一种基于abei修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡那霉素的方法
【专利摘要】一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡那霉素的方法。其特征在于：基于微孔板所构建的N?(4?氨丁基)?N?乙基异鲁米诺(ABEI)?H2O2?对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长。巯基化互补链连接ABEI修饰的花状纳米金被用于信号探针。固定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。所构建的适配体传感器可以实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测，在一定的浓度范围内，其化学发光强度与靶标的量呈负对数相关。此外，也将该传感器用于实际样品检测，证明传感器的优良性能。
【专利说明】
一种基于ABE I修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和 卡那霉素的方法
技术领域
[0001 ] 一种基于N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)修饰的花状纳米金和微孔板同时 检测土霉素，四环素和卡那霉素三种抗生素的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用 于对食品中土霉素，四环素和卡那霉素进行检测。
【背景技术】
[0002] 土霉素和四环素属于四环素类抗生素，卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，它们都 属于光谱抗生素，并在畜牧业中广泛应用。但是，这些抗生素的滥用不仅会对动物自身造成 损害，也会对人类产生不良的影响，因为抗生素会在食物链传递过程中富集。这些副作用包 括损伤听力，损伤肾脏，引起过敏反应以及诱导人类的动物产生抗药性，此外滥用抗生素也 会对环境产生不良的作用。因此欧盟已经对抗生素制定了严格的限量标准，标准规定土霉 素、四环素和卡那霉素在牛奶中的最高残留限量分别为l〇〇yg/kg，lOOyg/kg和150yg/kg。即 使这样，食品中仍然存在抗生素残留超标的情况，并且往往是多种抗生素残留并存。因此， 建立一种快速和高通量的检测方法是至关重要的。
[0003] 根据已经报道的食品中抗生素残留的高通量检测方法。目前为止，能够实现对多 组分同时检测的模式主要有两种，一种是多色标记法，一种是空间分辨法。对于多色标记模 式而言，其中一个重要的部分就是合成诸如多色荧光标记的纳米材料，多色量子点，时间分 辨纳米材料，上转换纳米材料等。而合成多色标记的纳米材料本身不是一项简单的工作，并 极大增加了检测方法的难度。此外，在合成多色标记的纳米材料过程中，增加标记物或标记 信号的数量是较难实现的，这在很大程度上制约了多组分检测中靶标的种类。然而，基于空 间分辨的检测模式可以使用一种通用的标记物而借助空间的分割来实现多组分的检测，在 多组分检测中可能具有更广泛的应用。
[0004] 适配体是一段具有三维空间结构的单链DNA或RNA，它可以与靶标发生特异性结 合。因此，在生物传感器中，适配体可以被用作一种优良的分子识别元件。适配体在很多方 法的优良特性都可以与抗体相媲美。并且，适配体在生物传感方面拥有比抗体更加优良的 特性。首先，适配体是在体外设计和筛选的，因此，原则上，任何靶标都可以有它对应的适配 体，其次，适配体在信号传导和化学修饰方面具有更加优良的特性。近年来，化学发光方法 在食品安全检测方面具有广泛的应用。众所周知，化学发光的实现依赖于化学发光试剂，这 些化学发光试剂通常需要额外标记到检测体系中才能实现化学发光的检测。然而，随着纳 米材料的不断发展，化学发光试剂标记的纳米材料瘦到越来越多的关注。在我们课题组之 前的一篇报道中，我们已经成功合成ABEI修饰的花状纳米金，并且成功构建了ABEI-H 202-PIP稳态化学发光体系。
[0005] 本发明基于微孔板的空间分辨模式，构建了一种新型多组分化学发光检测系统， 并成功实现对三种抗生素的同时检测。基于稳态化学发光体系的构建以及ABEI修饰的花状 纳米金的合成，为在微孔板上利用鲁米诺型化学发光提供了可能性。发明所构建的适配体 传感器能利用微孔板自带的空间分辨性能，以及纳米材料的易修饰性，更适用于高通量和 多组分检测。
【发明内容】
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[0006] 一种基于N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)修饰的花状纳米金和微孔板同时 检测土霉素，四环素和卡那霉素三种抗生素的方法。其特征在于：基于微孔板所构建的 ABEI-H2〇2-对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长至1500s.巯基 化互补链(cDNA)连接ABEI修饰的花状纳米金(ABEI-AuNFs)被用于信号探针。固定在微孔板 上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的三个区域为 靶标的同时检测提供了空间上的分辨。适配体首先与信号探针通过碱基互补配对而结合， 在靶标存在的情况下，适配体会倾向于与靶标结合从而引起信号探针部分脱落，导致化学 发光信号强度的变化。因此所构建的适配体传感器可以实现对土霉素、四环素和卡那霉素 的同时检测，在一定的浓度范围内，其化学发光强度与靶标的量呈负对数相关。此外，也将 该传感器用于实际样品检测，检测结果与商业化ELISA检测方法所得到的结果类似，证明了 该传感器的优良性能。所构建的检测方法具有操作简单、选择性和特异性高等优点，在食品 安全检测领域尤其是多组分检测方面具有较大的应用潜力。检测步骤为：
[0007] (l)ABEI-AuNFs纳米材料的制备。首先，将0.075g壳聚糖溶于25mL冰醋酸溶液中 (v/v)，然后将1.5mL ABEI储备液和42mL水加入到上述溶液中，在剧烈搅拌下加热至沸腾。 将8mL氯金酸储备液逐滴加入，保持沸腾状态2h。之后将材料在室温下自然冷却，保存于4°C 备用。
[0008] (2)ABEI_AuNFs信号探针的制备。取5mL制备好的材料于lOOOOrpm下离心10min，并 重悬于1 ? 5mL，30mM Tris-HCl()中。将cDNA和三（2-羧乙基）膦(TCEP)(终浓度100nM)预先在 25 °C孵育30min。将此混合液与BSA(终浓度1 % )共同添加到上述ABEI-AuNFs溶液中，室温下 孵育20h。将上述混合液于8000rpm下离心10min得到cDNA修饰的ABEI-AuNFs信号探针探针。
[0009] (3)适配体包被的微孔板的制备。通过如下步骤将土霉素、四环素、卡纳霉素适配 体包被在微孔板的不同区域。首先，取l〇〇yL 0.02mg/mL链霉亲合素加入到微孔板中，并在 37°C下烘干备用。用0.05%BSA对微孔板上多余的结合位点进行封闭。将微孔板分为3个区 域。将100此生物素化的适配体加入到对应的3个区域中，在37°C下孵育lh，用PB-T洗板3次， 并在空气中干燥备用。
[0010] ⑷基于微孔板的ABEI-H2〇2-对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统的构建。固定在微 孔板上的适配体DNA与其互补DNA单链的杂交，将信号探针固定在微孔板表面，然后向微孔 板中加入稳态化学发光缓冲液150yL，缓冲液组成为，0.2mol/L H202,0.05mol/L PIP， 0.00095mol/L Na2HP〇4 ? 2H2〇,0.00405mol/LNaH2P〇4 ? 12H20 and 0.1mol/L NaOH。
[0011] (5)对土霉素、四环素、卡纳霉素进行检测，建立标准曲线。向适配体包被的微孔板 中加入1〇〇此对应的ABEI-AuNFs信号探针，于37°C下孵育40min，用PB-T洗板3次后，将不同 浓度土霉素、四环素和卡纳霉素添加到对应的微孔板中，于37°C下孵育50min，用PB-T洗板3 次后加入150mL的检测缓冲液。30min后测定发光强度。以不同浓度的抗生素的负对数为横 坐标，以化学发光强度为纵坐标，建立标准工作曲线。随着靶标浓度的增大，化学发光强度 降低，0TC工作曲线的线性范围为0.05-5ng/mL(Y = -123.688+30.308*X);TET的性范围为 0.05-5ng/mL(Y = -21.271+22.957*X);卡那霉素的性范围为 0.005-lng/mL(Y = -74.064+ 27.089*X)，它们的最低检测限分别为:0.02/0.02/0.002ng/mL。
[0012] (6)对土霉素，四环素和卡那霉素样品进行检测:将不同浓度土霉素、四环素、卡纳 霉素添加到牛奶样品中，稀释40倍。随后按照（5)中操作步骤得到化学发光强度，从标准曲 线中求得对应的靶标的浓度。
[0013]本发明的优点是：
[0014] (1)利用适配体对被检测物质实现特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确 性。
[0015] (2)利用适配体与抗体相比较，具有可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本 低、批次间差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。
[0016] (3)利用ABEI修饰的花状纳米金构建基于微孔板的稳态化学发光体系。稳态体系 的构建能够将化学发光检测时间有效延长到1500s，避免瞬时发光测定产生的误差。
[0017] ⑷利用互补链连接的ABEI-AuNFs作为一个通用标签，基于微孔板的空间分辨特 点构建一种对土霉素、四环素和卡那霉素同时检测的高通量检测方法。
【附图说明】
[0018]图1:基于N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)修饰的花状纳米金和微孔板同时 检测土霉素，四环素和卡那霉素的检测原理图。
[0019]图2 48￡1修饰的花状纳米金电镜图以)和能谱表征图（8)
[0020]图3:ABEI-AuNFs-H202-PIP 稳态发光图
[0021]图4:靶标检测标准曲线图（a-土霉素，b-四环素，c-卡那霉素）
【具体实施方式】
[0022]本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同 替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
[0023] 实施例1:牛奶实际样品中土霉素，四环素和卡那霉素检测。检测样品预处理：：首 先将不同浓度土霉素、四环素、卡纳霉素添加到牛奶样品中，并用ELISA处理液稀释40倍。从 本地超市购买3种不同品牌的牛奶，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定其中赭曲霉 毒素A的含量，结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。
[0024]表一:牛奶实际样品检测，本发明方法与ELISA方法对比
[0026] 注:ND为未检出
[0027] 实施例2:牛奶实际样品中土霉素，四环素和卡那霉素的检测及加标回收率实验样 品预处理同实施例1。
[0028] 以实施例1得到的3组土霉素，四环素和卡那霉素浓度数据为本底值，分别向其中 加入三种不同浓度的抗生素标准品，同样利用本发明方法再次检测其中所加入的抗生素含 量，得到检测值。回收率％ =(检测值_本底值)/添加量X100 %。从表二数据可以看到回收率 在96.04%~102.66%，说明本发明稳定，灵敏，准确，适用于牛奶实际样品中土霉素，四环 素和卡那霉素的检测。
[0029] 表二:牛奶实际样品中土霉素、四环素和卡那霉素的检测及加标回收率
[0031] 注:ND为未检出
【主权项】
1. 一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡那霉素的方法。其特 征在于:基于微孔板所构建的N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)-H 2〇2-对碘苯酚(PIP) 稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长。巯基化互补链连接ABEI修饰的花状纳米 金被用于信号探针。固定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配 体分别固定在微孔板的三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。适配体首先与信 号探针通过碱基互补配对而结合，在靶标存在的情况下，适配体会倾向于与靶标结合从而 引起信号探针部分脱落，导致化学发光信号强度的变化。因此所构建的适配体传感器可以 实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测。此外，也将该传感器用于实际样品检测，检 测结果与商业化ELISA检测方法所得到的结果类似，证明了该传感器的优良性能。2. 如权利要求1所述的一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡 那霉素的方法，其特征在于:构建ABEI-H 2〇2-对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统，并将化学发 光时间延长至1500s。3. 如权利要求1所述的一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡 那霉素的方法，其特征在于:巯基化互补链连接ABEI修饰的花状纳米金被用于信号探针，固 定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的 三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。4. 如权利要求1所述的一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡 那霉素的方法，其特征在于:所述方法能够用于牛奶，蜂蜜，蛋类，水产和畜禽等食品中土霉 素，四环素和卡那霉素的检测。
【文档编号】G01N21/76GK106053439SQ201610381689
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】王周平, 郝丽玲, 顾华杰, 段诺, 吴世嘉, 马小媛, 夏雨
【申请人】江南大学