一种胖大海扫描电镜样品的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种胖大海扫描电镜样品的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：1)将胖大海对半纵切；2)对半纵切后的胖大海在37～65℃烘干72～168h；3)将步骤2得到的胖大海进行种皮和子叶分离；4)将步骤3得到的样品放入熏染装置内进行锇酸熏染；5)熏染后的样品在通风厨中通风15～30min使样品表面残存锇酸挥发；6)将步骤5得到的样品放入真空干燥器干燥2～4h；7)用镊子轻夹取样品的侧面，保证观察面向上，使用导电胶按顺序将样品牢固粘在金属样品台上，放入离子溅射仪中进行喷金镀膜及扫描电镜观测采图。本发明的有益效果：本发明制成的样品中保持胖大海较完整的外观形态，扫描电镜观察时组织结构清晰，图像立体感强，具有高效、简便等优点。
【专利说明】
_种胖大海扫描电镜样品的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及扫描电镜样品的制备方法，具体是一种胖大海扫描电镜样品的制备方法。
【背景技术】
[0002]梧桐科植物干燥成熟种子胖大海具有清热润肺，利咽解毒，润肠通便等作用，是传统的药食两用中药材。由于其具有较强的吸水膨胀特性，近年来还在渗透活性和推动剂等药剂学研究领域引起重视。通过对胖大海超微结构的分析研究，对于深度挖掘其在生物医学研究中的作用具有重要意义。
[0003]由于胖大海具有强的吸水膨胀特性，常规的扫描电镜样品制备时使用戊二醛固定液浸泡固定会使胖大海膨胀，外层种皮破裂，剥离脱落，中层和内层种皮剥离，在后续漂洗、脱水等制备过程中容易破损和丢失，影响整体结构的观察和分析。
[0004]扫描电镜技术是使用高能电子束对样品表面进行轰击，样品被激发发射二次电子成像，获得比光学显微镜观察更精细的样品结构特征，是医学生物研究的重要手段。传统的生物样品扫描电镜标本制备须使样品内的游离水分充分置换出来，以免在扫描电镜观察时样品因电子束轰击产生水蒸气遭遇高能电子流电离而放电，导致图像模糊、雾状，甚至无法成像的现象。因此，样品的干燥程度成为成功制备扫描电镜样品的关键因素。
[0005]锇酸是一种非电解质强氧化剂，作为生物样品的固定剂，能与各种氨基酸、肽及蛋白质反应，在蛋白质分子间形成交联，使蛋白质分子固定，还能与不饱和脂肪酸反应，通过形成锇酸二酯键，使脂肪得以固定。锇酸有较强的电子染色作用，经过锇酸固定的样品图像有较好的反差，是电镜技术中广泛使用的优良固定剂，但锇酸有剧毒且易升华挥发，对眼、鼻、喉粘膜有强烈的刺激作用，容易对人体和环境造成污染伤害。
[0006]由于胖大海独特的吸水膨胀特性，导致在常规样品制备过程中需要消耗大量的戊二醛和锇酸固定液，而戊二醛和锇酸为挥发性毒性试剂，不仅大大增加了实验成本，也容易对操作人员和环境造成更大的污染。
[0007]目前，对胖大海显微结构方面的研究技术尚不成熟，传统的扫描电镜样品制备技术尚难以通过进行常规的固定、漂洗和脱水等而获得胖大海结构完整的样品，在扫描电镜下观察时存在胖大海结构破损的问题，而不固定和染色的样品在观察时则存在图像不清晰的问题。因此，在国家自然科学基金(N0.81560608)、广西自然科学基金(N0.2015GXNSFA139123)、广西医科大学青年科学基金(N0.GXMUYSF2014022)广西医科大学青年科学基金的资助下，本课题组对胖大海扫描电镜制样技术进行了改进，使得胖大海较完整的组织超微结构得到更好的呈现，解决了胖大海在常规扫描电镜制样过程中固定、漂洗和脱水过程中所出现的结构破坏丢失以及非固定染色样品采集图像不清晰等问题。同时也对解决该技术在应用于其他研究领域时所出现的类似问题提供一定的参考。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术中的缺陷，提供一种胖大海扫描电镜样品的制备方法。
[0009]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0010]一种胖大海扫描电镜样品的制备方法，按以下步骤操作:
[0011]1.将胖大海对半纵切:用长形直镊或夹片平行胚轴纵向固定胖大海，使用锐利刀片沿胖大海的胚轴垂直纵向对半剖开，避免两片子叶的破损。
[0012]2.将步骤I纵向对半剖切后的胖大海在37?65°C烘干72?168h。
[0013]3.将步骤2得到的胖大海进行种皮和子叶分离，得到样品。
[0014]4.将步骤3得到的样品放入熏染装置内进行锇酸熏染，熏染条件:锇酸溶液的质量浓度为I?2%，熏染条件为在4°C中熏染15?120min或室温熏染5?60min，得到熏染后的样品O
[0015]5.将步骤4熏染后的样品在通风厨中通风15?30min使样品表面残存锇酸挥发，得到无残存锇酸的样品。
[0016]6.将步骤5无残存锇酸的样品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥无残存锇酸的样品。
[0017]7.用镊子轻夹取步骤6样品的侧面，保证观察面向上，使用导电胶按顺序将样品牢固粘在金属样品台上，放入离子溅射仪中进行喷金镀膜，喷金镀膜的条件:喷金时间总长3?5min，在总喷金时间内分5?15次喷镀，喷镀金属膜厚度10?20nm。扫描电镜进行观测采图。
[0018]上述步骤3中对步骤2得到的胖大海子叶侧沿施加适当压力，使干燥后的种皮与子叶实现钝性分离并避免破裂。
[0019]上述步骤4中的熏染装置能避免样品直接接触锇酸溶液而利用锇酸挥发蒸汽进行熏染，熏染后可进行锇酸的回收和再利用。
[0020]本发明的优点或有益效果:
[0021]1.本发明通过将胖大海沿着胚轴纵向对半剖开，并对剖开后的种子进行烘干干燥，能够使外层种皮包裹下的中层种皮、内层种皮和子叶组织内的水分进一步充分蒸发，利于后续的扫描电镜样品制备。
[0022]2.本发明解决了胖大海进行扫描电镜样品制备过程中，戊二醛和锇酸固定液使用量大、毒性挥发性试剂容易挥发对人体和环境造成污染、固定液浸泡导致胖大海吸水膨胀，种皮破裂、剥离以致在后续制备过程中容易缺损和丢失、影响种子整体结构的观察、样品脱水不充分在电子束轰击产生水蒸气遭遇高能电子流电离放电导致图像模糊、雾状，甚至无法成像的现象等问题。
[0023]3.本发明对烘干后的种子进行锇酸的熏染并在熏染后进行锇酸的回收，不仅大大减少了剧毒物质锇酸的使用，减少了其对人体和环境的影响，也通过使用锇酸熏染对种子含有的蛋白质和脂质等成分进行了固定，有利于组织细胞结构的保存，减少了样品在处理过程中的变形，增强了种子扫描电镜成像的反差。
[0024]4.本发明使最后得到的样品结构完整，无明显破损、丢失现象，样品结构清晰可现，图像立体感强。
【附图说明】
[0025]图1是采用本发明制备方法得到的胖大海外层种皮的扫描电镜图像。
[0026]图2是图1中的扫描电镜图像进一步放大后的图像。
[0027]图3是采用本发明制备方法得到的子叶内表面的扫描电镜图像。
[0028]图4是图3中的扫描电镜图像进一步放大后的图像。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
[0030]一种胖大海扫描电镜样品的制备方法，按以下步骤操作:
[0031 ] 1.将胖大海对半纵切:用长形直镊或夹片平行胚轴纵向固定胖大海，使用锐利刀片沿胖大海的胚轴垂直纵向对半剖开，避免两片子叶的破损。
[0032]2.将步骤I纵向对半剖切后的胖大海在37?65°C烘干72?168h。
[0033]3.将步骤2得到的胖大海进行种皮和子叶分离，得到样品。
[0034]4.将步骤3得到的样品放入熏染装置内进行锇酸熏染，熏染条件:锇酸溶液的质量浓度为I?2%，熏染条件为在4°C中熏染15?120min或室温熏染5?60min，得到熏染后的样品O
[0035]5.将步骤4熏染后的样品在通风厨中通风15?30min使样品表面残存锇酸挥发，得到无残存锇酸的样品。
[0036]6.将步骤5无残存锇酸的样品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥无残存锇酸的样品。
[0037]7.用镊子轻夹取步骤6样品的侧面，保证观察面向上，使用导电胶按顺序将样品牢固粘在金属样品台上，放入离子溅射仪中进行喷金镀膜，喷金镀膜的条件:喷金时间总长3?5min，在总喷金时间内分5?15次喷镀，喷镀金属膜厚度10?20nm。扫描电镜进行观测采图，得到的样品图像如图1、图2、图3和图4所示。
[0038]上述步骤3中对步骤2得到的胖大海子叶侧沿施加适当压力，使干燥后的种皮与子叶实现钝性分离并避免破裂。
[0039]上述步骤4中的熏染装置能避免样品直接接触锇酸溶液而利用锇酸挥发蒸汽进行熏染，熏染后可进行锇酸的回收和再利用。
[0040]总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
【主权项】
1.一种胖大海扫描电镜样品的制备方法，其特征在于:操作步骤如下: 1)将胖大海对半纵切:用长形直镊或夹片平行胚轴纵向固定胖大海，使用锐利刀片沿胖大海的胚轴垂直纵向对半剖开，避免两片子叶的破损； 2)将步骤I)纵向对半剖切后的胖大海在37?65°C烘干72?168h; 3)将步骤2)得到的胖大海进行种皮和子叶分离，得到样品； 4)将步骤3)得到的样品放入熏染装置内进行锇酸熏染，熏染条件:锇酸溶液的质量浓度为I?2%，熏染条件为在4°C中熏染15?120min或室温熏染5?60min，得到熏染后的样品; 5)将步骤4)熏染后的样品在通风厨中通风15?30min使样品表面残存锇酸挥发，得到无残存锇酸的样品； 6)将步骤5)无残存锇酸的样品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥无残存锇酸的样品; 7)用镊子轻夹取步骤6)样品的侧面，保证观察面向上，使用导电胶按顺序将样品牢固粘在金属样品台上，放入离子溅射仪中进行喷金镀膜，喷金镀膜的条件:喷金时间总长3?5min，在总喷金时间内分5?15次喷镀，喷镀金属膜厚度10?20nm，扫描电镜进行观测采图。2.根据权利要求1所述的一种胖大海扫描电镜样品的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中对步骤2)得到的胖大海子叶侧沿施加适当压力，使干燥后的种皮与子叶实现钝性分离并避免破裂。3.根据权利要求1所述的一种胖大海扫描电镜样品的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中的熏染装置能避免样品直接接触锇酸溶液而利用锇酸挥发蒸汽进行熏染，熏染后可进行锇酸的回收和再利用。
【文档编号】G01N23/22GK106053178SQ201610613599
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】黄远洁, 胡艳玲
【申请人】广西医科大学