胎种植率的比较均有显著差异性(P = 0.022和0.020);在 LI-8阳性组与LI-8阴性组比较，临床妊娠率较高，而流产率较低，但两组间没有显著差异性 (P = 0.12和0.17);LI-8阳性组与LI-8阴性组间生化妊娠率与活产率比较，没有显著差异性 ((表2和图2)。结果表明，移植前人胚胎培养液中的IL-8阳性预示体外受精受者患者有较高 的妊娠率和较好的胚胎种植潜能，还预示体外受精受者可能有高的临床妊娠率和较低的流 产率。移植前人胚胎培养液中IL-8阳性的体外受精受者，虽然其活产率与IL-8阴性的患者 比较没有显著差异性，但因其妊娠率增加，结果至其婴儿活产数增加。如果用移植前人胚胎 培养液中的IL-8的浓度(0.19至10.32pg/ml ((mean+2SD)预测体外受精受者在体外受精后 是否妊娠，则阳性预测值=56.86% (58/(58+49-5))。
[0045] 表2.比较移植前人胚胎培养液中IL-8阳性与阴性的患者的体外受精受者的临床 结局
[0047] ★P = 0.022，*P = 0.020
[0048] (3)移植前人胚胎培养液中IL-8与移植胚胎的质量和细胞数之间的关系
[0049] LI-8阳性组和LI-8阴性组间移植胚胎的平均细胞数(mean土SEM)没有明显的差异 (P = 0.32)(表3)。移植前人胚胎培养液中IL-8阳性与阴性的患者，根据移植胚胎质量分为 三组：优质胚胎组（good quality embryo group)优质和普通胚胎组（good and ordinary quality embryo group)及普通胚胎组（ordinary quality embryo group)。在优质胚胎 组，所有患者移植的胚胎均为优质胚胎;在优质和普通胚胎组，每位患者移植的胚胎中既有 优质胚胎，又有普通胚胎;在普通胚胎组，每位患者移植的胚胎均为普通胚胎。结果表明， LI-8阳性组和LI-8阴性组间移植胚胎的质量没有显著差异性(P = 0.71)(表3)。从普通胚胎 组、优质和普通胚胎组至优质胚胎组，LI-8阳性组和LI-8阴性组间妊娠率（pregnancy rate)比较，差异性逐渐增加，但没有显著性(P=l.00,0.18和0.07)(表4)。结果显示，当移 植相同质量的胚胎时，移植前人胚胎培养液中IL-8阳性较IL-8阴性者的妊娠率(pregnancy rate)高，移植前人胚胎培养液中IL-8阳性者移植优质胚胎(good quality embryo)时，妊 娠率(pregnancy rate)可高达60 · 76% (表4)。
[0050]表3. LI -8阳性组和LI -8阴性组间移植胚胎的质量和细胞数比较
[0052]表4. LI-8阳性组和LI-8阴性组间移植胚胎的质量和妊娠率的关系
[0054]用移植前人胚胎培养液中IL-8阳性的形态学上优质胚胎移植给体外受精受者，妊 娠率(pregnancy rate)可提高8%以上，达60.76% ;用移植前人胚胎培养液中IL-8阳性的 优质胚胎和普通胚胎移植给体外受精受者，妊娠率可提高12%以上，达47.37%。因而，用本 方法结合现有的形态学方法选择胚胎来进行移植，较现有的单用形态学方法选择胚胎来进 行移植，妊娠率可提高8-12%以上。
[0055] (4)分析:为什么用本方法可以选择发育潜能良好的移植胚胎和改善体外受精受 者的妊娠结局
[0056] 胚胎的植入为成功妊娠所必需，大约有一半的胚胎在植入后发生流产。在临床上， 胚胎植入失败与复发性流产和体外受精受者的低成功率密切相关，如何使胚胎成功植入仍 然是辅助生殖技术面临的一个关键技术难题。在胚胎植入时，植入部位的微环境中含有大 量的趋化因子和前炎症细胞因子。
[0057] 趋化因子是一类小分子细胞因子或细胞分泌的信号蛋白，趋化因子的主要功能是 参与白细胞迀移。在生殖医学领域，趋化因子在排卵、月经、胚胎植入及分娩过程中起着重 要的作用。
[0058]众所周知，母胎界面的趋化因子是胚胎植入所必需得因子。有研究表明，人的子宫 内膜中有9种趋化因子高度表达:单核趋化蛋白-3、嗜酸细胞活化趋化因子、ractalkine、巨 细胞炎性蛋白_10、6〇^116、11^-8、!161]1〇;1^11:瓜七6(^趋化因子-1、!161]1〇;1^11:抑七6(^趋化因 子-4和巨噬细胞起源趋化因子。在子宫内膜容受期和妊娠早期，趋化因子mRNA的表达上调。 [0059] 在移植早期，移植部位有高水平的Thl型前炎症细胞因子和IL-6，IL-8，TNF_a等前 炎症细胞因子。这些前炎症细胞因子主要由子宫内膜细胞和移植部位募集而来的免疫细胞 分泌。实际上，胚胎植入过程、胎盘形成过程、早孕和中期妊娠早期更象一个开放伤，该开放 伤需要强有力的炎症应答。在妊娠早期，为了植入，胚胎必需突破子宫的上皮层，破坏子宫 内膜组织而侵入，继之，滋养细胞代替子宫内膜和母体血管平滑肌，以便使胎盘胎儿单位获 得充足的营养。为了确保充分修复子宫内膜和清除细胞碎片，需要一个炎症环境。因此早期 妊娠可以称为前炎症细胞相。
[0060] 近来的研究表明，胚胎的成功种植可能继发于损伤诱导的炎症反应;胚胎植入部 位的趋化因子和前炎症细胞因子水平与IVF/ICSI患者的临床结局成正相关;胚胎植入部位 的趋化因子和前炎症细胞因子是胚胎成功种植的关键。
[0061] IL-8是趋化因子家族的一员，主要由单核细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞 分泌。IL-8有两个主要的功能，一是趋化功能，二是参与与炎症相关的固有免疫应答，称为 前炎症细胞因子。
[0062]在整个月经周期，IL-8主要定位在腔上皮、腺上皮和内皮细胞;在子宫内膜容受前 期和容受期，IL-8的表达明显增高。因IL-8既是趋化因子，又是前炎症细胞因子，故在早孕 和中期妊娠早期，母胎界面和植入部位的IL-8在维持妊娠方面起着极为重要的作用。
[0063]总之，我们的研究结果表明，移植前胚胎培养液中的IL-8是可以检测到的。来自移 植前胚胎的IL-8作为趋化因子和前炎症细胞因子，可能在胚胎植入部位起作用。移植前人 胚胎培养液中IL-8阳性，预示IVF/ICSI患者较高的妊娠率和胚胎种植率，及患者的婴儿活 产数增加，并预示IVF/ICSI患者可能有高的临床妊娠率和较低的流产率。移植前人胚胎培 养液中的IL-8不但可以通过预测移植胚胎的质量来提高IVF/ICSI患者的妊娠率，还可以作 为一个独立的指标来预测IVF/ICSI患者的临床结局。IL-8可以作为IVF/ICSI病人移植前评 价胚胎发育潜能的一个指标用本方法结合现有的形态学方法选择胚胎来进行移植，较现有 的单用形态学方法选择胚胎来进行移植，妊娠率可提高8-12%以上。按照本方法选择的形 态学上的优质移植胚胎及优质和普通移植胚胎移植给体外受精受者，则妊娠率分别为 60.76%及47.37%，如不按本方法选择的形态学上的优质移植胚胎及优质和普通移植胚胎 移植给IVF/ICSI患者，则妊娠率分别为52.59%及34.85%。用本方法结合现有的形态学方 法选择胚胎来进行移植，较现有的单用形态学方法选择胚胎来进行移植，妊娠率可提高8-12%以上。
【主权项】
1. 一种通过选择发育潜能良好的胚胎来改善试管婴儿临床结局的方法，其特征是这种 方法包括以下步骤： (1) 在移植的当天，收集每个体外受精受者的每次胚胎移植前的培养待移植胚胎的培 养液;在体外受精后的第一天，在确认受精后，将每个体外受精受者的每个受精卵分别放置 在30-50yL 10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中，置37°C、5% C02的培养箱中培养至胚胎移 植前;胚胎在体外培至第3天，在进行胚胎移植前的4h-6h，根据以卵裂率和形态学为基础的 形态学评估法评价每个体外受精受者待移植胚胎的质量，每个体外受精受者每次移植2-3 个胚胎;每个体外受精受者的待移植的根据形态学评估法胚胎选定后，将待移植的胚胎移 走，即收集已培养待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的卵裂液液滴，即培养待移植胚胎 的培养液；鉴于每个体外受精受者每次移植2-3个胚胎，每个胚胎在移植前均放置在一个 30-50yL含10 %人血清白蛋白的卵裂液液滴中培养2日，每个体外受精受者的每次胚胎移植 前的培养待移植胚胎的培养液为分别培养2-3个待移植胚胎2日的含10%人血清白蛋白的卵 裂液液滴，收集每个体外受精受者每次胚胎移植前培养待移植胚胎的这2-3个液滴，组成一 份标本，每一份标本含25yL -40yL培养液;收集在同样条件下培养的没有放置胚胎的培养 液作为阴性对照； (2) 用液相芯片高通量的蛋白质分析技术(LHTPA)来检测每一份标本中白细胞介素-8,即IL-8的含量； (3) 根据形态学评估法和标本中白细胞介素-8的含量来选择移植胚胎，将选择的移植 胚胎移植给体外受精受者;可用移植胚胎形态学上质量相同或相似，则选择其培养液中IL-8阳性，即培养液中IL-8浓度范围在0.19 pg/ml至10.32 pg/ml之间的胚胎来进行移植； (4) 如果可用移植胚胎与形态学上质量不相同或不相相似，则选择其培养液中IL-8阳 性，即培养液中IL-8浓度范围在0.19 pg/ml至10.32 pg/ml之间的胚胎和/或选择胎形态 学上质量较好的胚胎来进行移植； (5) 从收集标本到检测出IL-8的时间为4h-6h，故在胚胎移植的当天即可用该方法来 筛选发育潜能较好的胚胎来进行移植。
【文档编号】G01N33/68GK106018825SQ201610341493
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】黄官友
【申请人】黄官友