一种基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法，其包括步骤：(1)制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针；(2)将潜指纹采集在基底上；(3)将溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针的溶液滴到具有潜指纹的基底上，在室温(25℃?27℃)和潮湿(相对湿度为70％?80％)的环境下孵育1?30分钟以使SERS探针与潜指纹充分结合，然后用去离子水冲洗去掉非特异性吸附的夹心结构SERS探针并自然晾干或吹干；(4)将步骤(3)制得的基底样品用拉曼光谱仪进行成像。所述溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针是以金纳米颗粒为核，二氧化硅为壳，信号分子夹心位于所述核与所述壳之间，所述壳表面修饰有用于指纹识别的溶菌酶适配体。本方法操作简单，分辨率高，通用性好。
【专利说明】
一种基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学分析技术领域，具体涉及一种基于溶菌酶识别的潜指纹高清 晰成像新方法并提供了该方法的实施过程。
【背景技术】
[0002] 目前，指纹识别已经广泛地应用于法医调查和个人身份识别，包括个人认证信息、 安全调查和出入境管理等。指纹独一无二的图案(pattern)由一系列凸起的"嵴线"和凹陷 的"裕线"相间分布组成，并且终身不会改变。汗液通过嵴线上一排排的"孔"（汗腺)排出并 沉积在指尖。当手指接触到物体表面时，汗液将会被转移到物体表面并留下指纹嵴线图案 的镜像印痕。这种印痕通常在白光下肉眼是看不到的，因此叫做潜指纹（Latent Fingerprints，LFPs)。一般来说指纹的特征分为三个等级，即图案（pattern)、细节 (minutia points)和精细特征(pores and ridge contours)。在这三个指纹特征中细节和 精细结构具有唯一性，是个人身份鉴定的依据。但是细节和精细结构的可视化具有挑战性， 尤其是精细结构的可视化，需要借助于具有较高分辨率的成像技术。此外，潜指纹的可视化 常常受到很多因素的影响，比如基底表面的材质和指纹老化时间。因此，发展一种高分辨 的、普适化的指纹成像技术非常必要，并在化学和法医学领域中引起了广泛的研究兴趣。
[0003] 到目前为止已经发展了各种各样的潜指纹可视化方法，包括荧光法、质谱法、电化 学发光法、多金属沉积法、纳米等离子体成像法、红外光谱法和拉曼光谱法等。但是，大多数 可视化方法对指纹成像基底具有选择性，通用性较差，例如，在电化学发光方法中指纹需要 收集在一个导电的基底表面，而在质谱成像技术中指纹需要收集在一个光滑的半导体薄板 表面。在一些基于抗原和抗体间相互作用的成像策略中，成像基底表面需要进行复杂的前 处理或后处理。因此，这些要求限制了指纹可视化方法的应用范围。考虑到指纹检测在法医 鉴定中的重要性，仍迫切需要发展一种简单、低成本、无破坏性的并且通用的指纹成像技 术。然而，同时满足这些要求的指纹成像平台非常少见。
[0004] 表面增强拉曼散射(SERS)光谱法由于具有单分子灵敏度、谱线宽度窄、不受水分 子干扰，对检测体系无破坏性等优点，而广泛地应用于生物检测和成像，例如，这种无损和 无需标记的成像技术已经被用于抗肿瘤药物在活细胞新陈代谢过程中的监控和可视化、多 糖在癌细胞中表达的定位和检测分子在细胞内分布和转移路径的可视化。然而，目前基于 SERS的潜指纹成像技术仍存在通用性低和操作繁冗复杂的问题。
[0005] 溶菌酶(lysozyme)是一种存在于人类汗液中的多肽，在人类额头或鼻翼等皮肤表 面以及指纹嵴线中也普遍存在。使用潜指纹中存在的溶菌酶作为目标分子进行SERS成像识 另IJ，迄今为止，尚未见有关报道。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于溶菌酶拉曼光 谱成像的潜指纹高清识别方法，其针对潜指纹中的溶菌酶分子，使用溶菌酶适配体修饰的 夹心结构SERS探针辅助成像分析，用拉曼光谱仪对潜指纹进行成像分析。该方法包括以下 步骤：
[0007] (1)制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针；
[0008] (2)将潜指纹采集在基底上；
[0009] (3)将溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针的溶液滴到收集有潜指纹的基底 上，在室温(25°C-27°C)和潮湿(相对湿度为70%-80%)的环境下孵育1-30分钟以使SERS探 针与潜指纹充分结合后，然后用去离子水冲洗去掉非特异性吸附的夹心结构SERS探针并自 然晾干或吹干；
[0010] (4)将步骤(3)制得的基底样品用拉曼光谱仪进行成像分析，
[0011] 所述溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针是以金纳米颗粒为核，二氧化硅为 壳，信号分子夹心位于所述核与所述壳之间，所述壳表面修饰有用于指纹识别的溶菌酶适 配体。
[0012] 在另一优选例中，所述信号分子是对硝基苯硫酚，巯基吡啶或巯基苯甲酸。
[0013] 在另一优选例中，所述溶菌酶适配体的序列是5'-NH2-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'。应该理解，本发明提供的方法具有普适性，只需要按照本发 明的精神首先选择与溶菌酶相应的适配体即可。更优选地。适配体是在单链DNA片段的5'端 分别添加若干T碱基，例如5-10个。同时，该单链DNA片段的5 '端被氨基修饰。序列是5'-册12-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'的溶菌酶适配体仅作为优选实 施例示出。
[0014] 在另一优选例中，所述金纳米颗粒的直径为52.6~58.6nm。由于纳米金本身具有 良好的生物相容性，使得本发明所提供的溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针具有良好 的生物相容性，从而使得本发明所提供的探针对操作者没有任何毒害作用。纳米金的制备 可以根据现有技术中的已知的方法进行。实际上，该纳米金可以是任何尺寸、形状的金纳米 颗粒，上述直径为52.6~58.6nm金纳米颗粒仅作为优选实施例示出。
[0015] 在另一优选例中，硅层的厚度为2.5~10nm。硅层的厚度影响激光从壳层传递到金 核的效率，因此超薄的硅层是夹心结构拉曼信号增强探针用于指纹可视化成功地关键。上 述厚度为2.5~10nm硅层仅作为优选实施例示出。
[0016] 在另一优选例中，单个溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针表面所修饰的溶菌 酶适配体的数目为317~351。探针表面所修饰的溶菌酶适配体的数目直接影响指纹检测效 率。由于信号分子夹心在硅层内，完全自由的硅层表面可以修饰上最大量的溶菌酶适配体， 显著提高识别效率。根据朗伯-比尔定律可以估算单个探针表面溶菌酶适配体的数目，上述 单个探针表面溶菌酶适配体的数目为317~351仅作为优选实施例示出。
[0017] 在另一优选例中，所述基底是可用于拉曼光谱仪进行成像分析的玻璃、硅片、不锈 钢、塑料、有机薄膜等材料。
[0018] 在另一优选例中，制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针包括以下步骤：
[0019] (a)制备金纳米颗粒，（b)通过S-Au键将信号分子连接到所述金纳米颗粒上；（c)通 过硅酸钠水解包裹上硅层；（d)通过在硅层表面形成三嗪基将氨基修饰的溶菌酶适配体功 能在其表面。
[0020] 在另一优选例中，制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针包括以下步骤：
[0021] (a)将613yL四水合氯金酸水溶液（1 % (wt/wt))加入到盛有50mL去离子水的圆底 烧瓶中加热回流，溶液沸腾后再加入0.5mL柠檬酸三钠溶液（1 % (wt/wt))反应20min，停止 加热并冷却到室温，得纳米金溶胶；
[0022] (b)将300yL对硝基苯硫酚(ρΝΤΡ)的乙醇溶液（lmM)加入到步骤(a)制备的纳米金 溶胶中，并搅拌反应4h，形成AuOpNTP纳米颗粒溶液；
[0023] (c)将600yL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（lmM)加入到步骤(b)所制备AuOpNTP纳米 颗粒溶液中，在室温下搅拌反应30min，再加入4.8mL的娃酸钠水溶液(0.54% (wt/wt))，在 90°C油浴中搅拌反应30min后，迅速将圆底烧瓶移到冰水浴中以终止反应的进行，冷却到室 温后，再加入300yL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（lmM)并搅拌反应15min，再用乙醇和乙腈分 别离心洗涤三次，最后将Au@pNTP@Si0 2纳米颗粒溶于乙腈中，备用；
[0024] (d)将步骤(C)所制备的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒与3mL三聚氰酰氯（ImM)的乙腈溶 液在室温下反应4h，再用乙腈洗涤三次、乙醇洗涤两次、去离子水洗涤两次和硼酸缓冲溶液 (pH=8.4)洗涤两次，然后将活化的Au@pNTP@Si02纳米颗粒重新分散于2mL的硼酸缓冲溶液 (pH=8.4)中，备用；
[0025] (e)将5.6nmol的溶菌酶适配体（序列是5'-NH2-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'）溶解于0.4mL硼酸缓冲溶液(pH=8.4)中，再加入到步骤(d)中活 化的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒溶液中，混合物在室温下轻轻摇晃过夜反应，离心收集用溶菌 酶适配体修饰的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒。
[0026]在另一优选例中，步骤(2)还包括利用肥皂水、丙酮、乙醇、去离子水等对基底进行 清洗的步骤，以除去表面的灰尘和有机物，及其他影响观察及成像效果的杂质。
[0027]在另一优选例中，所述步骤(3)中溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针的溶液 所用溶剂是硼酸缓冲溶液(pH = 8.4)，其中探针的浓度为0.005mg/mL~0.02mg/mL，更优选 0·01mg/mL〇
[0028] 本发明的基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法选用溶菌酶的适配体 作为潜指纹成像的识别体，使用拉曼光谱仪对潜指纹进行成像分析，使用溶菌酶适配体修 饰的夹心结构SERS探针辅助进行成像分析。这种简单的潜指纹成像策略是将具有无损检测 的SERS成像技术与具有高灵敏、高选择性的适配体识别技术相结合。溶菌酶适配体是短的 单链寡核苷酸，当没有溶菌酶出现时，它会保持着单链的状态;但是当溶菌酶出现时它会折 叠成特殊的复杂的三维结构，然后键合在溶菌酶的表面，从而将夹心结构SERS探针沉积在 指纹的表面，实现指纹的检测。
[0029] 本发明的基于溶菌酶拉曼光谱成像的探针具有夹心结构，嵌入的拉曼信号分子有 效地避免了外部环境的干扰，确保了拉曼信号的稳定性和重现性;完全自由的硅层表面可 以最大量的修饰上溶菌酶适配体，从而提高指纹识别效率。并且与抗原抗体间相互作用相 比，适配体的识别表现出了一些明显的优势，比如设计路线的灵活性、合成条件的宽容性、 容易改性和生化稳定性等。因此，该潜指纹成像识别方法操作简单，不需要复杂的前处理或 后处理;具有较高的分辨率，指纹三级结构可以清晰识别；具有很好的通用性，不仅可用于 新鲜指纹还可以用于老化指纹在不同基底表面(光滑基底表面、花纹基底表面和半多孔基 底表面)的可视化。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明实施例1制备的溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针的透射电镜 照片。
[0031] 图2是实施例2的玻璃基底表面潜指纹的二级特性(a-f)和三级特性(f中的插图） SERS成像放大图，其中标尺为150微米，插图的标尺为40微米。
[0032] 图3是实施例4的不锈钢基底表面的指纹SERS成像图：（a-d)为一级特性；（e-h)为 二级特性，其中的标尺为150微米。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而 不是不用于限制本发明的范围。下面实施例中为注明具体条件的实验方法通常按照常规条 件，或按照厂商所建议的条件。
[0034] 下面实施例中所用溶菌酶适配体序列是5'-NH2-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'，由生工生物工程(上海)有限公司代为合成。
[0035] 硼酸缓冲溶液(pH= 8.4)的配制方法为18mL硼砂水溶液(0.05mo 1/L)加入到22mL 硼酸水溶液(〇. 2mol/L)中摇匀，备用。
[0036] 三聚氰酰氯（2,4,6-1：1'；[011101'0-1，3,5-1：1^32；[116)购买于上海阿拉丁试剂有限公 司。
[0037] 实施例1
[0038]制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针：
[0039] (a)将613yL四水合氯金酸水溶液（l%(wt/wt))加入到盛有50mL去离子水的圆底 烧瓶中加热回流，溶液沸腾后再加入0.5mL柠檬酸三钠溶液（1 % (wt/wt))反应20min，停止 加热并冷却到室温，得纳米金溶胶；
[0040] (b)将300yL对硝基苯硫酚(ρΝΤΡ)的乙醇溶液（lmM)加入到步骤(a)制备的纳米金 溶胶中，并搅拌反应4h，形成AuOpNTP纳米颗粒溶液；
[0041 ] (C)将600yL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（lmM)加入到步骤(b)所制备AuOpNTP纳米 颗粒溶液中，在室温下搅拌反应30min，再加入4.8mL的娃酸钠水溶液(0.54% (wt/wt))，在 90°C油浴中搅拌反应30min后，迅速将圆底烧瓶移到冰水浴中以终止反应的进行，冷却到室 温后，再加入300yL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（lmM)并搅拌反应15min，再用乙醇和乙腈分 别离心洗涤三次，最后将Au@pNTP@Si0 2纳米颗粒溶于乙腈中，备用；
[0042] (d)将步骤(C)所制备的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒与3mL三聚氰酰氯（ImM)的乙腈溶 液在室温下反应4h，再用乙腈洗涤三次、乙醇洗涤两次、去离子水洗涤两次和硼酸缓冲溶液 (pH=8.4)洗涤两次，然后将活化的Au@pNTP@Si02纳米颗粒重新分散于2mL的硼酸缓冲溶液 (pH=8.4)中，备用；
[0043] (e)将5.6nmol的溶菌酶适配体（序列是5'-NH2-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'）溶解于0.4mL硼酸缓冲溶液(pH=8.4)中，再加入到步骤(d)中活 化的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒溶液中，混合物在室温下轻轻摇晃过夜反应，离心收集用溶菌 酶适配体修饰的Au@pNTP@Si0 2纳米颗粒，最终将溶菌酶适配体修饰的Au@pNTP@Si02纳米颗 粒离心收集，并用硼酸缓冲溶液(pH=8.4)洗涤两次，再溶于2mL硼酸缓冲溶液(pH=8.4)中 备用。
[0044]本实施例制备的用于指纹成像的夹心结构拉曼信号增强探针的投射电镜参见图 1，从图中可以看出金纳米颗粒具有很好的分散性，形貌相对统一，并且在高倍放大图中可 以清晰地看到一个亮的圆环儿包裹着暗的金核，说明金纳米颗粒成功地并且完全的密封在 硅壳内。
[0045] 实施例2
[0046] 使用玻璃基底，基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法
[0047] 2.1制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针，具体参见实施例1。
[0048] 2.2潜指纹的采集
[0049] 指纹收集前，志愿者用肥皂将手清洗干净并干燥后，用手指在额头或鼻翼擦拭再 轻轻地将指纹按压在清洗干净的玻璃基底的表面，干净的玻璃基底是将基底依次经肥皂 水、乙醇、和去离子清洗。
[0050] 2.3潜指纹的处理
[0051 ] 将200yL的上述溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针溶液(浓度为0.01mg/mL) 与玻璃基底表面的潜指纹在室温(25°C_27°C)和潮湿(相对湿度为70%-80%)的环境下孵 育30min，然后用去离子水冲洗去掉非特异性吸附的夹心结构SERS探针，并自然晾干。
[0052] 2.4拉曼光谱成像
[0053]使用Horiba XploRA共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱成像，拉曼光谱激发光波长 为635nm，收集时间为0.1s。
[0054] 成像效果参见图2。
[0055] 实施例3
[0056] 使用多孔性基底(PVDF膜），基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法
[0057] 3.1制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针，具体参见实施例1。
[0058] 3.2潜指纹的采集
[0059] 指纹收集前，志愿者用肥皂将手清洗干净并干燥后，用手指在额头或鼻翼擦拭再 轻轻地将指纹按压在干净的多孔性基底(PVDF膜)表面，干净的多孔性基底(PVDF膜)是将基 底依次经乙醇和去离子清洗。
[0060] 3.3潜指纹的处理
[0061 ] 将200yL的上述溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针溶液(浓度为0.01mg/mL) 与上述多孔性基底(PVDF膜)表面的潜指纹在室温（25°C_27°C)和潮湿（相对湿度为70%-80%)的环境下孵育30min，然后用去离子水冲洗去掉非特异性吸附的SERS探针，并自然晾 干。
[0062] 3.4拉曼光谱成像
[0063]使用Horiba XploRA共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱成像，拉曼光谱激发光波长 为635nm，收集时间为0.1s。
[0064] 实施例4
[0065] 使用不锈钢基底(带有花纹），基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法
[0066] 4.1制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针，具体参见实施例1。
[0067] 4.2潜指纹的采集
[0068] 指纹收集前，志愿者用肥皂将手清洗干净并干燥后，用手指在额头或鼻翼擦拭再 轻轻地将指纹按压在清洗干净的不锈钢基底(带有花纹)表面，干净的不锈钢基底(带有花 纹)表面是将基底依次经乙醇和去离子清洗。
[0069] 4.3潜指纹的处理
[0070] 将200yL的上述溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针溶液(浓度为0.01mg/mL) 与上述不锈钢基底(带有花纹)表面的潜指纹在室温(25°C_27°C)和潮湿(相对湿度为70%-80%)的环境下孵育30min，然后用去离子水冲洗去掉非特异性吸附的SERS探针，并吹干。 [00 71] 4.4拉曼光谱成像
[0072]使用Horiba XploRA共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱成像，拉曼光谱激发光波长 为635nm，收集时间为0.1s。
[0073] 成像效果参见图3。
[0074] 实施例5
[0075] 使用半孔性基底(塑料），基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法
[0076] 5.1制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针，具体参见实施例1。
[0077] 5.2潜指纹的采集
[0078]指纹收集前，志愿者用肥皂将手清洗干净并干燥后，用手指在额头或鼻翼擦拭再 轻轻地将指纹按压在清洗干净的半空性基底(塑料)表面。干净的半孔性基底(塑料)是将基 底依次经乙醇和去离子清洗。
[0079] 5.3潜指纹的处理
[0080] 2)将收集到的潜指纹放置一个月以后，再将200yL的上述溶菌酶适配体修饰的夹 心结构SERS探针溶液(浓度为0.0 lmg/mL)与上述半孔性基底(塑料)表面的潜指纹在室温和 (25°C_27°C)和潮湿(相对湿度为70%-80%)的环境下孵育30min。然后用去离子水冲洗去 掉非特异性吸附的SERS探针，并自然晾干。
[0081] 5.4拉曼光谱成像
[0082]使用Horiba XploRA共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱成像，拉曼光谱激发光波长 为635nm，收集时间为0.1s。
[0083]以上具体实施例说明了本发明使用溶菌酶的适配体（lysozyme-binding aptamers，记做LBA)作为潜指纹成像的识别体，成功地识别并记录了潜指纹，但是它们仅为 本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围。本发明的上述实施例还可以做出各种 变化，即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆 落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
【主权项】
1. 一种基于溶菌酶拉曼光谱成像的潜指纹高清识别方法，该方法包括以下步骤： (1) 制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针； (2) 将潜指纹采集在基底上； (3) 将溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针的溶液滴到收集有潜指纹的基底上，在 室温(25°C_27°C)和潮湿(相对湿度70%-80%)的环境下孵育1-30分钟以使SERS探针与潜 指纹充分结合后，然后用去离子水冲洗去掉非特异性吸附的夹心结构SERS探针并自然晾干 或吹干； (4) 将步骤(3)制得的基底样品用拉曼光谱仪进行成像分析， 所述溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针是以金纳米颗粒为核，二氧化硅为壳，信 号分子夹心位于所述核与所述壳之间，所述壳表面修饰有用于指纹识别的溶菌酶适配体。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述信号分子为对硝基苯硫酚，巯基吡啶或巯基苯 甲酸。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述溶菌酶适配体的序列是5'-NH2-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'〇4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述金纳米颗粒的直径为52.6~58.6nm。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述基底是玻璃、硅片、不锈钢、塑料或有机薄膜。6. 根据权利要求1所述的方法，其中制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针包括 以下步骤： (a)制备金纳米颗粒；（b)通过S-Au键将信号分子连接到所述金纳米颗粒上；（c)通过硅 酸钠水解包裹上硅层；（d)通过在硅层表面形成三嗪基将氨基修饰的溶菌酶适配体功能在 其表面。7. 根据权利要求1所述的方法，其中制备溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针包括 以下步骤： (a) 将613yL四水合氯金酸水溶液（1 % (wt/wt))加入到盛有50mL去离子水的圆底烧瓶 中加热回流，溶液沸腾后再加入0.5mL柠檬酸三钠溶液（1 % (wt/wt))反应20min，停止加热 并冷却到室温，得纳米金溶胶； (b) 将300yL对硝基苯硫酚(ρΝΤΡ)的乙醇溶液（lmM)加入到步骤(a)制备的纳米金溶胶 中，并搅拌反应4h，形成AuOpNTP纳米颗粒溶液； (c) 将600yL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（lmM)加入到步骤(b)所制备AuOpNTP纳米颗粒 溶液中，在室温下搅拌反应30min，再加入4.8mL的娃酸钠水溶液(0.54 % (wt/wt))，在90 °C 油浴中搅拌反应30min后，迅速将圆底烧瓶移到冰水浴中以终止反应的进行，冷却到室温 后，再加入300yL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（lmM)并搅拌反应15min，再用乙醇和乙腈分别 离心洗涤三次，最后将Au@pNTP@Si0 2纳米颗粒溶于乙腈中，备用； (d) 将步骤(c)所制备的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒与3mL三聚氰酰氯（ImM)的乙腈溶液在室 温下反应4h，再用乙腈洗涤三次、乙醇洗涤两次、去离子水洗涤两次和硼酸缓冲溶液(pH = 8.4) 洗涤两次，然后将活化的411%)犯1^3102纳米颗粒重新分散于21^的硼酸缓冲溶液(？!1 = 8.4) 中，备用； (e) 将5.6nmol的溶菌酶适配体（序列是5'-NH2-TTT TTT ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'）溶解于0.4mL硼酸缓冲溶液(pH = 8.4)中，再加入到步骤(d)中活化的 Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒溶液中，混合物在室温下轻轻摇晃过夜反应，离心收集用溶菌酶适 配体修饰的Au@pNTP@Si〇2纳米颗粒。8. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)还包括利用肥皂水、丙酮、乙醇、去离子水 对基底进行清洗的步骤，以除去表面的灰尘和有机物，及其他影响观察及成像效果的杂质。9. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中溶菌酶适配体修饰的夹心结构SERS探针 的溶液中溶剂是硼酸缓冲溶液(pH = 8.4)，其中夹心结构SERS探针的浓度为0.005mg/mL~ 0.02mg/mL〇10. 根据权利要求9所述的方法，其中夹心结构SERS探针的浓度为0.0 lmg/mL。
【文档编号】G01N21/65GK106093005SQ201610396644
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日 公开号201610396644.6, CN 106093005 A, CN 106093005A, CN 201610396644, CN-A-106093005, CN106093005 A, CN106093005A, CN201610396644, CN201610396644.6
【发明人】赵静静, 张炜佳, 刘宝红, 乔亮, 金虎林, 张昆
【申请人】上海海洋大学, 张炜佳, 刘宝红, 乔亮, 张昆, 金虎林