一种辅助降血糖片深加工产品中4?羟基异亮氨酸含量的检测方法
【专利摘要】本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种辅助降血糖片深加工产品中4?羟基异亮氨酸含量的检测方法。该检测方法包括：将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液；将4?羟基异亮氨酸对照品溶液和供试液分别采用高效液相色谱?质谱联用技术测定4?羟基异亮氨酸，利用外标法得到4?羟基异亮氨酸的含量。通过对本发明4?羟基异亮氨酸的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404?2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对葫芦巴提取物的4?羟基异亮氨酸含量起到质量控制的目的。
【专利说明】
一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及质量控制技术领域，特别涉及一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基 异亮氨酸含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢类疾病，分原发性和继发性两大 类。因为体内胰岛素分泌绝对不足和相对不足，引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，主要是糖分 解代谢障碍，产生大量中间代谢产物，如酮体等，中间代谢产物引起许多严重的急性、慢性 合并症，这些合并症严重影响糖尿病患者的生命和健康，是造成糖尿病高病死率和高致残 率的主要原因。据世界卫生组织有关资料表明，其对总体健康的危害程度，已居慢性非传染 性疾病的第三位。作为一种多病因的综合性疾病，糖尿病患者需要长期规范的治疗，如果控 制不好，会引发多种类型并发症，包括血管病变、神经病变、肾功能衰竭、失明、截止等病变， 且无法治愈。
[0003] 胡芦巴（Trigonella foenum-graecum L.)是豆科胡芦巴属的一种一年生草本植 物，广泛分布于亚洲、欧洲和非洲。胡芦巴种子是传统的中药材，主要的两个药理作用是抗 糖尿病和降胆固醇。4-羟基异亮氨酸是存在于胡芦巴属植物中的一种非蛋白氨基酸，这种 氨基酸主要存在于胡芦巴种子中，约占该种子中游离氨基酸总含量的80%。近年来，文献报 道由胡芦巴种子中分离到的（2s，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸能促进胰岛素分泌，而这种促进 作用也解释了胡芦巴种子的抗糖尿病活性。
[0004] 目前，有报道采用高效液相色谱法测定4-羟基异亮氨酸的含量。色谱条件为：用十 八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈:无水醋酸钠-四氢呋喃混合溶液（19:81)为流动相； 检测波长为340nm;流速为0.6mL/min，柱温:40°C。样品处理方法为：⑴衍生化试剂:称取邻 苯二甲醛0.1 g，加入甲醇lmL，超声溶解，再加入2-疏基乙醇0.2mL和硼酸-氢氧化钠溶液(PH =9.5)4mL，摇匀，0.45_微孔滤膜过滤，即得。⑵准确称取样品50mg(精确至0.000lg)，用 40 %乙醇溶解并定容至50mL，摇匀，经0.45mi微孔滤膜过滤，即得试样溶液。⑶空白溶液：用 40%乙醇经0.45_微孔滤膜过滤，即得空白溶液。测定方法为:准确吸取衍生化试剂10此， 再准确吸取空白溶液、标准品溶液和样品溶液各进样20此，在规定的色谱条件下，进行色谱 分析，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。还有报道采用HPLC-ELSD测定萌芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量。但上述方法在检测4-羟基异亮氨酸含量的准确性方面均存在一定的 问题。因此，需要提供一种能够准确检测4-羟基异亮氨酸含量的方法。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的 检测方法。该检测方法可准确检测待测样品中4-羟基异亮氨酸的含量。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种4-羟基异亮氨酸含量的检测方法，包括：
[0008] 将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液；
[0009] 将4-羟基异亮氨酸对照品溶液和供试液分别采用高效液相色谱-质谱联用技术测 定4-羟基异亮氨酸，利用外标法得到4-羟基异亮氨酸的含量；
[0010] 高效液相色谱的条件为:C18色谱柱;流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为 乙酸铵溶液，流动相B为乙腈或甲醇;梯度洗脱；
[0011] 质谱的条件为:电喷雾正离子源，扫描方式为多反应监测模式。
[0012] 作为优选，有机酸为甲酸或乙酸。
[0013] 在本发明提供的实施例中，有机酸为甲酸。
[0014] 作为优选，溶解的时间为5~20min。
[0015]在本发明提供的实施例中，溶解的时间为lOmin。
[0016] 作为优选，乙酸铵的浓度为5~20臟〇1/1411值为3.5。
[0017]在本发明提供的实施例中，乙酸铵的浓度为1 Omm〇 1 /L，pH值为3.5。
[0018]作为优选，梯度洗脱的程序为：
[0021] 作为优选，流动相的流速为0.3~0.5mL/min。
[0022]在本发明提供的实施例中，流动相的流速为0.4mL/min。
[0023]作为优选，C18色谱柱为Agilent EC-C18色谱柱、Phenomenex Kinetex XB-C18色 谱柱、Phenomenex Luna C18色谱柱或者其它相同性能的色谱柱。
[0024] 在本发明提供的实施例中，Agilent EC-C18色谱柱的规格为：150X4? 6mm，2? 7mi; Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱的规格为：100 X4.6mm，2.6iim;Phenomenex Luna C18 (2)色谱柱的规格为:100X4.6mm，3wii。
[0025] 作为优选，色谱柱的柱温为30~40°C。
[0026]在本发明提供的实施例中，色谱柱的柱温为40°C。
[0027]作为优选，质谱的参数如下所示：
[0028] 定量离子对为148.2/74.2m/z，碰撞气能量为17.3eV;
[0029] 定性离子对为148 ? 2/130 ? 2m/z，碰撞气能量为13 ? OeV;
[0030] 定性离子对为148 ? 2/102 ? 2m/z，碰撞气能量为14 ? OeV;
[0031] 气帘气为22. Opsi，碰撞气压为7. Opsi，电喷雾电压为5500V，离子源温度为600°C， 雾化气为60.Opsi，辅助气为20.0 psi，去簇电压为15.4V，入口电压为6.8V，碰撞池入口电压 CEP为8.0V，碰撞室出口电压为3.0V。
[0032] 气帘气为22.0psi，碰撞气压为7.0psi，电喷雾电压为5500V，离子源温度为600°C， 雾化气为60.Opsi，辅助气为20.0 psi，去簇电压为15.4V，入口电压为6.8V，碰撞池入口电压 EP为8.0V。
[0033] 在本发明提供的实施例中，待测样品为含有4-羟基异亮氨酸的辅助降血糖片。 [0034]本发明提供了一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法。 该检测方法包括:将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到 供试液;将4-羟基异亮氨酸对照品溶液和供试液分别采用高效液相色谱-质谱联用技术测 定4-羟基异亮氨酸，利用外标法得到4-羟基异亮氨酸的含量;高效液相色谱的条件为:C18 色谱柱;流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈或甲醇； 梯度洗脱;质谱的条件为：电喷雾正离子源，扫描方式为多反应监测模式。本发明具有的有 益效果为：
[0035] 1、本发明检测方法可准确检测待测样品中4-羟基异亮氨酸的含量；
[0036] 2、通过对本发明4-羟基异亮氨酸的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定 性、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要 求，证明含量测定方法科学有效，能对萌芦巴提取物的4-羟基异亮氨酸含量起到质量控制 的目的。
【附图说明】
[0037]图1~5分别为标准序号为STD1~STD5对照品的色谱图，示本发明检测方法的线性 关系；
[0038]图6示根据标准序号为STD1~STD5对照品中4-羟基异亮氨酸的浓度绘制的标准工 作曲线；
[0039] 图7~12为对照品溶液重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的精密度；
[0040] 图13~18为试样重复测定6次得到的色谱图，示本发明检测方法的重复性；
[0041 ] 图19~24为对照品溶液在室温下放置Oh、lh、2h、4h、8h、12h后得到的色谱图，示本 发明检测方法的稳定性；
[0042]图25示空白溶液的色谱图；
[0043]图26示本发明检测方法的检出限；
[0044]图27示本发明检测方法的定量限；
[0045]图28~36为序号为1~9样品的色谱图，示本发明检测方法的回收率。
【具体实施方式】
[0046] 本发明公开了一种辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法， 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似 的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明 的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精 神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技 术。
[0047] 本发明提供的辅助降血糖片深加工产品中4-羟基异亮氨酸含量的检测方法中所 用试剂或仪器均可由市场购得。
[0048]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0049]实施例1检测方法及方法学验证
[0050] 1原理:试样中的4-羟基异亮氨酸经过超声提取至溶剂中，用高效液相色谱C18柱将 4_羟基异亮氨酸分离，经质谱检测，并用外标法定量测定。
[0051 ] 2仪器:安捷伦1260高效液相色谱仪-API3200质谱仪(配ESI离子源）。
[0052] 3试剂试药：甲酸(色谱纯）；乙酸铵(色谱纯）；乙酸(色谱纯）；乙腈(色谱纯）；一级 用水;4-羟基异亮氨酸（对照品来源：上海源叶生物科技有限公司，批号：P29F7F10167,纯 度：98%)。
[0053] 4分析步骤：
[0054] 4.1仪器条件与参数：
[0055] 4.1.1高效液相色谱仪条件：
[0056] 流动相:A: 1 Ommo 1 /L的乙酸铵溶液，用乙酸调pH至3.5，B:乙腈，梯度洗脱(表1);
[0057]表1梯度洗脱程序
[0059] 流速:〇.4mL/min;
[0060] 柱温：40。(：；
[0061 ]色谱柱：Agi lent，EC-C18，150 X 4 ? 6mm，2 ? 7wn〇 [0062] 4.1.2质谱仪参数：
[0063]电喷雾正离子源(ESI+);扫描方式:多反应监测模式(MRM);质谱参数见表2、3。 [0064]表2、3中英文为质谱参数，都是特有固定值，电喷雾正离子源(ESI + )、电喷雾电压 (31)、雾化气(651)、辅助气(652)、气帘气(〇]1〇、离子源温度(1￡1〇、母离子(〇1)、定量定性 离子对(Q3)、去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞气能量(CE)、碰撞气压(CAD)、碰撞室出口 电压(CXP)。
[0069] 4.2对照储备液的配制：
[0070] 精密称取4-羟基异亮氨酸对照品16. llmg，置于50mL棕色容量瓶中，加入0.1%甲 酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液。储备液放在4°C的冰箱中储存备用。
[0071] 4.3标准工作曲线绘制：
[0072] 精密吸取4-羟基异亮氨酸储备液l.OOmL，置于200mL棕色容量瓶中，加入0.1%甲 酸溶液定容至刻度，摇匀，即得工作溶液，分别精密吸取工作溶液1此、2yL、4yL、7yL、1 OyL， 在4.1条件下，进行分析测定，绘制标准工作曲线。
[0073] 4.4试样制备：
[0074] 精密称取样品约0.1 g，置于100mL容量瓶中，加0.1 %甲酸（甲酸可以用乙酸代替） 溶液超声溶解，约l〇min，放冷至室温，用加0.1 %甲酸溶液定容至刻度，摇匀，精密移取 1.OOmL样品溶液至10mL容量瓶中，用加0.1 %甲酸溶液定容至刻度，摇匀，经0.45_的水相 滤膜过滤，即得供试液。精密吸取供试液4yL，在4.1条件下，进行分析测定。
[0075] 4.5结果计算：
[0076] X = CXV/MXK
[0077] 式中:X-样品中4-羟基异亮氨酸的含量，％ ;
[0078] M-样品的质量，g;
[0079] K-单位转换系数(K = 0.0001);
[0080] V-样品的稀释倍数，mL;
[0081 ] C-样品溶液中4-羟基异亮氨酸的浓度，yg/mL。
[0082] 5方法学验证：
[0083] 5.1线性范围确认：
[0084] 5? 1 ? 1试验数据：（色谱图见附图1-5)
[0085]表4线性关系试验检测结果
[0087] 5.1.2标准工作曲线图：
[0088] 以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图6所示。
[0089] 5.1.3线性试验结论：
[0090] 线性评价：相关系数R为0.9999，所以用该方法测定4-羟基异亮氨酸在浓度为 0.39470yg/mL至3.9470yg/mL之间呈现良好的线性，，符合GB/T27404-2008《实验室质量控 制规范》的要求(GB/T27404-2008要求相关系数R>0.99)。
[0091] 5.2精密度试验
[0092] 5.2.1试验方法：
[0093]将4-羟基异亮氨酸的标准工作溶液按4.1条件重复测定6次，计算其峰面积RSD (%)〇
[0094] 5 ? 2 ? 2试验数据：（色谱图见附图7-12)
[0095]表5精密度试验检测结果
[0096]
[0097] 5.2.3试验结论：
[0098] 4-羟基异亮氨酸重复测定6次峰面积的RSD( % )为1.0%，表明该方法有较好的精 密度。
[0099] 5.3重复性试验：
[0100] 5.3.1试验方法：
[0101 ]称取6份样品，按4.4试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD( % )。
[0102] 5.3.2试验数据：（色谱图见附图13-18)
[0103] 表6重复性试验检测结果
[0104]
[0105] 5.3.3试验结论：
[0106] 6份样品4-羟基异亮氨酸含量的RSD为1.7%，表明该方法有较好的重复性，符合 GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求(GB/T27404-2008要求RSD( % )<2.7% )。 [0107] 5.4稳定性试验
[0108] 5.4.1试验方法：
[0109] 将4-羟基异亮氨酸标准工作溶液分别在室温下放置011、111、211、41 1、811、1211后，按 4.1条件测定峰面积，计算其RSD( % )。
[0110] 5.4.2试验数据：（色谱图见附图19-24)
[0111] 表7稳定性试验检测结果
[0112]
[0113] 5.4.3试验结论：
[0114] 4-羟基异亮氨酸标准工作溶液分别在室温下放置011、111、211、411、811、1211后，1^0 (%)为2.4%，表明4-羟基异亮氨酸标准工作溶液在室温下12小时内的稳定性良好。
[0115] 5.5空白试验
[0116] 5.5.1试验方法：
[0117] 不称取样品，按4.4试样制备方法处理空白溶液，按4.1色谱条件测定空白溶液，与 4_羟基异亮氨酸标准工作溶液的出峰时间对比。
[0118] 5.5.2试验结果见图25。
[0119] 5.5.3试验结论：
[0120] 空白溶液在4-羟基异亮氨酸的出峰时间处均无吸收峰，表明空白对测定结果基本 无干扰。
[0121] 5.6检出限与定量限试验：
[0122] 分析方法的定量限和检出限由信噪比（S/N)计算。检出限图谱见图26,定量限图谱 见图27。当信噪比（S/N)为3时，检出限为0.01263yg/mL;得到方法的检出限为126.3mg/kg。 当信噪比（S/N)为10时，定量限为0.03158yg/mL;得到方法的定量限为315.8mg/kg。
[0123] 5.7回收率试验：
[0124] 5.7.1试验方法：
[0125] 加标:精密称取约O.lg样品9份(已知样品的4-羟基异亮氨酸含量:1.526%)，分成 3组，每组3份，各组分别精密加入4-羟基异亮氨酸的储备液2.00mL、4.00mL、6. OOmL。按4.4 试样制备方法处理样品。
[0126] 5.7.2试验数据如下：（色谱图见附图28-36)
[0127] 表8回收率试验检测结果
[0129 ] 测得加入量=加标样品测得量-样品测得量；
[0130] 回收率（％ )=测得加入量/理论加入量。
[0131] 5.7.3试验结论：
[0132] 平均回收率为：98.7%，相对标准偏差(RSD)为1.0%，符合GB/T27404-2008《实验 室质量控制规范》的要求(GB/T27404-2008要求回收率为95-105% )。
[0133] 6 结论：
[0134] 通过对4-羟基异亮氨酸的含量测定方法进行线性、精密度、重复性、稳定性、空白、 检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明 含量测定方法科学有效，能对萌芦巴提取物的4-羟基异亮氨酸含量起到质量控制的目的。
[0135] 实施例2检测实例
[0136] 对已知含量的4-羟基异亮氨酸标准品采用实施例1方法和现有的检测方法分别进 行测定。现有检测方法参照《冯欢李新霞冯葳等.柱前衍生化HPLC测定不同产地萌芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量.西北药学杂志.2016,31:136-138》。结果如下：
[0137] 表9 4-羟基异亮氨酸含量检测结果
[0139]由试验结果可知，采用本申请检测方法检测4-羟基异亮氨酸含量，结果更为准确。 [0140]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种4-羟基异亮氨酸含量的检测方法，其特征在于，包括： 将待测样品采用超声技术溶解于有机酸溶液中，放冷至室温，过滤，得到供试液； 将4-羟基异亮氨酸对照品溶液和所述供试液分别采用高效液相色谱-质谱联用技术测 定4-羟基异亮氨酸，利用外标法得到4-羟基异亮氨酸的含量； 所述高效液相色谱的条件为:C18色谱柱;流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动 相A为乙酸铵溶液，所述流动相B为乙腈或甲醇;梯度洗脱； 所述质谱的条件为：电喷雾正离子源，扫描方式为多反应监测模式。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机酸为甲酸或乙酸。3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述溶解的时间为5~20min。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵的浓度为5~ 20mmol/L，pH{IS3.5。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：6. 根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.3 ~0?5mL/min〇7. 根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为 Agilent EC-C18色谱柱、Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱、Phenomenex Luna C18色谱 柱或者其它相同性能的色谱柱。8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述Agilent EC-C18色谱柱的规格 为：150 X 4? 6mm，2 ? 7_;所述Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱的规格为：100 X 4? 6mm， 2所述Phenomenex Luna Cl8色谱柱的规格为：100X4.6mm，3ym。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为30 ~4(TC〇10. 根据权利要求1至9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的参数如下所 示： 定量离子对为148.2/74.2m/z，碰撞气能量为17.3eV; 定性离子对为148.2/130.2m/z，碰撞气能量为13. OeV; 定性离子对为148.2/102.2m/z，碰撞气能量为14. OeV; 气帘气为22.0psi，碰撞气压为7.0psi，电喷雾电压为5500V，离子源温度为600°C，雾化 气为60 ? Opsi，辅助气为20 ? Opsi，去簇电压为15 ? 4V，入口电压为6 ? 8V，碰撞池入口电压CEP 为8.0V，碰撞室出口电压为3.0V。
【文档编号】G01N30/02GK106053678SQ201610675896
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月16日
【发明人】苏昭仑, 叶少文, 游景水, 李珍
【申请人】汤臣倍健股份有限公司