Hplc 法测定复方小艾飞中黄酮类成分和胡椒碱的含量的方法
【专利摘要】本发明公开一种HPLC法测定复方小艾飞中黄酮类成分和胡椒碱的含量的方法，包括如下步骤：称取复方小艾飞样品，用甲醇提取，提取液过滤，得到的供试溶液上高效液相色谱仪，根据测得的色谱峰面积和标准曲线，得出槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱的含量，色谱条件为：C18色谱柱，检测波长280 nm，流动相：乙睛A?1%磷酸溶液B?甲醇C，梯度洗脱：0～12min，28%A∶52%B∶20%C，12～13min 28%A→30%A，52%B→50%B，20%C→20%C，13～45min 30%A∶50%B∶20%C。本发明方法操作简便，具有良好的准确性和重复性。
【专利说明】
HPLC法测定复方小艾飞中黄酮类成分和胡椒碱的含量的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种HPLC法测定复方小艾飞中槲皮素等4 种黄酮类成分和胡椒碱的含量的方法。
【背景技术】
[0002] 复方小艾飞由维吾尔药高良姜、干姜、胡椒、金钱白花蛇、荜茇组成，是由维吾尔医 学验证并长期在我区维吾尔医医院使用的医院复方制剂。目前临床应用时将复方中各药味 共研细粉，加以炼蜜制成膏剂服用，具有抗肿瘤（胃癌)等功能，本课题组之前对复方小艾飞 蜜膏体外抗肿瘤活性筛选、体内抗肿瘤活性实验、抗炎活性实验、体外抗氧化活性筛选，对 其化学成分进行分析、开展有效成分提取工艺研究，为该制剂二次开发和临床应用提供理 论指导和实验依据。相关文献已研究表明，高良姜、干姜中含有槲皮素、山柰素、乔松素、高 良姜素等黄酮类成分，而且有较强的抗溃疡、抗腹泻、利胆、镇痛、抗炎、抗缺氧、抗凝、抗血 栓形成等作用;最近有研究发现，高良姜中的化学成分还有一定的预防皮肤癌的功能。黑胡 椒、荜拨中含有胡椒碱等生物碱类成分，具有中枢神经系统抑制作用;研究表明荜茇中主要 化学成分胡椒碱抑制单胺氧化酶(MA0)发挥抗抑郁作用。
[0003]由于目前临床应用该剂型较为粗糙、用药剂量难以控制，从而往往影响药效。因 此，如何测定复方小艾飞中槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素等4种黄酮类成分及胡椒碱的 含量，为该药的质量控制提供有效的方法依据，以进一步提高该药的制剂科学性。其中，槲 皮素（a，Quercetin)、山柰素（13，1(&6111卩1^1'1(16)、乔松素（(3，？;[11006111131'；[11)、高良姜素（(1， Galangin)和胡椒碱(6，？1口61'；[116)的化学结构式如下：
【发明内容】
[0004] 本发明的目的提供一种HPLC法测定复方小艾飞中槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜 素等4种黄酮类成分以及胡椒碱的含量的方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案： HPLC法测定复方小艾飞中黄酮类成分和胡椒碱的含量的方法，所述的黄酮类成分为 槲皮素、山柰素、乔松素和高良姜素，包括如下步骤： (1) 以槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱为对照品，对照品用甲醇溶解，配制 成混合标准对照溶液； (2) 混合标准对照溶液上高效液相色谱仪，测得槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡 椒碱的色谱峰面积，从而得到槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱的浓度与峰面积 的标准曲线，色谱条件为:C 18色谱柱，检测波长280 nm，流动相:乙睛-lv%磷酸溶液-甲醇，梯 度洗脱：〇~12min，28%A: 52%B: 20%C，12~13min 28%A-30%A，52%B450%B，20%C-20%C， 13~45min 30%A:50%B:20%C，其中，A为乙睛，B为lv%磷酸溶液，C为甲醇； (3) 称取复方小艾飞样品，用甲醇提取，提取液过滤，得到供试溶液； (4) 供试溶液上高效液相色谱仪，色谱条件与步骤(2)相同，测得槲皮素、山柰素、乔松 素、高良姜素和胡椒碱的色谱峰面积，再根据步骤(2)的标准曲线，得出槲皮素、山柰素、乔 松素、高良姜素和胡椒碱的含量。
[0006] 进一步，步骤(3)采用超声波提取，料液比为1:100-200,超声波功率为200-300W， 频率为50-100沾^，时间为30-60111111。
[0007] 优选地，超声波提取时，料液比为1:130-140，超声波功率为200-250W，频率为50- 60 kHz，时间为40-45min。
【附图说明】
[0008] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为复方小艾飞样品的色谱图，其中，A为对照品，B为复方小艾飞样品，1为槲皮素，2 为山柰素，3为乔松素，4、高良姜素，5为胡椒碱。
【具体实施方式】
[0009] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0010] 槲皮素对照品（含量质量分数多98%，中国食品药品检定研究院，批号100081 - 200907)，山柰素对照品（含量质量分数彡98%，中国食品药品检定研究院，批号110861 - 201310)，乔松素对照品（含量质量分数彡98%，中国食品药品检定研究院，批号111829 - 201102)，高良姜素对照品（含量质量分数多98%，中国食品药品检定研究院，批号111699 一200501)，胡椒碱对照品（含量质量分数彡98%，中国食品药品检定研究院，批号110755 一 201405)，甲醇、乙腈（色谱纯，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司），HPLC水（自 制），甲醇、磷酸(分析纯，天津市永晟精细化工有限公司）。
[0011] 溶液的制备 1.1混合对照品洛液的制备 精密称取对照品槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱各约l〇mg，用甲醇分别配 制成质量浓度均约为〇. 〇4mg /ml的对照储备溶液。精密量取上述槲皮素、山柰素对照储备 液1.0 mL，乔松素对照储备液2.0 mL，高良姜素、胡椒碱对照储备液3.0 mL，置于同一 10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照储备溶液。
[0012 ] 1.2供试品溶液制备 取复方小艾飞样品约〇. 3 g，精密称定。置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，称定质量。超声提取（250 W，59 kHz) 45 min，冷却至室温后，用甲醇补足减失的 质量，摇勾。于10000 r.mirT1离心8 min，用0. 45 Ml微孔滤膜滤过，取续滤液，即作为 供试溶液。
[0013] 1.3色谱条件与系统适用性试验 Hypersil BDS C18 色谱柱（4.6 mmX250mm，5 um)，流动相：乙睛（A)_lv% 磷酸溶液 (B)-甲醇(C)，流速为1. 0 mL.min-S柱温30 °C，进样量20uL，检测波长280 nm，梯度洗脱 (A\B\C的体积百分数变化）：0~12min，28%A: 52%B: 20%C; 12~13min 28%A-30%A，52%B- 50%B，20%C-20%C; 13~45min 30%A: 50%B: 20%C，表示线性变化。
[0014] 1.4线性关系 分别精密量取混合对照储备液〇.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.411^，分别置1〇11^量瓶 中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照溶液。分别取各系列质量浓度混合对照溶 液上高效液相色谱仪(HPLC)进样分析，以峰面积（Y)为纵坐标，溶液的质量浓度（X，mg? I/ 1)为横坐标进行线性回归，得到槲皮素的回归方程为Y =357314X-88066 ( r = 0.9999)，山柰素的回归方程为Y =442853X-74204 ( r =0.9999)，乔松素的回归方程为Y =647926X-327436 ( r =0.9999)，高良姜素的回归方程为 Y =471672X-256408 ( r = 0. 9999)，胡椒碱的回归方程为Y =290000X-391906 ( r =0.9999)。结果表明：槲皮素、山 柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱的质量浓度分别在1.6~9.6 mg* I/1、！.6~9.6 mg* I/1、 3.2~19.2 mg. L'4.8~28.8 mg. L-\4.8~28.8 mg. L-1内与峰面积呈良好的线性关 系。
[0015] 1.5样品的测定 取复方小艾飞按"1. 2"条方法制备供试溶液，在"1. 3"条色谱条件下，上高效液相色 谱仪进行分析，用外标法计算槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱的含量，结果见表 1〇
[0016]表1样品含量测定结果（n =3)
1.6精密度试验 在上述色谱条件下，取同一混合对照品溶液连续进样6次，测得槲皮素、山柰素、乔松 素、高良姜素和胡椒碱的峰面积的RSD(n= 6)分别为0.8%，0.6%，1.2%，1.2%，1.0%。
[0017] 1.7重复性试验 取同一批复方小艾飞按" 2.2 "方法平行制备供试溶液6份，在"1. 3"条色谱条件下 分别进样分析，测得槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱含量的RSD分别为2.8%、 2.7%、2.3%、1.9%和1.7%。表明方法重复性良好。
[0018] 1.8稳定性试验 在上述色谱条件下，取同一份供试品溶液分别于0,2,4,6,8，10，12,24 1!重复进样，测 得槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱的峰面积的RSD(n=8)分别为2.2%、2.0%、 2.5%、2.0%、2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
[0019] 1.9加样回收率试验 精密称取已测知含量的复方小艾飞9份，每份约0. 15 g。按低、中、高质量浓度分别 精密加入质量浓度为40 mg .I/1槲皮素0? 3、0. 6、0. 9 mL，质量浓度为40 mg .I/1山柰 素0.1、0.2、0.3 11^、质量浓度为80 11^.1/1乔松素0.1、0.2、0.3 1^、质量浓度为120 mg*L-1高良姜素对照溶液0. 1、0. 2、0. 3 mL和质量浓度为mg?L-1胡椒碱对照溶液0. 1、 0. 2、0. 3 mL，每一质量浓度制备3份。按"1. 2"条方法制备所需溶液，分别进样分析， 加样回收率计算结果见表2。
[0020] 表2回收率测定结果(n=9)
流动相的选择流动相中加入适量乙腈能保证较短的分析时间，加入少量酸可抑制组 分解离、避免色谱峰拖尾。其次，槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱中，前四种均为 黄酮类化合物，其化学结构中含有酚羟基，呈弱酸性，采用甲醇作为流动相可以提高分离的 效率与选择性。并用梯度洗脱时，待测的5种成分的色谱峰峰形良好，分离效果好，故本实验 最终采用含乙腈、甲醇、磷酸水溶液的溶剂系统作为流动相。
[0021] 检测波长的选择将混合对照储备溶液进样分离后，利用DAD检测器在波长200 ~400 nm内扫描其吸收光谱，槲皮素、山柰素、乔松素和高良姜素分别在280、270、290和 265 nm和处有最大吸收，胡椒碱，胡椒碱最佳吸收为340nm，在280nm处有吸收且共同吸收最 大。考虑到槲皮素、胡椒碱在280nm处均有最大吸收，而且槲皮素含量最低，故选择波长280 nm为检测波长，同时，药材中外源性物质在此波长下不干扰槲皮素的测定。
[0022] 供试品溶液制备方法的选择比较了加热回流提取超声提取。但超声提取方法简 单，容易操作，在超声提取时间方面，考虑了 301^11、451^11、60111111，提取溶剂用量(30,40,50， 60 mL)进行考察，结果表明在权衡之下，甲醇、40mL、40min/次提取率高。因此选择甲醇为提 取溶剂，进行超声提取。
[0023] 测定结果分析本实验研究表明，在同一色谱条件下，可同时测得槲皮素、山柰素、 乔松素、尚良姜素和胡椒碱的含量。
[0024] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. HPLC法测定复方小艾飞中黄酮类成分和胡椒碱的含量的方法，所述的黄酮类成分 为槲皮素、山柰素、乔松素和高良姜素，包括如下步骤： (1) 以槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱为对照品，对照品用甲醇溶解，配制 成混合标准对照溶液； (2) 混合标准对照溶液上高效液相色谱仪，测得槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡 椒碱的色谱峰面积，从而得到槲皮素、山柰素、乔松素、高良姜素和胡椒碱的浓度与峰面积 的标准曲线，色谱条件为:C 18色谱柱，检测波长280 nm，流动相:乙睛-lv%磷酸溶液-甲醇，梯 度洗脱：〇~12min，28%A: 52%B: 20%C，12~13min 28%A-30%A，52%B450%B，20%C-20%C， 13~45min 30%A:50%B:20%C，其中，A为乙睛，B为lv%磷酸溶液，C为甲醇； (3) 称取复方小艾飞样品，用甲醇提取，提取液过滤，得到供试溶液； (4) 供试溶液上高效液相色谱仪，色谱条件与步骤(2)相同，测得槲皮素、山柰素、乔松 素、高良姜素和胡椒碱的色谱峰面积，再根据步骤(2)的标准曲线，得出槲皮素、山柰素、乔 松素、高良姜素和胡椒碱的含量。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用超声波提取，料液比为1:100-200，超声波功率为200-300W，频率为50-100 kHz，时间为30-60min。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超声波提取时，料液比为1:130-140，超声 波功率为200-250W，频率为50-60 kHz，时间为40-45min。
【文档编号】G01N30/02GK106053672SQ201610603976
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】热娜·卡斯木, 张涛涛, 米仁沙·牙库甫
【申请人】新疆医科大学