一种多价肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种多价肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测方法，所述方法，步骤如下：步骤一：将各型单价荚膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液；步骤二：取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始，加入步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积；步骤三：每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品；步骤四：定标品与检测试剂反应，以加入的结合物溶液的糖含量为横坐标，以反应值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤五：将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中单价结合物的糖含量。
【专利说明】
-种多价肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种生物制品检测方法，具体设及一种多价肺炎球菌结合疫苗各型特 异性糖含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 在多价疫苗的质量控制中，对各组分的定量检测是重要的项目之一。目前，多价疫 苗中各组分的定量检测方法包括：
[0003] 化学显色
[0004] 疫苗中某些组分在特定波长范围内具有光吸收，或经化学处理后，形成具有光吸 收的物质，其光吸收程度与含量有相关关系，可用于含量检测。例如，A群C群脑膜炎球菌多 糖结合疫苗中的C群多糖，唾液酸是其有效成分之一，采用间苯二酪对C群脑膜炎球菌多糖 中唾液酸抽提后，在585nm处有最大吸光值。该法的局限性在于，大部分多价疫苗中的各组 分化学性质相近，寻找针对其中一个组分的化学处理方法比较困难。
[0005] 色谱分析
[0006] 阴离子色谱法用于多种单糖、双糖、寡糖、多糖的分析。例如，A群C群脑膜炎球菌多 糖疫苗中的A群多糖，经酸水解处理后，产生6-憐酸甘露糖胺单体，采用高效阴离子交换色 谱-脉冲安培检测法测定其含量。该法的局限性在于，实现多价疫苗中各组分的基线分离困 难，色谱条件复杂，对试剂和环境要求高。
[0007] 酶联免疫吸附
[000引双抗体夹屯屯LISA法常用于抗原的定量检测。A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖 疫苗中各血清群多糖蛋白结合物含量检测采用双抗体夹屯、定量化ISA法。此方法需要制备 各群多糖特异性单抗作为捕获抗体。单抗制备成本较高，产量较低，很难适应规模化检测需 要。
[0009] 免疫火箭电泳
[0010] 免疫火箭电泳通过参照已知浓度的多糖在相同凝胶中的迁移率，对待测的不同浓 度的多糖的迁移速率进行线性回归分析，可W初步计算多糖含量。该法操作过程复杂，是粗 略测定多糖含量的一种方法。
[00川速率比浊
[0012] 速率比浊法是一种免疫化学方法，用于多价疫苗各型特异性糖含量的检测。该方 法W多糖作为抗原，在抗体过量存在的条件下，形成抗原抗体复合物聚集体的速率与体系 中存在的抗原量成一定的比例关系。利用该原理可检测混合物中某一多糖抗原的含量。速 率比浊法操作简便快捷，自动化程度高，不同的多糖可采用相同参数设置进行检测，可适应 规模化检测的需要。
[0013] 常规的特异性糖含量检测，采用标准曲线法，在抗原量充足的条件下，可W得到很 好的检测结果，如23价肺炎球菌多糖疫苗各型特异性糖含量的检测即采用标准曲线法。但 当抗原量较少，且反应体系成分较复杂时，容易造成反应灵敏度降低、检测结果波动较大的 问题。
[0014] 多价肺炎球菌结合疫苗，如：屯价肺炎球菌结合疫苗，包括7种血清型（4、6B、9V、 14、18C、19F和23F)，13价肺炎球菌结合疫苗等均为为已经上市的疫苗，其中每个型多糖含 量远低于肺炎球菌多糖疫苗，而且含有侣佐剂成分，若采用标准曲线法，则检测效率降低， 对检测试剂要求提高。若采用标准加入法，则可W有效地解决W上问题，并且W待检测的疫 苗作为定标物质，消除了定标品与检品之间的成分差异，更具合理性。因此，肺炎球菌结合 疫苗各型特异性糖含量的检测采用标准加入法是非常有效的。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是解决现有的肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量检测方法灵敏 度低、检测结果波动大的问题，而提供一种肺炎球菌结合疫苗各型芙膜多糖蛋白结合物中 多糖含量的检测方法。
[0016] 为了实现上述目的，本发明采取的策略为：W待测结合疫苗为定标品，通过梯度添 加待测型别单价结合物的方式，获得测定曲线，进而获得待测物含量。
[0017] 多价肺炎球菌结合疫苗的组成为多种单价肺炎球菌芙膜多糖蛋白结合物混合组 成的疫苗，其中的肺炎球菌芙膜多糖为但不限于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、 19A、19F、23F型肺炎球菌芙膜多糖，蛋白为载体蛋白，选自但不限于白喉类毒素、破伤风类 毒素等。多糖和蛋白的结合采用但不限于CDAP法。
[0018] 多价肺炎球菌结合疫苗的效价是W肺炎球菌芙膜多糖的含量计算的，为对疫苗的 效价进行评定，需要对肺炎球菌芙膜多糖的含量进行检测，而现有技术的检测方法存在多 种缺陷。
[0019] 为此，本发明提供一种多价肺炎球菌结合疫苗中各型芙膜多糖的糖含量的检测方 法，所述方法，步骤如下：
[0020] 步骤一:将各型单价芙膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液；
[0021 ]步骤二:取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始， 加入步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积；
[0022] 步骤每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品；
[0023] 步骤四：定标品与特异性血清反应，反应时间为1.5-10分钟，W加入的结合物溶液 的糖含量为横坐标，W散射光增加值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0024] 步骤五:将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中 单价结合物的糖含量；
[0025] 所述步骤二中，每份肺炎球菌结合疫苗加入单价芙膜多糖蛋白结合物的体积不大 于总体积的10 %。每份肺炎球菌结合疫苗的体积均不小于总体积的90 %。每份样品用稀释 液稀释至相同的体积，总体积不小于10化L。
[0026] 所述步骤S中，用于解吸附的碱为氨氧化钢，配制成0.1M-10M的水溶液，碱的用量 是样品量的0.001-1倍。所述步骤=中，用于中和的酸为巧樣酸，配制成0.1M-5M的溶液，用 酸调节抑值至检品初始抑值。
[0027] 所述步骤四中反应体系为：缓冲液体积为0-30化L，样品量为3-75化、特异性血清 量为3-23扣L、反应时间为1.5-10分钟，所述缓冲液为:含有表面活性剂的憐酸缓冲生理盐 水，其中憐酸缓冲生理盐水为O. OIM-O. IM的溶液，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂， 配制成0.05 %的溶液。
[00%]本发明的方法，W欲测组份的纯物质为内标品，即W组成多价肺炎球菌结合疫苗 的各型单价结合物为内标品。W经解吸附处理的检品和相应对照品的混合物为定标品，绘 制标准曲线，即W肺炎球菌结合疫苗和各型单价结合物的混合物，经解吸附处理后制备为 定标品，绘制标准曲线。
[0029] 本发明的方法，每个型别的糖含量检测取用的肺炎球菌结合疫苗不少于两份。
[0030] 本发明的方法，分别在若干份相同体积结合疫苗中加入不等量的对照品，且有一 份结合疫苗中加入的对照品为零，W加入对照品的糖含量为横坐标，反应值为纵坐标，绘制 标准曲线，用外推法(延长标准曲线和横坐标相交的数的绝对值)得到检品中对应单价结合 物的糖含量。本发明的方法，所述步骤=中，用于解吸附的碱为碱性物质配制的溶液，选自 无机碱或有机碱，可W采用一种碱或多种碱的混合物。无机碱是指碱金属及碱±金属的氨 氧化物(包括氨氧化锭），优选氨氧化钢，有机碱是指分子中含有氨基的有机化合物。所述氨 氧化钢使用时配制成〇.〇〇謹-261的水溶液，优选0.謹-101的水溶液。
[0031] 本发明的方法，所述步骤S中，用于中和的酸为含有邸TA、巧樣酸、氨基乙酸、氣离 子和/或氯离子的酸溶液，优选巧樣酸溶液，使用时配制成0.001M-7M的溶液，优选0.1M-5M 的溶液。
[0032] 本发明的方法，所述步骤=中，用于解吸附的碱的用量是样品量的0.001-1倍。
[0033] 本发明的方法，所述步骤S中，用酸中和是调节酸碱混合溶液pH值至检品初始pH 值。
[0034] 本发明和现有技术相比，优点如下：
[0035] 适应复杂的反应体系，在抗原含量相对较低的情况下提高信噪比；
[0036] 对血清本底要求降低，简化血清纯化过程；
[0037] 消除定标品与检品之间的成分差异，检测手段更具合理性。
[0038] W下通过实验数据说明本发明的优点：
[0039] 表1:2型肺炎球菌结合物标准曲线法和标准加入法定标比较
[Qn>in1
[0041]如表所示:结合物糖含量较低时(2-化g)，散射光增加值不明显，造成曲线平缓，若 检品含量恰好在此范围内，容易造成检测结果在2-4]ig范围内波动，准确性降低，通过标准 加入法，提高了结合物糖含量，曲线斜率明显升高，有效克服了标准曲线法的缺陷。其次，低 浓度结合物糖含量的散射光增加值与反应体系本底(结合物糖含量化g)差别不明显，可能 达不到检测要求的灵敏度，势必需要提高定标品的含量，标准加入法正符合此需求。最后， 许多情况下，结合疫苗含有佐剂或其它非结合物成分，如果采取标准曲线法，那么佐剂或其 它非结合物成分造成了定标品和检品的组成差异，运种差异对检测准确性的影响需要进一 步验证，如果采用标准加入法，就消除了定标品与检品之间的成分差异，佐剂或其它非结合 物成分对检测准确性的影响将不存在。
【附图说明】
[0042] 图1为本发明实施例1中肺炎球菌结合疫苗中2型肺炎球菌结合物标准曲线图；
[0043] 图2为本发明实施例2中肺炎球菌结合疫苗中7F型肺炎球菌结合物标准曲线图；
[0044] 图3为本发明实施例3中肺炎球菌结合疫苗中12F型肺炎球菌结合物标准曲线图；
[0045] 图4为本发明实施例4中肺炎球菌结合疫苗中18C型肺炎球菌结合物标准曲线图；
[0046] 图5为本发明实施例5中肺炎球菌结合疫苗中23F型肺炎球菌结合物标准曲线图。
【具体实施方式】
[0047] 实施例1肺炎球菌结合疫苗中2型肺炎球菌多糖含量的检测
[004引取2型肺炎球菌结合物，用稀释液将其稀释成多糖浓度为13化g/mL的溶液。
[0049] 取肺炎结合疫苗五份，每份94化L，第一份不加肺炎球菌结合物，第二份加入加入 15化的肺炎球菌结合物，第S份加入加入30化的肺炎球菌结合物，第四份加入加入45化的 肺炎球菌结合物，第五份加入加入60化的肺炎球菌结合物，用稀释液将五份混合溶液稀释 至 ImL。
[0050] 每份混合溶液加入Imol/L氨氧化钢溶液30化，混匀，加入Imol/L巧樣酸溶液如L， 混匀，此混合溶液即为定标品。
[0051 ] 反应体系为:缓冲液19化L，样品量20化、试剂量20化、反应时间2分钟、增益值1。 [0052 ]图1为肺炎球菌结合疫苗中2型肺炎球菌结合物标准曲线图。
[0053] 将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中2型肺炎 球菌结合物的糖含量。从图中可知，外加2型肺炎球菌结合物的糖含量与反应值呈很好的线 性关系，R2 = 0.9989，线性回归方程为y = 3.086X+15.854，其中X是结合物的糖含量，y是反 应值。标准曲线在含量轴上的截距为5.14,即肺炎球菌结合疫苗中2型肺炎球菌结合物的糖 含量为5.1化g。
[0054] 实施例2肺炎球菌结合疫苗中7F型肺炎球菌多糖含量的检测
[0055] 1.取7F型肺炎球菌结合物，用稀释液将其稀释成多糖浓度为13化g/mL的溶液。
[0056] 2. W下步骤同实施例1中步骤2-4。
[0057] 3.图2为肺炎球菌结合疫苗中7F型肺炎球菌结合物标准曲线图。
[005引4.将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中7F型 肺炎球菌结合物的糖含量。从图中可知，外加7F型肺炎球菌结合物的糖含量与反应值呈很 好的线性关系，R2 = 0.9895,线性回归方程为y = 0.49x+2,标准曲线在含量轴上的截距为 4.08，即肺炎球菌结合疫苗中7F型肺炎球菌结合物的糖含量为4.0祉g。
[0059] 实施例3肺炎球菌结合疫苗中12F型肺炎球菌多糖含量的检测
[0060] 1.取12F型肺炎球菌结合物，用稀释液将其稀释成多糖浓度为13化g/mL的溶液。 [0061 ] 2. W下步骤同实施例1中步骤2-4。
[0062] 3.图3为肺炎球菌结合疫苗中12F型肺炎球菌结合物标准曲线图。
[0063] 4.将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中12F型 肺炎球菌结合物的糖含量。从图中可知，外加12F型肺炎球菌结合物的糖含量与反应值呈很 好的线性关系，R2 = 0.9878,线性回归方程为y = 2.9985x+14.676,标准曲线在含量轴上的 截距为4.89，即肺炎球菌结合疫苗中12F型肺炎球菌结合物的糖含量为4.89iig。
[0064] 实施例4肺炎球菌结合疫苗中18C型肺炎球菌多糖含量的检测
[0065] 1.取18C型肺炎球菌结合物，用稀释液将其稀释成多糖浓度为13化g/mL的溶液。
[0066] 2. W下步骤同实施例1中步骤2-4。
[0067] 3.图4为肺炎球菌结合疫苗中18C型肺炎球菌结合物标准曲线图。
[0068] 4.将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中18C型 肺炎球菌结合物的糖含量。从图中可知，外加18C型肺炎球菌结合物的糖含量与反应值呈很 好的线性关系，R2 = 0.9984，线性回归方程为y = 1.005X+3.048，标准曲线在含量轴上的截 距为3.03，即肺炎球菌结合疫苗中18C型肺炎球菌结合物的糖含量为3.03iig。
[0069] 实施例5肺炎球菌结合疫苗中23F型肺炎球菌多糖含量的检测
[0070] 1.取23F型肺炎球菌结合物，用稀释液将其稀释成多糖浓度为13化g/mL的溶液。
[0071] 2. W下步骤同实施例1中步骤2-4。
[0072] 3.图5为肺炎球菌结合疫苗中23F型肺炎球菌结合物标准曲线图。
[0073] 4.将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中23F型 肺炎球菌结合物的糖含量。从图中可知，外加23F型肺炎球菌结合物的糖含量与反应值呈很 好的线性关系，R2 = 0.9944，线性回归方程为y = 2.131X+8.924，标准曲线在含量轴上的截 距为4.19,即肺炎球菌结合疫苗中23F型肺炎球菌结合物的糖含量为4.1化邑。
【主权项】
1. 一种多价肺炎球菌结合疫苗中各型荚膜多糖的糖含量的检测方法，其特征在于，所 述方法，步骤如下： 步骤一:将各型单价荚膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液； 步骤二:取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始，加入 步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积； 步骤三:每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品； 步骤四：定标品与特异性血清反应，反应时间为1.5-10分钟，以加入的结合物溶液的糖 含量为横坐标，以散射光增加值为纵坐标，绘制标准曲线； 步骤五:将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中单价 结合物的糖含量。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，每份肺炎球菌结合疫 苗加入单价荚膜多糖蛋白结合物的体积不大于总体积的10%。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，每份肺炎球菌结合疫 苗的体积均不小于总体积的90%。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，每份样品用稀释液稀 释至相同的体积，总体积不小于100yL。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，用于解吸附的碱为氢 氧化钠，配制成0.1M-10M的水溶液，碱的用量是样品量的0.001-1倍。6. 权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，用于中和的酸为柠檬酸，配 制成0.1M-5M的溶液，用酸调节pH值至检品初始pH值。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤四中反应体系为:缓冲液体 积为0-300yL，样品量为3-75yL、特异性血清量为3-235yL、反应时间为1.5-10分钟，所述缓 冲液为:含有表面活性剂的磷酸缓冲生理盐水，其中磷酸缓冲生理盐水为〇. 01M-0.1M的溶 液，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，配制成〇. 05 %的溶液。
【文档编号】G01N33/68GK106018832SQ201610563165
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月16日
【发明人】胡月凤, 朱卫华, 杜琳
【申请人】北京智飞绿竹生物制药有限公司