一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素a检测方法
【专利摘要】一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法，用于小麦及其制品等中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。通过将NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光材料与赭曲霉毒素A核酸适配体连接形成信号探针，再通过碱基互补配对原则与适配体互补寡核苷酸单链修饰的Fe3O4磁性纳米材料形成纳米复合物，此时上转换发光信号达到最大；当检测体系中存在OTA时，OTA与OTA适配体特异性结合，从而使双链解链，通过监控近红外光区804nm处的上转换发光信号强度，能够定量检测OTA，线性范围为0.01?100ng/mL，检出限为0.005ng/mL。本发明用于OTA检测具有灵敏度高、快速简便的优点，并应用于啤酒样品的检测，结果准确可靠。
【专利说明】
一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素 A检 测方法
技术领域
[0001] -种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法，涉及纳米材 料和分析化学技术领域，用于对食品中赭曲霉毒素A进行检测。
【背景技术】
[0002] 赫曲霉毒素A(0chratoxins A，0TA)主要由纯绿青霉（Penicillium Verrucosum)、 赫曲霉(Aspergillus achraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三种真菌产生，不少其他产 毒菌株也不断地被报道。0TA主要污染植物性产品，比如谷物、豆类、花生、葡萄干、咖啡、啤 酒和红酒，不少报道显示，部分动物性产品中也存在0TA，这是因为食物链蓄积作用，动物摄 食部分受0TA污染的植物性产品导致0TA在动物体内富集。0TA具有较强的肝脏、肾脏和神经 毒性和致畸、致癌、致突变作用，对人类身体健康和食品安全造成很大的危害。因此，建立准 确、灵敏、快速的0TA检测技术对于食品安全具有重大意义。
[0003] 目前检测0TA的主要方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱 质联用法(LC-MS/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析分析法(GICA)等。ELISA 主要基于抗原抗体亲和反应，常用于OTA现场快速检测和大批量样品筛选。但抗体易受外界 条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或者细胞实验，繁琐费时，成本较高； 而基于仪器的分析方法则需要大量的人力和财力投入，常常只用于实验室分析。所以开发 一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法是很有必要的。
[0004] 核酸适配体(Aptamer)通过指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术从体外筛选得到的，能与相应配体专一 性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。这种寡核苷酸序列形成的高级结构能够识别与之对 应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比，适配体 的靶分子范围广，体外筛选，易人工合成和修饰，分子较小，稳定性好，对温度不敏感，容易 保存，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食 品安全中得到广泛应用。
[0005] 近年来，新型纳米材料在分析检测中的快速发展受到越来越多的科研工作者的青 睐，并涌现出了很多具有优秀特性的纳米材料。其中上转换发光纳米材料引起独特的光学 特性被人们所熟知。
[0006] 上转换发光纳米材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)的发光机制是基于 双光子或者多光子过程，是一种将红外光转变成可见光的有效途径。相对于传统的有机焚 光染料和其他荧光纳米材料，上转换发光纳米材料作为完全惰性的无机发光材料具有很大 的优势，光化学性质稳定，单色性强，具有较长的发光寿命，可以选择不同的基质材料和掺 杂离子来调节上转换发光，真正实现单激发多发射，有利于生物体系中多组分标记同时检 测。鉴于上述优点，上转换发光纳米材料已成为一种优秀的生物标记材料被广泛的用于生 物监测分析领域。
[0007] 本发明首先合成了在804nm处有强发射峰的近红外上转换发光纳米材料，其次用 一步合成法制备了氨基化Fe3〇4磁性纳米材料，并分别在近红外上转换发光纳米材料上修饰 0TA适配体和在Fe304磁性纳米材料上修饰互补寡核苷酸链，分别组成信号探针和磁性探 针，基于两者碱基互补配对原则，使得两种探针形成近红外上转换发光纳米材料-磁性纳米 材料纳米复合物，此时的发光强度达到最大。当加入不同量的0TA时，0TA与适配体进行特异 性结合，使得双链结构解离，部分近红外上转换发光纳米材料从磁性纳米材料表面脱落，近 红外上转换发光强度减弱，以980nm激光作为激发光源记录近红外上转换发光检测信号，通 过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品的检测，建立标准曲线，达到对含赭曲霉毒素A样品进行 定量检测的目的。该发明可以用于啤酒、玉米、谷物、饲料及其制品等样品中赭曲霉毒素A含 量的检测。
【发明内容】
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[0008] 一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法：将NaYF4: Yb0.2，TmQ.()2近红外上转换发光纳米材料和Fe 3〇4磁性纳米材料分别通过EDC/NHS反应和戊二 醛交联法偶联亲和素，利用亲和素和生物素之间的高亲和力，分别偶联生物素化0TA适配体 和互补链，基于杂交反应使两种材料形成纳米复合物，此时纳米复合物具有最大的发光信 号。当这个复合物体系中加入目标物0TA后，由于0TA适配体与0TA的特异性识别结合，0TA适 配体优先结合靶标0TA，导致0TA适配体与互补链的解离，造成近红外上转换发光纳米材料 和磁性纳米材料的分离，通过外加磁场作用，收集得到的纳米复合物中近红外上转换发光 纳米材料减少，此时的发光信号就会相应的减弱，根据加入靶标浓度与发光信号强度变化 量之间的关系，可以实现0TA的定量检测;步骤为：
[0009] (1)通过高温热解法技术，制备NaYF4: Ybo.2，Tmo.02近红外上转换发光纳米材料，并 对其做表面修饰。称取YC13 ? 6H20，YbCl3 ? 6H20，TmCl3 ? 6H2〇(Ln:78mol%Y3+，20mol%Yb3+， 2mo 1 % Tm3+;总共lmmo 1)加入到1 OOmL三口烧瓶中，加入6mL油酸以及15mL 1 -十八烯。在搅拌 下，逐渐升温至160°C，待形成均一的溶液后，自然冷却至室温。准确称取2.5mmol NaOH和 4mmol NH4F溶于10mL甲醇溶液中。将上述溶液缓慢加入到三口烧瓶中，磁力搅拌30min。再 将溶液缓慢加热去除甲醇，氩气保护下加热到300°C，并且持续lh。反应结束后，自然冷却至 室温，用水和乙醇离心所得材料清洗三次，储存备用。
[0010] (2)利用配体交换法对上转换发光纳米颗粒进行表面羧基化修饰。称取30mg油酸 修饰NaYF4: Ybo.2，Tmo.〇2UCNPs分散于4mL氯仿溶液中。于圆底烧瓶中，加入200mg聚丙稀酸(相 对分子量2000)和8mL超纯水，搅拌均匀充分溶解。将UCNPs氯仿溶液缓慢加入到圆底烧瓶 中，磁力搅拌24h后，离心收集材料，用超纯水清洗数次，得到聚丙烯酸修饰NaYF4: Ybo. 2， Tmo. Q2近红外上转换发光纳米材料，储存备用。
[0011 ] (3)采用一步溶剂法制备氨基化Fe3〇4磁性纳米材料。称取2.0g无水醋酸钠，1.0g FeCh ? 6H2O和6.5g 1，6_己二胺加入30mL乙二醇中，磁力搅拌下加热至50°C，待形成透亮均 一的胶体溶液后，转移到带内衬的反应釜中，在198°C件下反应6h。待反应釜冷却后，将釜内 液体转移到烧杯中，磁铁分离收集黑色固体，弃去上清，反复清洗几次。所得黑色固体在60 °(：条件下过夜干燥备用。
[0012] (4)利用EDC/NHS法将羧基化上转换发光纳米材料与亲和素(Avidin)偶联。称取 lOmg聚丙稀酸修饰的NaYF4: Ybo.2，Tm〇.()2近红外上转换发光纳米材料分散于5mL lOmmol/L 1^3化115.6)缓冲液中，充分超声分散，加入0.61^211^/1111^0(：溶液和0.21^211^/1^順3溶 液，37°C摇床中活化2h。离心收集材料，用磷酸缓冲液清洗三次。然后分散于磷酸缓冲液中， 加入lmL 0.5mg/mL亲和素溶液，在37°C摇床中反应12h。离心收集材料和上清，测定亲和素 反应前后的紫外吸收。
[0013] (5)利用戊二醛法将氨基化Fe3〇4磁性纳米材料与亲和素偶联。准确称取10mg氨基 化Fe3〇4磁性纳米材料分散于5mL 10mmol/L磷酸缓冲液中，充分超声分散，然后加入1.25mL 25 %戊二醛溶液，37 °C孵育2h，磁分离后，用磷酸清洗数次，磁分离收集后，分散于磷酸缓冲 液中，加入lmL 0.5mg/mL亲和素溶液，37°C摇床中反应12h后磁分离收集。
[0014] (6)利用通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的特异性结合将表面修饰亲 和素的近红外上转换发光纳米颗粒和亲和素修饰的Fe3〇4磁性纳米材料分别与生物素 (Bi〇t in)修饰的赭曲霉毒素A适配体DNA单链和互补链连接。具体方法为：将亲和素修饰 NaYF4: Ybo.2，Tmo.〇2近红外上转换发光纳米材料分散于磷酸缓冲液中，加入一定量的生物素 化0TA适配体，在37 °C摇床中孵育12h，离心收集材料和上清，用磷酸缓冲液清洗三次，将最 后得到的近红外上转换发光信号探针（apt-UCNPs)分散于BB缓冲液（10mM Tris，pH8.5， 120mM NaCl，5mM KC1 和20mM CaCl2)中。
[0015]将亲和素修饰的Fe3〇4磁性纳米材料分散于5mL磷酸缓冲液中，加入一定量的生物 素化0TA适配体互补链，在37°C摇床中孵育12h，磁分离收集材料，用磷酸缓冲液清洗数次， 将最后得到的互补链修饰的磁性纳米探针（cDNA-MNPs)分散于BB缓冲液（10mmol/L Tris， pH 8.5，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1 和20mmol/L CaCl2)中，4°C保存。
[0016] (7)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线。通过赭曲霉毒素A适配体DNA 与其互补DNA单链的杂交，取75yL信号探针和80yL磁性探针在BB缓冲液中37°C反应2h，得到 近红外上转换发光纳米材料-磁性纳米材料复合物，磁分离收集复合物，用BB缓冲液清洗数 次，保证游离的近红外上转换发光纳米材料完全除去，重悬于BB缓冲液中，在980nm激光激 发下得到804nm处的上转换发光信号，此时复合物的信号（1〇)最大。配制不同浓度的0TA标 准品加入到纳米复合物体系中，在37°C反应2h后，外界磁场分离下清洗数次，保证脱落下来 的UCNPs完全洗去。于荧光光谱仪中，在980nm激光激发下测定发光强度，随着赭曲霉毒素A 浓度的增加发光信号（I)逐步减小。根据发光差值(AI = I-Io)与对应的赭曲霉毒素A标准 品浓度建立标准曲线，实验结果在〇.〇l-l〇〇ng/mL区间内得到良好线性关系。
[0017] (8)对赭曲霉毒素A样品进行检测：对样品做简单的处理，随后直接加入到上述纳 米复合物体系中37°C孵育2h后，直接在980nm激光下激发得到804nm处的上转换发光信号， 从标准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。
[0018]本发明的优点是：
[0019] (1)利用适配体对被检测物质实现特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确 性。
[0020] (2)利用适配体与抗体相比较，具有可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本 低、批次间差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。
[0021] (3)利用激光诱导上转换发光，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。
[0022] (4)利用一步溶剂法制备Fe304磁性纳米材料将其用于分析检测过程，可以简化分 离过程，提高检测效率。
【附图说明】
[0023]图1:基于基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法的实验原 理图
[0024]图2:他￥?4113().2，1'111().()2近红外上转换发光纳米材料的电镜图（ &);聚丙烯酸修饰 NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2近红外上转换发光纳米材料的电镜图(b)
[0025]图3:氨基化Fe3〇4磁性纳米材料的电镜图
[0026] 图4:近红外NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2上转换发光纳米材料的XRD图
[0027] 图5:氨基化Fe3〇4磁性纳米材料的XRD图
[0028] 图6:他￥?4113().2，1'111().()2近红外上转换发光纳米材料的发光光谱
[0029] 图7:近红外上转换发光强度随赭曲霉毒素A变化叠加图（a);赭曲霉毒素A检测标 准曲线图（b)，浓度范围在0.01-100ng/mL。
【具体实施方式】
[0030] 本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同 替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
[0031] 实施例1:啤酒实际样品中赭曲霉毒素A检测标准曲线建立及检测样品预处理：啤 酒样品置于4°C冰箱冷藏30min，超声脱气。取脱气后啤酒样品20g，置于25mL容量瓶中，加 2%碳酸氢钠和15%氯化钠混合提取液至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤 液备用。
[0032] 从本地超市购买5中不同类别的啤酒，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定 其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。
[0033]表一:啤酒实际样品检测，本发明方法与ELI SA方法对比
[0034]
[0035] 注:ND为未检出
[0036] 实施例2:啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率实验样品预处理同实 施例1。
[0037]以实施例1得到的5组赭曲霉毒素A浓度数据为本底值，分别向其中加入五种不同 浓度的0TA标准品，同样利用本发明方法再次检测其中0TA的含量，得到检测值。回收率％ = (检测值-本底值)/添加量X 100%。从表二数据可以看到回收率在90.0%~105.0%，说明 本发明稳定，灵敏，准确，适用于啤酒实际样品中0TA的检测。
[0038]表二:啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率
【主权项】
1. 一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素 A检测方法，其特征在于:将 赭曲霉毒素 A(OTA)适配体与近红外NaYF4:YbQ.2，TmQ.() 2上转换发光纳米材料偶联形成信号探 针，同时生物素化0TA适配体互补寡核苷酸单链与Fe3〇 4磁性纳米材料连接形成磁性探针，通 过双链杂交形成似￥?4:￥13().2，1'1]1().()2近红外上转换发光纳米材料一Fe3〇4磁性纳米材料复合 物；向检测体系中加入OTA，0TA会优先与适配体结合，导致互补链与0TA适配体解离，从而使 一部分NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2近红外上转换发光纳米材料一Fe3〇4磁性纳米材料复合物分解，充 分磁分离去上清后，利用980nm激发，收集上转换发光在804nm处的发光信号；在0.01-100ng/mL浓度范围内，0TA的浓度与804nm处上转换发光信号变化呈正相关，建立标准曲线， 达到对0TA的定量检测，可用于啤酒中0TA的检测。
【文档编号】G01N33/543GK106053790SQ201610353399
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】王周平, 戴邵亮, 吴世嘉, 段诺
【申请人】江南大学