一种益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种中药制剂中有效成分的含量测定方法，特别涉及一种益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量测定方法，所述方法，包括如下步骤：对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，加入含水甲醇或流动相制成含有黄芪甲苷0.16～0.24mg1/ml的溶液即可；供试品溶液的制备：取益心复脉颗粒，用浓度为2～5％碱水溶液提取，提取液过固相萃取柱，用甲醇洗脱即可；测定法：将上述对照品溶液和对照品溶液各5～20μl注入高效液相色谱仪中。
【专利说明】
一种益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药制剂中有效成分的含量测定方法，特别涉及一种益心复脉颗 粒中黄芪甲苷含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 益心复脉颗粒是天津天士力（辽宁）制药有限责任公司出品的药品，其功能主治 为益气养阴，活血复脉；用于气阴两虚，心血内阻，胸痹心痛，胸闷不舒，心悸脉结代。具有载 药量高、起效快、无异味、携带方便等特性。益心复脉颗粒是由生晒参、黄芪、麦冬、五味子、 丹参、川芎6味药材组成的复方制剂，其中
[0003] 生晒参：具有大补元气，益血，养心安神的作用。生晒参能提高脑、体力活动能力和 免疫功能，增强抗应激、抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、益心、复脉、安神生津、补肺健脾。
[0004] 麦冬：具有甘寒清润，善清心肺之热而养阴除烦，兼可清润胃肠而止渴润燥。抗实 验性心律失常、增加冠脉流量。
[0005] 五味子：是一种具有辛、甘、酸、苦、咸五种药性。选用传统正品北五味入药，品质优 良。收敛固涩，益气生津，补肾宁心。用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗， 盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠。
[0006] 黄芪：有补气升阳、生血行滞之力，现在药理研究发现，黄芪还可清除氧自由基，减 轻机体脂质过氧化损伤。
[0007] 丹参：有活血祛瘀之功，不仅可以抑制血小板聚集，抑制血栓形成而且所含丹参素 还可抑制胆固醇的合成、抗细胞氧化。
[0008] 川；：活血行气，祛风止痛。可提高血小板中cAMP含量，降低TXA2活性；降低血小 板表面活性、抑制血小板聚集、使已聚集血小板解聚。
[0009] 益心复脉颗粒的药物活性成分很多，主要包括：黄芪甲苷，川芎嗪，三七皂苷，丹参 酬等。
[0010] 由于活性成分众多，因此需要灵敏的检测方法对益心复脉颗粒的活性成分进行 检测，但现有检测方法仅包含性状、2个显色鉴别及检查项下的相关检测项，未进行药材的 定性或定量检测，不能全面反映产品的质量状况，本发明针对君药黄芪建立了产品中黄芪 甲苷含量测定的方法，填补了益心复脉颗粒定量控制的空白，使得对该产品能够进行更有 效的质量分析，更全面反映产品的质量状况，保证该产品的质量稳定性，同时该方法节约检 测成本。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及的一种测定益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量的方法，该方法采用高效液 相色谱法，包括如下步骤：
[0012] 步骤1，对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，加入含水甲醇或流动相制成 含有黄芪甲苷〇. 16~0. 24mgl/ml的溶液即可。
[0013] 步骤2,供试品溶液的制备：取益心复脉颗粒，用浓度为2~5%碱水溶液提取，提 取液过固相萃取柱，用甲醇洗脱即可。
[0014] 步骤3,测定法：将上述对照品溶液和对照品溶液各5~20 μ 1注入高效液相色谱 仪中。
[0015] 其中，步骤（1)中，所述的含水甲醇为50~100%的甲醇，优选60~80%，最优选 70%甲醇。流动相为：乙腈：水=31~36 :69~64。
[0016] 其中，步骤（2)中，所述的碱水溶液为氨水，碳酸氢钠中一种。优选氨水。步骤（2) 中所述的固相萃取柱填料为C18或PLS (聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物），优选C18。步骤 (2)中所述的碱水溶液提取是超声提取，提取液离心即可。
[0017] 优选的步骤（2)的步骤如下：取益心复脉颗粒，精密加3 - 7倍量3~5%氨水，超 声处理20~40分钟使充分溶散，离心，精密移取上清液，以0. 5~1. 5ml/min的速度通过 已处理好的C18固相萃取小柱，水洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇洗脱至量瓶中，即得。
[0018] 步骤（3)中所述的高效液相色谱仪色谱条件：
[0019] 蒸发光散射检测器：包括增益值：50~200 ;漂移管温度：40~60°C ;雾化室温度 设置：冷却cooling ;气体压力：20~30psi ;秒采点数：1~10 ;
[0020] 色谱柱：C - 18 ;
[0021] 流动相：乙腈：水=31~36 :69~64 ;
[0022] 柱温：35 ~42°C ;
[0023] 流速：0· 8 ~1. 5ml/min。
[0024] 除步骤1，2外，本发明还可以包括阴性样品溶液的制备步骤，方法为按益心复脉 颗粒处方配比，取除黄芪的各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品， 再按步骤（2)供试品溶液制备方法，制成阴性样品溶液，按照步骤3注入色谱仪。
[0025] 优选的本发明所述的测定方法，包括如下步骤：
[0026] (1)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每 lml含黄苗甲苷0· 20mg，即得；
[0027] (2)供试品溶液的制备：取益心复脉，精密称定，至50ml锥形瓶中，精密加5倍量 4%氨水，超声处理25分钟使充分溶散，离心，精密移取上清液，以lml/min的速度通过已处 理好的C18固相萃取小柱，用水洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇缓慢洗脱至量瓶中，加甲醇稀 释至刻度摇匀，即得。
[0028] (3)，阴性样品溶液的制备，按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的各味药材，按益 心复脉颗粒制法制备不含黄芪的阴性样品，再按步骤（2)供试品溶液制备方法，制成阴性 样品溶液。
[0029] (4)，注入液相色谱仪，其色谱条件为：色谱柱C18,4.6X150mm，3.5ym或 4· 6X 250mm，5 μ m ;流动相：乙腈：水=35 :65 ;柱温：40 °C ;流速：1.0ml/min ;进样量： 10 μ 1 ;蒸发光散射检测器条件：增益值：1〇〇 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置：冷却 cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
[0030] 试验例
[0031] 本发明优选的所用的仪器与材料如下：
[0032] 1、高效液相色谱仪：美国 WatersHPLC - 2695 - 2424, Empower 工作站。
[0033] 2、色谱柱
[0034] ①反相色谱柱，适合于低PH值色谱柱，固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料， Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 X 150mm，3.5 μ m);
[0035] ②反相色谱柱，通用性宽ΡΗ值色谱柱，固定相以纯度高达99. 999%的高纯硅胶为 填料，OmniBond HPLC Column Orca C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);
[0036] ③反相色谱柱，适合于低PH值色谱柱，固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料， Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);
[0037] 3、试剂：乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）。
[0038] 甲醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司）。
[0039] 4、对照品：黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：110781 -201314,含量测定 用）。
[0040] 5、样品：益心复脉颗粒，天津天士力（辽宁）制药有限责任公司，编号（或批号）： 试验 1、试验 2、试验 3、20130205、20130304。
[0041] 本发明优选的实验方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程 如下：
[0042] 益心复脉颗粒的处方及制法
[0043] 本发明的益心复脉颗粒处方如下：生晒参75 -225g、黄芪75 -225g、麦冬75 -225g、 五味子50 - 150g、丹参100 - 300g、川芎50 - 150g和适量辅料制成。
[0044] 优选的益心复脉颗粒的制备如下：
[0045] 【处方】生晒参150g黄芪150g麦冬150g五味子100g丹参200g川芎100g
[0046] 【制法】以上6味药材，加水煎煮2次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二 次加水8倍量，煎煮1小时，合并煎煮液，静置12小时，吸取上清液，浓缩至相对密度 1. 20-1. 30 (80°C测）的清膏，加入1 %的甜叶菊甙，混合均匀，取清膏1份，加入糊精1份，干 燥，粉碎，过60目筛，加入乳糖2份，混匀，制成600g，分装，即得。
[0047] 试验例1流动相的选择；
[0048] 按照实施例1的分离黄芪甲苷的液相色谱条件进行的考察，在满足分离度要求的 前提下，按照表1调整流动相的比例，流动相：乙腈：水=31 - 36 :69 - 64,色谱图如图1、图 2、 图3、图4和图5所示。优选A% : B% =乙腈：水（35 :65)流动相条件下，黄芪甲苷与相 邻杂质峰的分离度最优，分析时长为20min。
[0049] 表1流动相的比例
[0050]
[0051]
[0052] 试验例2色谱柱的选择
[0053] 分别取下述色谱柱按照实施例的方法测定。
[0054] ① Agilent ZORBAX SB - C18(4. 6X150mm，3. 5 μπι);
[0055] ② OmniBond HPLC Column Orca C18(4· 6X250mm，5 μm);
[0056] ③：Agilent ZORBAX SB - C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，
[0057] 色谱图如图6、图7和图8所示。
[0058] 分析图6 -图8,比较与相邻色谱峰的分离度及保留时间，可见图7最优，故选 Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 X 150mm，3.5 μ m)作为方法测定的色谱柱。
[0059] 实施例3提取溶剂及方法考察
[0060] 方法①
[0061] 取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入15ml4%氨水， 密封，超声处理（功率120W，频率40KHZ) 20 - 25分钟使充分溶散，放冷，摇匀，离心（3000 转，10min)，精密移取上清液10ml，以lml/min的速度通过已处理好的C 1S固相萃取小柱 (500mg，先以甲醇5ml洗脱，再以水5ml洗脱）用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓 慢洗脱至2ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。此供试品处理方法测得黄芪甲苷 的含量为：〇. 1947mg/g色谱图如图9所示。
[0062] 方法②
[0063] 精密称取益心复脉颗粒2. 5g，分别置50ml三角瓶中，加入表2中所示的甲醇溶液 各25ml，密封，超声提取30分钟，放冷，过滤，回收甲醇，残渣用2ml甲醇定容，即得。结果分 别为色谱图如图11、图12、图13和图14所示。
[0064] 表2甲醇溶度
[0065]
[0066]方法 @
[0067] 精密称取益心复脉颗粒2. 5g，置锥形瓶中，精密加甲醇50ml，超声30min。滤过，水 浴蒸干，残渣加水20ml使溶解，水液用水饱和的正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液， 用氨试液洗涤3次，每次20ml，弃去氨试液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，定量转移 至2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，即得，此方法 测得黄芪甲苷的含量为：〇. 〇482mg/g。色谱图如图15所示。
[0068] 方法④
[0069] 取益心复脉颗粒适量，研细，取3g，精密称定，加甲醇50ml，超声30分钟，置水浴上 蒸干，残渣加水40ml使溶散，用乙酸乙酯提取2次，每次40ml，弃去乙酸乙酯液，水液用饱 和的正丁醇提取4次，每次30ml合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次50ml，再用水洗涤 2次，每次50ml，取正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，置2ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻 度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，此方法测得黄芪甲苷的含量为：〇.〇627mg/g。色谱图如图 16所示。
[0070] 方法⑤
[0071] 精密称取益心复脉颗粒5g，加水40ml，超声溶解，精密吸取20ml，置分液漏斗中， 用水饱和的正丁醇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次20ml，正丁 醇液蒸干，残渣加甲醇溶解置5ml容量瓶中，作为供试品溶液，此方法测定黄芪甲苷的含量 为：0· 1259mg/g。色谱图如图17所示。
[0072] 综合比较上述5种供试品处理方法结果见表3,我们发现供试品制备方法①测得 的黄芪甲苷的含量最高，故在以后的研究中将此供试品处理方法作为益心复脉颗粒黄芪甲 苷含量测定的供试品处理方法。
[0073] 表3,不同方法的黄苗甲苷含量值
[0074]
[0075] 试验例4碱水的选择
[0076] 按照实施例1的方法，碱水条件按照表4处理，结果如下：
[0077] 表4,不同种类及浓度碱水处理的黄芪甲苷含量值
[0078]
[0079] 结果表明，2 - 5%的m7K、5%候酸S钢提取双呆牧奸，优选4%氨水。
[0080] 试验例5不同固相萃取柱原料对黄芪甲苷含量值的影响
[0081] 按照实施例1的方法，固相萃取柱按照表5处理，结果如下：
[0082] 表5,不同固相萃取柱的黄苗甲苷含量值
[0083]
[0084] 结果表明，C18固相萃取小柱和LS萃取小柱处理后的黄芪甲苷含量值高，优选C18 固相萃取小柱。
[0085] 试验例6益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量测定的方法学考察
[0086] 1、标准曲线的制备
[0087] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70 %甲醇分别制成每1ml含黄芪甲苷 0· 007988、0· 01997、0· 03994、0· 07988、0· 15976mg 的系列溶液，分别精密进样 20 μ 1，注入 液相色谱仪，按优选方案步骤4的色谱条件进行分析，测定各自峰面积，以对照品浓度的对 数为横坐标，峰面积值的对数为纵坐标，求得回归方程：黄芪甲苷Υ = 1. 4203Χ+6. 907, r = 0. 9993。结果表明黄芪甲苷在0. 07616~0. 7616mg/ml范围内线性良好，结果见表6,线性 图谱见图18。
[0088] 表6黄芪甲苷标准曲线
[0089]
[0090] 2、进样精密度试验
[0091] 取黄芪甲苷对照品，按照优选方案步骤1对照品溶液制备操作，按优选方案步骤 4的色谱条件进行分析，连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积，测得峰面积平均值分别为 797256,峰面积的RSD分别为1. 6%，符合要求，结果见表7,图谱见图19。
[0092] 表7进样精密度试验
[0093]
[0094] 3、重复性试验
[0095] 取同一批（编号：试验3)样品，制备低、中、高3种浓度的供试品溶液，浓度范围 为75 %~125 %，共9份，，按照优选方案步骤2供试品溶液制备操作，按优选方案步骤4的 色谱条件进行分析，测定每份样品中黄芪甲苷的含量。结果样品中黄芪甲苷平均含量为 0. 1907mg/g，RSD分别为2. 4%，重复性良好，结果见表8,图谱见图20。
[0096] 表8重复性试验
[0097]
[0098] 4、稳定性试验
[0099] 取同一批（编号：试验3)样品，取1份，精密称定3.0g，按照优选方案步骤2供试 品溶液制备操作，按优选方案步骤4的色谱条件进行分析，分别在0、2、4、6、10、14、18、20及 24小时，测定样品中黄芪甲苷峰面积，测得峰面积值的RSD分别为1. 8%，结果表明供试品 溶液在24小时内测定稳定，结果见表9,图谱见图21。
[0100] 表9稳定性试验
[0101]
[0102] 5、回收率试验
[0103] 取同一批（编号：试验3)样品，取供试品称样量的1/2,精密称定9份，分别加入 对照品（溶液）适量，按照优选方案步骤2供试品溶液制备操作3个不同浓度的含相应对 照品的供试品溶液（以供试品溶液所含待测成分的浓度为1〇〇%，3个不同浓度为75%~ 125% )，每个浓度制备3份供试品溶液，按优选方案步骤4的色谱条件进行分析，计算回收 率，结果黄芪甲苷平均回收率为102. 8%，RSD分别为4. 0%，结果见表10,图谱见图22,回 收率试验符合要求。
[0104] 表10益心复脉颗粒中黄芪甲苷回收率试验
[0105]
[0106]
[0107] 6、耐用性试验
[0108] 取同一批（编号：试验3)样品，按照优选方案步骤2供试品溶液制备操作，分别用 Agilent ZORBAX C- 18 (4.6 X 250mm，3.5 μ m) ;OmniBondhubble C- 18(5 μ m 4.6 X 250mm) 色谱柱，按优选方案步骤4的色谱条件进行分析，测定样品中黄芪甲苷含量，结果见表11， 图谱见图23和图24。测定结果显示，不同品牌色谱柱对含量测定的结果无影响。
[0109] 表11不同色谱柱对含量测定的影响
[0110]
[0111] 7、理论板数的确定
[0112] 综合考虑益心复脉颗粒2种不同色谱柱的分离情况及理论塔板数结果，见表，将 黄芪甲苷的理论板数规定为不得低于5000。
[0113] 本发明的有益效果：本发明建立的液相色谱测定益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量的 方法，符合方法学验证的要求，并操作简便，灵敏度高，测定准确，适用性强，能够用于对该 产品的质量控制。同时，填补了该产品定量控制的空白，使得对该产品能够进行更有效的质 量分析，更全面反映产品的质量状况，保证该产品的质量稳定性。
【附图说明】
[0114] 图1 A% : B% =乙腈冰（31 :69)色谱图
[0115] 图2 A% : B% =乙腈：水（33 :67)色谱图
[0116] 图3 A% : B% =乙腈：水（34 :66)色谱图
[0117] 图4 A% : B% =乙腈：水（35 :65)色谱图
[0118] 图5 A% : B% =乙腈：水（36 :64)色谱图
[0119] 图 6 OmniBond HPLC Column Orca C18 米集色谱图
[0120] 图 7 Agilent ZORBAX SB - C18 (4. 6 X 150mm，3. 5 μ m)采集色谱图
[0121] 图 8 Agilent ZORBAX SB - C18(4. 6 X 250mm，5 μ m)采集色谱图
[0122] 图9供试品处理①所得色谱图
[0123] 图10供试品处理③100%甲醇所得色谱图
[0124] 图11供试品处理③90 %甲醇所得色谱图
[0125] 图12供试品处理③80 %甲醇所得色谱图
[0126] 图13供试品处理③70%甲醇所得色谱图
[0127] 图14供试品处理④色谱图
[0128] 图15供试品处理⑤色谱图
[0129] 图16供试品处理⑥色谱图
[0130] 图17线性图谱
[0131] 图18进样精密度图谱
[0132] 图19重复性图谱
[0133] 图20稳定性图谱
[0134] 图21黄芪甲苷回收率图谱
[0135] 图 22 Agilent ZORBAX C - 18 色谱柱谱图
[0136] 图 23 OmniBond Hubble C - 18 色谱柱谱图
[0137] 图24试验3样品色谱图
[0138] 图25试验1样品色谱图
[0139] 图26试验2样品色谱图
[0140] 图27批号20130205样品色谱图
[0141] 图28批号20130304样品色谱图
【具体实施方式】
[0142] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0143] 实施例1取编号为试验3的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0144] 步骤1，对照品洛液的制备
[0145] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0. 20mg即 得。
[0146] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加4%氨水15ml，超声处理25分钟使充分溶散，离心（3000转、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml量 瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0147] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0148] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;进样量：10 - 20 μ 1。检测器条件：增益值：100 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
[0149] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1907mg，结果见图24。
[0150] 实施例2取编号为试验1的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0151] 步骤1，对照品溶液的制备
[0152] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0153] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加4%氨水15ml，超声处理25分钟使充分溶散，离心（3000转、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml量 瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0154] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0155] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色 谱条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : B% =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;进样量：10 - 20 μ 1。检测器条件：增益值：100 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
[0156] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1654mg，结果见图25。
[0157] 实施例3取编号为试验2的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0158] 步骤1，对照品溶液的制备
[0159] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0160] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加4%氨水15ml，超声处理25分钟使充分溶散，离心（3000转、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml量 瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0161] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0162] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;进样量：10 - 20 μ 1。检测器条件：增益值：100 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
[0163] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1090mg，结果见图26。
[0164] 实施例4取批号为20130205的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量。
[0165] 步骤1，对照品溶液的制备
[0166] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0167] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加4%氨水15ml，超声处理25分钟使充分溶散，离心（3000转、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml量 瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0168] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0169] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;进样量：10 - 20 μ 1。检测器条件：增益值：100 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
[0170] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1147mg，结果见图27。
[0171] 实施例5取批号为20130304的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0172] 步骤1，对照品溶液的制备
[0173] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0174] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加4%氨水15ml，超声处理25分钟使充分溶散，离心（3000转、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml量 瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0175] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0176] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;进样量：10 - 20 μ 1。检测器条件：增益值：100 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
[0177] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1754mg，结果见图28。
[0178] 实施例6取编号为试验3的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0179] 步骤1，对照品溶液的制备
[0180] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0. 16mg即 得。
[0181] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加2 %氨水9ml，超声处理20分钟使充分溶散，离心（3000转、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以0. 5ml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲 醇5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0182] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0183] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱温：35°C ;流速：0. 8ml/ min ;进样量：10 μ 1。检测器条件：增益值：50 ;漂移管温度：40°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：20psi ;秒采点数：1。
[0184] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1807mg。
[0185] 实施例7取编号为试验3的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0186] 步骤1，对照品洛液的制备
[0187] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0. 24mg即 得。
[0188] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加5 %氨水21ml，超声处理40分钟使充分溶散，离心（3000转、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以1. 5ml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲 醇5ml洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0189] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0190] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : B% =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 5ml/ min ;进样量：20 μ 1。检测器条件：增益值：200 ;漂移管温度：60°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：20psi ;秒采点数：10。
[0191] 测得每g益心复脉颗粒中黄芪甲苷的含量为0. 1925mg。
[0192] 实施例8取编号为试验3的益心复脉颗粒，测定其黄芪甲苷的含量
[0193] 步骤1，对照品洛液的制备
[0194] 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0. 20mg即 得。
[0195] 步骤2,供试品溶液的制备，方法如下：取益心复脉颗粒约3. 0g，精密称定，至50ml 锥形瓶中，精密加4%氨水15ml，超声处理25分钟使充分溶散，离心（3000转、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通过已处理好的PLS萃取小柱（500mg，先以甲醇5ml 洗脱，再以水5ml洗脱），用水5ml洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇2ml缓慢洗脱至2ml量瓶中， 加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。
[0196] 步骤3,阴性样品溶液的制备，方法如下：按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的 各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲苷的阴性样品，再按步骤2供试品溶液制 备方法，制成阴性样品溶液。
[0197] 步骤4,注入液相色谱仪，计算黄芪甲苷含量，方法如下：采用液相色谱法，其色谱 条件为：C - 18色谱柱；流动相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱温：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;进样量：10 - 20 μ 1。检测器条件：增益值：100 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置： cooling ;气体压力：30psi ;秒采点数：2。
【主权项】
1. 一种益心复脉颗粒中黄芪甲苷含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，加入含水甲醇或流动相制成含有黄 苗甲苷0. 16~0. 24mgl/ml的溶液即可； (2) 供试品溶液的制备：取益心复脉颗粒，用浓度为2~5%碱水溶液提取，提取液过固 相萃取柱，用甲醇洗脱即可； (3) 测定法：将上述对照品溶液和对照品溶液各5~20 μ 1注入高效液相色谱仪中。2. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的碱水溶液为氨水，碳 酸氢钠中一种。3. 如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的碱水溶液为氨水。4. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2)中所述的固相萃取柱填料为 C18或聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。5. 如权利要求4所述的测定方法，其特征在于，步骤（2)中所述的固相萃取柱填料为 C18〇6. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（2)中所述的碱水溶液提取超声 提取，提取液离心即可。7. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（2)如下：取益心复脉颗粒，精密 加3~7倍量4%的氨水，超声处理20~40分钟使充分溶散，离心，精密移取上清液，以 0. 5~1. 5ml/min的速度通过已处理好的C18固相萃取小柱，水洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇 洗脱至量瓶中，即得。8. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（3)中所述的高效液相色谱仪色谱 条件： 蒸发光散射检测器：包括增益值：50~200 ;漂移管温度：40~60°C;雾化室温度设置： 冷却cooling ;气体压力：20~30psi ;秒采点数~10 ; 色谱柱：C - 18 ; 流动相：乙腈：水=31~36 :69~64 ; 柱温：35~42°C ; 流速：〇· 8 ~1. 5ml/min〇9. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，还包括阴性样品溶液的制备步骤，方法 为按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的各味药材，按益心复脉颗粒制法制备不含黄芪甲 苷的阴性样品，再按步骤（2)供试品溶液制备方法，制成阴性样品溶液。10. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每lml含 黄芪甲苷0.20mg，即得； (2) 供试品溶液的制备：取益心复脉，精密称定，至50ml锥形瓶中，精密加5倍量4%氨 水，超声处理25分钟使充分溶散，离心，精密移取上清液，以lml/min的速度通过已处理好 的C18固相萃取小柱，用水洗脱，洗脱液弃去，再用甲醇缓慢洗脱至量瓶中，加甲醇稀释至 刻度摇匀，即得。 (3) ，阴性样品溶液的制备，按益心复脉颗粒处方配比，取除黄芪的各味药材，按益心复 脉颗粒制法制备不含黄芪的阴性样品，再按步骤（2)供试品溶液制备方法，制成阴性样品 溶液。 (4)，注入液相色谱仪，其色谱条件为：色谱柱C18,4. 6 X 150mm，3. 5 μ m或4. 6 X 250mm， 5μπι;流动相：乙腈：水=35 :65 ;柱温：40°C ;流速：1.0ml/min ;进样量：10μ1 ;蒸发光散 射检测器条件，包括增益值：1〇〇 ;漂移管温度：50°C ;雾化室温度设置：冷却cooling ;气体 压力：30psi ;秒采点数：2。
【文档编号】G01N30/02GK106033075SQ201510110146
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月12日
【发明人】侯春莲, 刘海涛, 高展, 葛丹丹, 孙玉侠, 曹凤兰, 徐立元, 赵光燃, 杨建会, 杨雪梅
【申请人】天士力制药集团股份有限公司, 天津天士力（辽宁）制药有限责任公司