饮品中ε?聚赖氨酸含量和分子量的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种饮品中ε?聚赖氨酸含量和分子量的检测方法。本发明根据ε?聚赖氨酸聚阳离子的特征，使用大孔弱酸性阳离子D152从饮品中进行吸附提取，之后使用1 mol/L的盐酸洗脱，能够提取获得饮品中95%的ε?聚赖氨酸，避免了饮品中其它物质对后续检测造成的干扰；之后通过检测提取的ε?聚赖氨酸在215 nm下的紫外吸收强度，计算获得样品中ε?聚赖氨酸的含量；通过检测ε?聚赖氨酸在凝胶过滤色谱柱中的保留时间，计算获得样品中ε?聚赖氨酸的分子量。本发明所建立的饮品中ε?聚赖氨酸的高效液相检测方法，能够高效提取饮品中所含ε?聚赖氨酸，并且能够同时检测其中ε?聚赖氨酸的含量和分子量。
【专利说明】
饮品中ε-聚赖氨酸含量和分子量的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种饮品中ε-聚赖氨酸含量和分子量的检测方法。
【背景技术】
[0002]ε-聚赖氨酸最早于1977年Shima等筛选生物碱时发现的一种链霉菌次级代谢产物。它是由多个1-赖氨酸的α-羧基和ε-氨基通过酰胺键迭代连接而成的线性聚合物，其常见分子量为3.2-4.5 kDa，聚合度为25-35。ε-聚赖氨酸的pH耐受范围宽，热稳定性较好，pH3.0时，100°C处理30 min或者120°C处理20 min，ε-聚赖氨酸仍具有生物活性。实验证实ε-聚赖氨酸具有广谱抑菌性，对革兰氏阴性和阳性细菌均具有极强的抑制效果，对酵母菌、真菌乃至病毒也有抑制作用。并且该抑制效果与ε_聚赖氨酸分子量紧密相关，例如，ε_聚赖氨酸的聚合度小于9时(约1.17 kDa)基本无抑菌效果，ε-聚赖氨酸聚合度大于10(约1.30kDa)时则呈现出相应的抑菌效果。此外，毒理学研究和药物动力学研究表明，适量范围内的ε_聚赖氨酸对小鼠没有毒性，不会在其组织和器官中积累，因此，ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂是可以安全使用的。我国国家卫生和计划生育委员会在2014年第5号文件中批准ε-聚赖氨酸及其盐酸盐作为新型食品添加剂可以在食品行业中使用。
[0003]但是如何从食品中高效、准确地检测出添加的ε-聚赖氨酸的含量及其分子量都没有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的任务是提供一种饮品中ε_聚赖氨酸含量和分子量的检测方法，实现本发明的技术方案如下；本发明所述的饮品中ε_聚赖氨酸的提取和检测方法，具体步骤如下:
a).饮品中ε-聚赖氨酸的提取:取待测样品10mL，将待测样品70°C加热10 min，10 000r/min离心10 min，然后收集上清液；
b).将Ig D152大孔弱酸性阳离子交换树脂加入到收集的上清液中，之后将饮品上清液和D152大孔弱酸性阳离子交换树脂的混合液以200 r/min的转速搅拌混合5 !^!!，使得卜聚赖氨酸充分吸附在D152大孔弱酸性阳离子交换树脂上；
c).使用Imol/L的盐酸10 mL将ε-聚赖氨酸从D152大孔弱酸性阳离子交换树脂上洗脱下来，洗脱液作为高效液相色谱检测的对象；
d).高效液相色谱流动相配制:配制含0.01%硫酸的超纯水溶液；
e).检测条件:检测过程中使用色谱柱为水相凝胶过滤色谱柱，流速为0.5mL/min，柱温为30°C，样品进样量为20 yL，检测时长为30 min，紫外检测波长为215 nm;
f).将从饮品中提取获得的ε_聚赖氨酸样品进样至高效液相色谱中。通过ε_聚赖氨酸在215 nm下的紫外吸收强度，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的含量;通过样品在凝胶色谱柱中的保留时间，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的分子量。
[0005]g).e_聚赖氨酸分子量和其在凝胶过滤色谱柱中保留时间关系的标准曲线绘制:配制分子量为8、4、2、1 kDa的聚乙二醇标准溶液，分别通过高效液相色谱和示差折光检测器检测其在凝胶过滤色谱柱中的保留时间，之后制作样品分子量和保留时间对应的标准曲线，其对应方程为Y=-0.908X+22.499,R2=0.9913，其中Y为1η(ε-聚赖氨酸分子量)，Χ为ε-聚赖氨酸在高效液相色谱中的保留时间；
h).ε-聚赖氨酸含量和紫外波长215 nm处吸收强度对应的标准曲线绘制:配制浓度为10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L的ε-聚赖氨酸标准溶液，分别通过上述高效液相色谱方法检测其在215 nm下的紫外吸收值。之后制作ε-聚赖氨酸浓度和在215 nm紫外吸收值相对应的标准曲线，其对应方程为Y=1.31 X 10—3 X + 7.02X10-2，R2=0.9945，Y为ε-聚赖氨酸浓度，X为样品在215 nm下的吸收值。
[0006]与现有技术比较，本发明根据ε_聚赖氨酸聚阳离子的特征，使用大孔弱酸性阳离子D152从饮品中进行吸附提取，之后使用I mol/L的盐酸洗脱，能够提取获得饮品中95%的ε_聚赖氨酸，避免了饮品中其它物质对后续检测造成的干扰;之后通过检测提取的ε_聚赖氨酸在215 nm下的紫外吸收强度，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的含量;通过检测ε-聚赖氨酸在凝胶过滤色谱柱中的保留时间，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的分子量。本发明所建立的饮品中ε_聚赖氨酸的高效液相检测方法，能够高效提取饮品中所含ε-聚赖氨酸，并且能够同时检测其中ε_聚赖氨酸的含量和分子量，该方法具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、快速简便、无污染、重现性好等特点，适宜普遍推广和批量检测。
【附图说明】
[0007]图1是表示1η(ε_聚赖氨酸平均分子量)和高效液相上保留时间的线性关系图；
图2是表示高效液相上的紫外峰吸收面积和ε-聚赖氨酸浓度的线性关系图；
图3是表示饮品中ε -聚赖氨酸在高效液相上的实际出峰图。
[0008]【具体实施方式】:
以下进一步说明本发明。
[0009]本发明所述的一种饮品中ε-聚赖氨酸含量和分子量的检测方法，具体步骤如下:
a.饮品中ε-聚赖氨酸的提取:取待测样品10mL，将待测样品70°C加热10 min，10 000r/min离心10 min，然后收集上清液；
b.将Ig D152大孔弱酸性阳离子交换树脂加入到收集的上清液中，之后将饮品上清液和D152大孔弱酸性阳离子交换树脂的混合液以200 r/min的转速搅拌混合5 min，使得ε-聚赖氨酸充分吸附在D152大孔弱酸性阳离子交换树脂上；
c.使用Imol/L的盐酸10 mL将ε-聚赖氨酸从D152大孔弱酸性阳离子交换树脂上洗脱下来，洗脱液作为高效液相色谱检测的对象；
d.高效液相色谱流动相配制:配制含0.01%硫酸的超纯水溶液；
e.检测条件:检测过程中使用色谱柱为水相凝胶过滤色谱柱，流速为0.5mL/min，柱温为30°C，样品进样量为20 yL，检测时长为30 min，紫外检测波长为215 nm;
f.将从饮品中提取获得的ε-聚赖氨酸样品进样至高效液相色谱中。通过卜聚赖氨酸在215 nm下的紫外吸收强度，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的含量;通过样品在凝胶色谱柱中的保留时间，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的分子量。
[0010]g.e-聚赖氨酸分子量和其在凝胶过滤色谱柱中保留时间关系的标准曲线绘制:配制分子量为8、4、2、1 kDa的聚乙二醇标准溶液，分别通过高效液相色谱和示差折光检测器检测其在凝胶过滤色谱柱中的保留时间，之后制作样品分子量和保留时间对应的标准曲线，其对应方程为Y=-0.908X+22.499,R2=0.9913，其中Y为1η(ε-聚赖氨酸分子量)，Χ为ε-聚赖氨酸在高效液相色谱中的保留时间；
h.ε-聚赖氨酸含量和紫外波长215 nm处吸收强度对应的标准曲线绘制:配制浓度为10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L的ε-聚赖氨酸标准溶液，分别通过上述高效液相色谱方法检测其在215 nm下的紫外吸收值。之后制作ε-聚赖氨酸浓度和在215 nm紫外吸收值相对应的标准曲线，其对应方程为Y=1.31 X 10—3 X + 7.02X10-2，R2=0.9945，Y为ε-聚赖氨酸浓度，X为样品在215 nm下的吸收值。
[0011]
结果评价:
a.使用该方法能够提取获得饮品中95%的ε-聚赖氨酸。例如向饮品中添加终浓度为10mg/L的ε-聚赖氨酸，使用该提取方法计算得到的ε-聚赖氨酸含量为9.5 mg/L。
[0012]b.不同分子量(8、4、2、1 kDa)的ε-聚赖氨酸样品的出峰时间和ε-聚赖氨酸分子量的对数值呈现出很好的线性关系，其对应方程为Y=-0.908Χ+22.499, R2=0.9913，其中Y为In(ε_聚赖氨酸分子量)，Χ为ε-聚赖氨酸在高效液相色谱中的保留时间(图1)。
[0013]c.不同浓度(10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L)的ε-聚赖氨酸样品对应的高效液相上的紫外峰吸收值和ε_聚赖氨酸浓度呈现出很好的线性关系，其对应方程为Y=1.31 X 10—3 X+ 7.02X10-2，R2=0.9945，Y为ε-聚赖氨酸浓度，X为样品在215 nm下的吸收值(图2)。
[0014]d.以添加有2 mg/L ε_聚赖氨酸的果粒橙饮料为测定对象，按照上述方法进行ε_聚赖氨酸提取后，进样至高效液相色谱，其保留时间为15.420 min,215 nm处的紫外吸收值为1451(图3)。根据保留时间计算出的平均分子量为4.21 kDa(实际值为4.15 kDa)，根据215 nm下紫外吸收值，计算获得的ε-聚赖氨酸浓度约为1.9 mg/L(实际值为2 mg/L)。因此，该方法具有很高的准确性。
[0015]创新点:
ε_聚赖氨酸具有聚阳离子的特性，因此弱酸性阳离子交换树脂能吸附饮品中ε_聚赖氨酸，可进行饮品中ε_聚赖氨酸的提取，避免饮品中其它物质对测量产生的影响。
[0016]本检测方法，能够同时检测ε-聚赖氨酸的含量和分子量。
[0017]检测过程中高效液相色谱的流动相中含有硫酸和水，硫酸的含量为0.01%，流动相流速为0.5 mL/min，柱温为30°C，检测时长为30 min，紫外检测波长为215 nm。
[0018]本方法适用于饮品中ε-聚赖氨酸的检测，包括果汁、啤酒等。
【主权项】
1.饮品中ε-聚赖氨酸含量和分子量的检测方法，其特征在于，所述的检测方法，具体步骤如下: a).饮品中ε-聚赖氨酸的提取:取待测样品10mL，将待测样品70°C加热10 min，10 000r/min离心10 min，然后收集上清液； b).将Ig D152大孔弱酸性阳离子交换树脂加入到收集的上清液中，之后将饮品上清液和D152大孔弱酸性阳离子交换树脂的混合液以200 r/min的转速搅拌混合5 !^!!，使得卜聚赖氨酸充分吸附在D152大孔弱酸性阳离子交换树脂上； c).使用Imol/L的盐酸10 mL将ε-聚赖氨酸从D152大孔弱酸性阳离子交换树脂上洗脱下来，洗脱液作为高效液相色谱检测的对象； d).高效液相色谱流动相配制:配制含0.01%硫酸的超纯水溶液； e).检测条件:检测过程中使用色谱柱为水相凝胶过滤色谱柱，流速为0.5 mL/min，柱温为30°C，样品进样量为20 yL，检测时长为30 min，紫外检测波长为215 nm; f).将从饮品中提取获得的卜聚赖氨酸样品进样至高效液相色谱中； 通过ε-聚赖氨酸在215 nm下的紫外吸收强度，计算获得样品中ε-聚赖氨酸的含量;通过样品在凝胶色谱柱中的保留时间，计算获得样品中聚赖氨酸的分子量； g).e_聚赖氨酸分子量和其在凝胶过滤色谱柱中保留时间关系的标准曲线绘制:配制分子量为8、4、2、1 kDa的聚乙二醇标准溶液，分别通过高效液相色谱和示差折光检测器检测其在凝胶过滤色谱柱中的保留时间，之后制作样品分子量和保留时间对应的标准曲线，其对应方程为Y=-0.908X+22.499，R2=0.9913，其中Y为1η( ε-聚赖氨酸分子量)，X为ε-聚赖氨酸在高效液相色谱中的保留时间； h).ε -聚赖氨酸含量和紫外波长215 n m处吸收强度对应的标准曲线绘制:配制浓度为10、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L的ε-聚赖氨酸标准溶液，分别通过上述高效液相色谱方法检测其在215 nm下的紫外吸收值； 之后制作ε -聚赖氨酸浓度和在215 nm紫外吸收值相对应的标准曲线，其对应方程为Y=1.31X10-3 X + 7.02X10-2，R2=0.9945，Y为ε-聚赖氨酸浓度，X为样品在215 nm下的吸收值。
【文档编号】G01N30/02GK106053669SQ201610557994
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】刘友华, 徐虹, 陈永煊, 冯小海, 李莎, 许召贤, 余清
【申请人】福建省产品质量检验研究院