一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法
【专利摘要】本发明公开一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，包括如下步骤：(1)标准溶液配制；(2)待测样处理；(3)在线固相萃取；(4)高效液相色谱?静电场轨道阱高分辨质谱测定。本发明采用高效、重复性好的在线固相萃取方法结合高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱测定蜂蜜中新烟碱类杀虫剂，可实现对样品中新烟碱类杀虫剂的定性和定量测定，检测结果灵敏可靠；采用本方法，样品的前处理过程快速简便，提高工作效率；本方法中，根据新烟碱类药物的特性，选择适当的萃取溶剂、清洗剂和洗脱剂以及适当的质谱检测参数，提高检测精度和可靠度。
【专利说明】
一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法
技术领域
[0001 ]本发明属于检测技术领域，涉及蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的检测方法，具体涉及一 种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的在线固相萃取-高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱测 定方法。
【背景技术】
[0002] 新烟碱类杀虫剂包括:吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒、氟啶虫酰胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫 胺、稀啶虫胺等。这类杀虫剂可广泛用于各种作物，如水稻、小麦、棉花、豆类、油菜、芝麻、土 豆、番茄等。可广谱杀灭刺吸式口器、鞘翅目、鳞翅目、双翅目害虫等。这类杀虫剂起效快，残 留期长，有可能严重影响蜜蜂的授粉和生存，欧盟、美国、加拿大、巴西和我国已经陆续启动 对新烟碱类杀虫剂的审查和限制使用。目前测定蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的前处理方法多是 手动固相萃取，耗费较多的人力，重复性差，而在线固相萃取，节省人力，重复性好;仪器方 法多为高效液相色谱串联三重四级杆质谱法，未见高分辨质谱法，特别是静电场轨道阱高 分辨质谱技术在蜂蜜中新烟碱类杀虫剂测定中的应用。
【发明内容】
[0003] 发明目的:本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、精准度高的 蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的在线固相萃取-高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱测定 方法，该方法可同时实现样品的定性和定量检测且灵敏高、结果可靠。
[0004] 技术方案:本发明所述的一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，包括如下 步骤：
[0005] (1)标准溶液配制:将新烟碱类药物标准品用甲醇配制成浓度为0.8~1.2mg/mL的 标准溶液，2~6 °C保存;再用甲醇逐级稀释成浓度为0.8~1.2iig/mL的标准溶液；
[0006] (2)待测样处理:将待测蜂蜜样品搅匀，并称取0.5~1.5g置于50mL离心管中，加入 pH为7~8的磷酸盐缓冲液12~18mL，涡旋，充分溶解均匀;置于超声仪中超声15~30min;过 滤，取滤液至进样小瓶；
[0007] (3)在线固相萃取：采用HLB萃取柱，用甲醇和水分别进行活化，流速为4~6mL/ min;然后进样，上样量为0.3~0.8mL，上样溶剂为0.4~0.6mL的水，流速为0.4~0.6mL/ min ;清洗溶剂为水，体积0.5~1.5mL，流速为4~6mL/min ;洗脱溶剂为甲醇，体积0.3~ 0 ? 7mL，流速 0 ? 10 ~0 ? 20mL/min。
[0008] (4)高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定：采用加热的电喷雾离子源 (HESI-II);毛细管温度为300~400°C，鞘气流速45~55L/min，辅助气流速5~7L/min，吹扫 气流速3~5L/min;喷雾电压为3KV，透镜电压为50V;采用正离子模式采集数据;进样前将色 谱柱平衡15~30min，在柱温为25~35°C下重复进同一浓度的标准溶液，当峰面积变化在土 10 %以内，保留时间在± 5 %以内，开始正式进样;进样系列标准溶液浓度为5~150ng/mL， 以标准溶液峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样 品进行定量，样品溶液中药物的响应值在仪器测定的线性范围内。
[0009] 本发明中，所述的新烟碱类药物包括吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒、氟啶虫酰胺、噻虫 嗪、噻虫啉、呋虫胺和烯啶虫胺。
[0010] 优选地，步骤(3)中活化剂甲醇和水的体积分别为lmL。
[0011] 优选地，步骤⑷中采用的色谱柱为Agilent Polaris C-18,长度为100mm，内径为 2 ? 1mm，填料粒径为5ym。
[0012]优选地，步骤(4)中采用梯度洗脱程序，流动相为醋酸铵与甲醇的混合液。
[0013]优选地，所述的梯度洗脱程序具体如下：时刻Omin:采用95wt%的醋酸铵和5wt% 的甲醇混合液做流动相，流速为〇. 3mL/min;时刻2min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇 混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻4min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液 做流动相，流速为0.3mL/min;时刻8min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液做流动 相，流速为〇. 3mL/min;时刻9min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流 速为0.3mL/min;时刻1 lmin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为 0?3mL/min〇
[0014]优选地，步骤(4)中所述的鞘气、辅助气和吹扫气均为N2。
[0015]优选地，步骤(4)中采集数据的扫描范围为100-500m/z，一级全扫描的分辨率R = 70000〇
[0016]有益效果：（1)本发明采用高效、重复性好的在线固相萃取方法结合高效液相色谱 串联静电场轨道阱高分辨质谱测定蜂蜜中新烟碱类杀虫剂，可实现对样品中新烟碱类杀虫 剂的定性和定量测定，检测结果灵敏可靠;且采用本方法，对样品的前处理过程快速简便， 提高工作效率；（2)本方法中，根据新烟碱类药物的特性，选择适当的萃取溶剂、清洗剂和洗 脱剂以及适当的质谱检测参数，提高检测精度和可靠度；（3)本方法的自动化程度高，有效 避免人为操作带来的误差。
【附图说明】
[0017]图1为各类新烟碱类药物标准溶液色谱图；（其中：1、吡虫啉;2、噻虫嗪;3、噻虫胺； 4、啶虫脒;5、噻虫啉;6、氟啶虫酰胺;7、呋虫胺;8、烯啶虫胺）；
[0018] 图2为采用本方法检测含有新烟碱类杀虫剂的阴性洋槐蜜样品的色谱图，（其中： 1、吡虫啉；2、噻虫嗪；3、噻虫胺;4、啶虫脒;5、噻虫啉;6、氟啶虫酰胺；7、呋虫胺;8、烯啶虫 胺)。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于 所述实施例。
[0020] 本发明所述的实例使用的质谱仪为Thermo Fisher公司的Q-Exactive型高效液相 色谱-静电场轨道讲高分辨质谱仪，数据处理系统为美国Thermo Fisher公司的Xcalibur数 据处理系统;试剂均为常规市售。
[0021] 实施例:一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，包括如下步骤：
[0022] (1)标准溶液配制:将新烟碱类药物标准品用甲醇配制成浓度为lmg/mL的标准溶 液，4°C保存;再用甲醇逐级稀释成浓度为lyg/mL的标准溶液；
[0023] (2)待测样处理:将待测蜂蜜样品搅匀，并称取lg置于50mL离心管中，加入pH为7.8 的磷酸盐缓冲液15mL，涡旋，充分溶解均匀;置于超声仪中超声20min;过滤，取滤液至进样 小瓶；
[0024] (3)在线固相萃取:采用HLB萃取柱，用lmL的甲醇和lmL的水分别进行活化，流速为 5mL/min;然后进样，上样量为0.5ml，上样溶剂为0.5ml的水，流速为0.5mL/min;清洗溶剂为 lmL的水，流速为5mL/min;洗脱溶剂为0.5mL的甲醇，流速为0.15mL/min;
[0025] (4)高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定：采用加热的电喷雾离子源 (HESI-n );毛细管温度为350°C，鞘气(N2)流速50L/min，辅助气（N2)流速6L/min，吹扫气 (N 2)流速3L/min;喷雾电压为3KV，透镜电压为50V;采用正离子模式采集数据，一级全扫描 的分辨率R = 70000,扫描范围：100-500m/z;采用的色谱柱为AgilentPolaris C-18,长度为 100mm，内径为2.1mm，填料粒径为5ym;进样前将色谱柱平衡15min，在柱温为30°C下重复进 同一浓度的标准溶液，当峰面积变化在±10%以内，保留时间在±5%以内，开始正式进样； 进样系列标准溶液浓度为5，10，20，50，100，150ng/mL，本过程中采用梯度洗脱程序，流动相 为醋酸铵与甲醇的混合液；梯度洗脱程序具体如下：时刻Omin :采用95wt %的醋酸铵和 5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻2min:采用95wt %的醋酸铵和5wt % 的甲醇混合液做流动相，流速为〇. 3mL/min;时刻4min:采用5wt%的醋酸铵和95wt%的甲醇 混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻8min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液 做流动相，流速为0.3mL/min;时刻9min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动 相，流速为〇. 3mL/min;时刻1 lmin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流 速为0.3mL/min以标准溶液峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标 准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值在仪器测定的线性范围内。
[0026] 其中，高效液相色谱梯度洗脱程序见表1;新烟碱类药物的中英文名称及质谱精确 质量数(正离子)见表2;
[0027]表1高效液相色谱梯度洗脱程序
[0030]表2新烟碱类药物的中英文名称及质谱精确质量数(正离子）
[0032] 参考上表2数据和图1曲线，样品中是否存在某种药物，需满足如下条件:该样品出 现的色谱峰的保留时间与标准品保留时间相差不超过± 2.5 % ;样品与标准品的精确质量 数的偏差小于5 X 1(T6，则确定为样品中含有该药物；图2为采用本方法检测含有新烟碱类杀 虫剂的阴性洋槐蜜样品的色谱图，由两图对比可知，对于含有各类新烟碱类药品的蜂蜜样 品，采用本方法的检测结果与标准品的出峰位置基本一致，证明，采用本发明方法对蜂蜜中 新烟碱检测结果的准确性和可靠性。
[0033] 采用本发明方法对两种典型的蜂蜜的阴性样品加标回收率范围见表3;
[0034] 表3典型蜂蜜阴性样品加标回收率范围
[0035]
[0036] 由表3数据可证明，采用本发明方法，对典型蜂蜜中的新烟碱类杀虫剂的加标回收 率可控制在一个较适宜且稳定的范围内，证明本方法用于检测蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的可 靠度高，适于推广使用。
[0037] 如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释 为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对 其在形式上和细节上作出各种变化。
【主权项】
1. 一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 标准溶液配制:将新烟碱类药物标准品用甲醇配制成浓度为0.8~1.2mg/mL的标准 溶液，2~6 °C保存;再用甲醇逐级稀释成浓度为0.8~1.2yg/mL的标准溶液； (2) 待测样处理:将待测蜂蜜样品搅匀，并称取0.5~1.5g置于50mL离心管中，加入pH为 7~8的磷酸盐缓冲液12~18mL，涡旋，充分溶解均匀;置于超声仪中超声15~30min;过滤， 取滤液至进样小瓶； (3) 在线固相萃取:采用HLB萃取柱，用甲醇和水分别进行活化，流速为4~6mL/min;然 后进样，上样量为〇. 3~0.8mL，上样溶剂为0.4~0.6mL的水，流速为0.4~0.6mL/min;清洗 溶剂为水，体积〇 . 5~1.5mL，流速为4~6mL/min;洗脱溶剂为甲醇，体积0.3~0.7mL，流速 0·10~0.20mL/min; (4) 高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定：采用加热的电喷雾离子源(HESI-Π );毛细管温度为300~400 °C，鞘气流速45~55L/min，辅助气流速5~7L/min，吹扫气流速 3~5L/min;喷雾电压为3KV，透镜电压为50V;采用正离子模式采集数据;进样前将色谱柱平 衡15~30min，在柱温为25~35°C下重复进同一浓度的标准溶液，当峰面积变化在± 10 %以 内，保留时间在±5%以内，开始正式进样;进样系列标准溶液浓度为5~150ng/mL，以标准 溶液峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行 定量，样品溶液中药物的响应值在仪器测定的线性范围内。2. 根据权利要求1所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于:所述的 新烟碱类药物包括吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒、氟啶虫酰胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺和烯啶虫 胺。3. 根据权利要求1所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于：步骤 (3) 中活化剂甲醇和水的体积均为lmL。4. 根据权利要求1所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于：步骤 (4) 中采用的色谱柱为Agilent Polaris C-18,长度为100mm，内径为2.1mm，填料内径为5μ m〇5. 根据权利要求1所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于：步骤 (4)中采用梯度洗脱程序，流动相为醋酸铵与甲醇的混合液。6. 根据权利要求5所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于:所述的 梯度洗脱程序具体如下：时刻Omin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相， 流速为〇. 3mL/min;时刻2min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为 0.3mL/min;时刻4min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/ min;时刻8min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时 亥lj 9m i η :采用9 5wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/mi η;时刻 1 lmin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min。7. 根据权利要求1所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于：步骤 (4)中所述的鞘气、辅助气和吹扫气均为N2。8. 根据权利要求1所述的蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法，其特征在于：步骤 (4)中采集数据的扫描范围为100-500m/z，一级全扫描的分辨率R = 70000。
【文档编号】G01N30/06GK106053699SQ201610516529
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】张睿, 柳菡, 沈伟健, 丁涛, 赵增运, 吴斌, 沈崇钰, 张晓燕, 陈磊, 费晓庆, 刘芸
【申请人】江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心