一种基于uplc指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种基于UPLC指纹图谱模式鉴别何首乌的方法，包括：对待测何首乌样本进行取样，进行UPLC分析，得到UPLC指纹图谱；在所述指纹图谱中选取何首乌及伪品的多个共有色谱峰的并集作为研究指标，通过偏最小二乘法识别方法获取临界值；将所述临界值与预测临界值相比较，当所述临界值当大于所述预测临界值时，所述样本为真品，当所述临界值当小于所述预测临界值时，所述样本为伪品。本发明公开了一种基于UPLC指纹图谱模式鉴别何首乌的应用。本发明具有在短时间内就可以分析处理大量的样本，快速鉴别出伪品及掺伪品的特点。
【专利说明】
一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及中药鉴别领域，具体涉及一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌 的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 中药指纹图谱利用现代信息采集技术和质量分析手段获取中药所有化学特征和 生物学特征的图谱，具有整体性和模糊性等特点，能全面反映中药内在化学成分的种类与 数量，进而反映中药的质量，在中药研究中具有广泛的应用。在多种指纹图谱技术中，色谱 指纹图谱技术是复杂天然产物，尤其是中药，定性与定量分析的有效工具，其能够提供中药 中所有化学成分的综合谱图，是中药质量控制的有效方法之一，并得到了世界卫生组织 (WHO)和食品药品监督管理局(FAD)普遍认可。但是中药本身化学成分复杂，加上指纹图谱 研究也存在着诸多问题，如基线漂移、色谱峰重叠、背景噪音高、低信号-噪音比等色谱分析 常见问题，均在不同程度上限制了中药指纹图谱在中药质量控制与评价中的应用。化学计 量学通过统计学或数学方法对化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系，可用于解决 中药指纹图谱中的常见问题，并可以提供多种分析识别方法，化学计量学方法和指纹图谱 技术相结合的研究方法在中药的质量控制及评价研究中具有重要的科学价值和实际意义。 [0003] 全国常用中药何首乌为寥科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb)的干燥 块根，白首乌为萝蘑科植物，全国以白首乌为名的植物包括:戟叶牛皮消、耳叶牛皮消、隔山 消等。白首乌与何首乌为不同科属来源的两种植物性药材，两者植物形态明显不同，但是有 些地区出现将萝蘑科植物白何首乌与寥科植物何首乌视为一物混用的现象，同时白何首乌 是何首乌的常见伪品之一。现代研究表明，两者的化学成分及药理作用等方面有很大差别， 效用也不相同，不应相混。
[0004] 同时，在现有技术中，以往对于中药材的研究，多侧重于单一或几个有效成分，中 药指纹图谱中缺乏整体评价和分析的系统性方法。
【发明内容】
[0005] 本发明设计开发了一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，目的在于 通过指纹图谱的方式能够快速、准确以及能够在短时间内分析处理大量样品，鉴别伪品的 方法。
[0006] 本发明还设计开发了一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法的应用， 目的在于能够快速准确的鉴别掺有白首乌伪品的何首乌样本。
[0007] 本发明提供的技术方案为：
[0008] -种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，包括：
[0009] 对待测何首乌样本进行取样，进行UPLC分析，得到UPLC指纹图谱；
[0010]在所述指纹图谱中选取待测生何首乌样本的共有色谱峰的并集作为研究指标，通 过偏最小二乘法识别方法获取临界值；
[0011] 将所述临界值与预测临界值相比较，当所述临界值当大于所述预测临界值时，所 述样本为真品，当所述临界值当小于所述预测临界值时，所述样本为伪品；
[0012] 其中，在所述偏最小二乘法识别方法中，将所述色谱峰的出峰面积及保留时间形 成输入矩阵，分类结果的虚设变量作为输出矩阵，进而得到所述临界值。
[0013] 优选的是，还包括:预先选取何首乌及伪品样本，分别得到所述何首乌及所述伪品 的UPLC指纹图谱，将所述何首乌及所述伪品的指纹图谱中的多个共有色谱峰的并集作为研 究指标，将出峰面积及保留时间形成输入矩阵，分类结果的虚设变量作为输出矩阵，进而得 到所述预测临界值。
[0014] 优选的是，所述伪品为白首乌。
[0015] 优选的是，得到所述指纹图谱包括如下步骤：
[0016] 将所述何首乌及所述白首乌样本粉碎，过4号药典筛，分别取粉末，加入甲醇溶解， 超声后过滤，取续滤液进行UPLC分析;以及
[0017] 在流动相为甲醇和0.2 %甲酸水溶液，流速为0.3毫升/分钟，检测波长为260纳米， 保留时间为20分钟的色谱条件下，进行进样，得到所述指纹图谱。
[0018] 优选的是，所述待测何首乌样本为含有5%~95%的白何首乌伪品的何首乌样本。 [0019] 优选的是，所述待测何首乌样本为含有5 %、10 %、25 %、50 %、75 %及95 %的白何 首乌伪品的何首乌样本。
[0020] 优选的是，对所述待测何首乌样本的制备包括:分别称取所述何首乌及所述白何 首乌过4号药典筛的粉末，制备含有5%、10%、25%、50%、75%及95%的白何首乌伪品的生 首乌样本。
[0021] 优选的是，所述UPLC指纹图谱分析以25个峰作为研究指标;其中，16个来源于所述 何首乌的共有色谱峰，9个来源于所述白何首乌的共有色谱峰。
[0022] -种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法的应用，包括：用于鉴别掺有 10%~95%白首乌的何首乌样本。
[0023] 优选的是，用于鉴别掺有10%、25%、50%、75%或95%白首乌的何首乌样本。
[0024] 本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：
[0025] 通过本发明的鉴别方法，能够鉴别掺有10%以上白首乌的何首乌样品，本发明操 作简单，对样品只需要做简答的处理，在短时间内就可以分析处理大量的样本，快速鉴别出 伪品及掺伪品，是一种客观有效评价何首乌真伪的方法。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明所述的何首乌、白首乌及掺伪混合物的UPLC指纹图谱。
[0027]图2a建立的PLS-DA模型对何首乌组的预测临界值图。
[0028]图2b建立的PLS-DA模型对白首乌组的预测临界值图。
[0029]图3a为根据建立的PLS-DA模型对何首乌组的预测结果图。
[0030]图3b为根据建立的PLS-DA模型对白首乌组的预测结果图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0032] 如图1所示，一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，包括:对待测何 首乌样本进行取样，进行UPLC分析，得到UPLC指纹图谱;在所述指纹图谱中选取何首乌及伪 品的多个共有色谱峰的并集作为研究指标，通过偏最小二乘法识别方法获取临界值;将所 述临界值与预测临界值相比较，当所述临界值当大于所述预测临界值时，所述样本为真品， 当所述临界值当小于所述预测临界值时，所述样本为伪品；其中，在所述偏最小二乘法识别 方法中，将所述色谱峰的出峰面积及保留时间形成输入矩阵，分类结果的虚设变量作为输 出矩阵，进而得到所述临界值。
[0033] 在另一种实施例中，还包括:预先选取何首乌及伪品样本，分别得到所述何首乌及 所述伪品的UPLC指纹图谱，将所述何首乌及所述伪品的指纹图谱中的多个共有色谱峰的并 集作为研究指标，将出峰面积及保留时间形成输入矩阵，分类结果的虚设变量作为输出矩 阵，进而得到所述预测临界值。
[0034]在另一种实施例中，伪品为白首乌。
[0035] 在另一种实施例中，建立指纹图谱包括如下步骤：
[0036] 将何首乌及白首乌样本粉碎，过4号药典筛，分别取粉末，加入甲醇溶解，超声后过 滤，取续滤液进行UPLC分析;在流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液，流速为0.3毫升/分钟，检 测波长为260纳米，保留时间为20分钟的色谱条件下，进行进样，得到指纹图谱。
[0037] 在另一种实施例中，掺伪何首乌样本为含有5 %~95 %的白何首乌伪品的何首乌 样本。
[0038] 在另一种实施例中，掺伪何首乌样本为含有5 %、10 %、25 %、50 %、75 %及95 %的 白何首乌伪品的何首乌样本。
[0039] 在另一种实施例中，对掺伪何首乌样本的制备包括:分别称取何首乌及白何首乌 过4号药典筛的粉末，制备含有5%、10%、25%、50%、75%及95%的白何首乌伪品的何首乌 样本。
[0040] 在另一种实施例中，UPLC指纹图谱分析以25个峰作为研究指标;其中，16个来源于 何首乌的共有色谱峰，9个来源于白何首乌的共有色谱峰。
[0041] -种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法的应用，包括：用于鉴别掺有 10%~95%白首乌的何首乌样本。
[0042] 在另一种实施例中，，用于鉴别掺有10%、25%、50%、75%或95%白首乌的何首乌 样本。
[0043] 实施例
[0044] 1 材料
[0045] 1.1药品及试剂
[0046] 色谱甲醇和甲酸分别购自美国Sigma公司，天津科密欧化学试剂有限公司。所用水 为屈臣氏蒸馏水。何首乌及白首乌药材来源途径有网购和中药材公司两种。样本信息如表1 所示。
[0047] 表1样本信息
[0049] 1.2仪器(如表2所示）
[0050]表2仪器信息
[0053] 2.实验方法
[0054] 2.1UPLC 色谱条件
[0055] 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH shield RP18(2· 1 X 100mm, 1 ·7μηι);流动相： 甲醇-0.2 %甲酸水溶液，梯度洗脱程序见下表3;柱温:45 °C ;流速:0.3mL/min;进样量:3yL; 检测波长：260nm。在该色谱条件下，何首乌、白首乌及其掺伪混合物均具有良好的分离能 力，分析色谱图如图1所示(A为白首乌、B为何首乌、C为掺有50 %白首乌的何首乌）。
[0056]表3梯度洗脱程序
[0058] 2.2样本溶液的制备
[0059] 单一样本制备:将何首乌与白何首乌样本粉碎，过4号药典筛，精密称取0. lg粉末， 加入5mL甲醇，超声15min，0.22μηι滤膜过滤，取续滤液进行UPLC分析。
[0060] 混合物的制备：分别称取何首乌、白首乌过4号药典筛的粉末，制备含有95 %、 75%、50%、25%、10%、5%伪品（白首乌）的何首乌样本。
[0061] 所有样本均重复制备三次，采用上述色谱条件进行分析。
[0062] 2.3方法学考察
[0063] 2.3.1精密度试验
[0064]分别取同一何首乌样本与同一白首乌样本按"2. Γ项下色谱条件，在同一天内连 续自动进样测定6次，通过液相工作站自动积分获取色谱峰的峰面积与保留时间，何首乌及 白首乌选取的色谱峰个数分别为16和9,并分别计算RSD值，如表4~7所示，何首乌选定的16 个色谱峰的峰面积RSD值均小于3.91 %，保留时间RSD值均小于0.14% ;白首乌选定的9个色 谱峰的峰面积RSD值均小于3.80%，保留时间RSD值均小于0.12%，表明仪器精密度良好。 [0065]表4何首乌精密度试验结果一一峰面积(η = 6)
[0067] 表5何首乌精密度试验结果一一保留时间(η = 6)
[0068]
[0070]表3白首乌精密度试验结果一一峰面积(η = 6)
[0072 ]表伯首乌精密度试验结果一一保留时间(η = 6)
[0073]
[0074] 2.3.2重复性试验
[0075] 取同一何首乌样本与同一白首乌样本，分别照"2.2"项下何首乌和白首乌样本溶 液的制备方法平行制备6份何首乌样本溶液和6分白首乌样本溶液，按"2. Γ项下色谱条件， 连续进样6针，何首乌及白首乌选取的色谱峰个数分别为16和9，并分别计算RSD值，如表8~ 11所示，何首乌选定的16个色谱峰的峰面积RSD值均小于4.84 %，保留时间RSD值均小于 0.07 % ;白首乌选定的9个色谱峰的峰面积RSD值均小于4.97 %，保留时间RSD值均小于 0.11%，结果表明重复性良好，且保留时间几乎未发生漂移。
[0076] 表8何首乌重复性试验结果一一峰面积(η = 6)
[0078] 表9何首乌重复性试验结果一一保留时间(η = 6)[0079]
[0081]表10白首乌重复性试验结果一一峰面积(n = 6)
[0083] 表11白首乌重复性试验结果一一保留时间(n = 6)
[0084]
[0085] 2.4数据分析
[0086] 采用"2. Γ项下的色谱条件对132个样本(81个何首乌;33个伪品白首乌；18个掺伪 样本)进行分析，以何首乌的共有峰与白首乌的共有峰的并集作为研究峰指标。通过UPLC分 析以25个峰作为研究指标(来源于何首乌16个，白首乌9个化学成分峰）。在本实施例中，将 获取的峰面积、保留时间形成矩阵，采用PLS-Toolbox 7.9(Vigenvector Research Incorporated，WA，USA)进行化学模式识别分析;建立PLS-DA模式识别方法，并进行样本及 掺伪样本的预测。校正集样本由66个何首乌样本和21个白首乌样本组成，预测集样本由15 个何首乌样本、12个白首乌样本、18个掺伪样本组成。
[0087] 2.4.1偏最小二乘判别分析识别方法
[0088]偏最小二乘法(PLS)是一种寻找独立变量X与独立变量Y之间的基本联系，这个模 型不仅考虑了X变量，同时也考虑了X变量与Y变量之间的关联。偏最小二乘法-判别分析 (PLS-DA)是PLS的一种转化形式，采用分类响应变量Y来提高类别间的分离。在本实验中模 型由X矩阵与Y矩阵共同组成，X矩阵由指纹图谱组成，Y矩阵由描述样本的分类结果的虚设 变量组成(在校正集中，设置Y矩阵中白首乌样本值为0,何首乌样本值为1)。预测样本同时 满足与校正集样本指纹图谱无明显差异且虚设变量的预测值在定义的临界值范围内。计算 校正模型的数据包括校正误差均方根(RMSEC)、交叉验证误差均方根(RMSECV)及测定的r 2 系数。
[0089] 3实验结果
[0090]采用87个样本(66个何首乌样本和21个白首乌样本)作为校正集建立模型;在校正 集中，建立模型的X矩阵组成为87个样本X25个化学成分，即矩阵的列标签为25个化学成分 的保留时间，行标签为87个样本，设置Y矩阵中白首乌样本值为0,何首乌样本值为1。采用 ventetian blinds方法进行交叉验证，数据分割数为10，对输入数据的前处理方法为 autoscale。在PLS-DA模型中，选择8个潜变量(LVs)对X矩阵与虚拟Y变量的累计贡献率分别 为95.43%和97.50%，所建模型的1?^(：值、1?^(^、建模与交叉验证的￥系数等如表12所 示，所建立的模型具有良好的灵敏度和专属性，错误率为零，具有较低的误差值，采用接受 者操作特性曲线（receiver operating characteristic curve，R0C)对建立的PLS-DA模型 进行性能分析，结构显示，PLS-DA模型的灵敏度、专属性、准确度均达到了 100%，说明所建 立的模型具有良好的分类与预测性能。采用校正样本集样本建立PLS-DA模型后，可获取预 测时Y的临界值，何首乌组与白首乌组预测的临界值分别为〇. 7651，0.2349(获取的临界值 如图2所示）。预测结果如图3所示（圆形代表何首乌，方形代表白首乌，三角形代表待测样 本），由图可看出，掺有95 %、75 %、50 %、25 %、10 %伪品的何首乌样本均被预测为伪品，仅 含有5%伪品的何首乌样本被预测为正品何首乌，即掺伪品含量大于或等于10%的何首乌 均可被鉴别出。
[0091] 表12PLS-DA模型分析结果
[0092]
[0093] 4.结论与讨论
[0094]本实验充分利用UPLC-PDA获得的峰面积、保留时间等相关信息，建立了PLS-DA化 学模式识别模型，并对混有不同比例伪品的何首乌、何首乌、白何首乌进行预测。结果表明 PLS-DA模型对何首乌和白首乌具有良好的分析和预测能力，对何首乌、白何首乌均可正确 识别，对于掺伪何首乌的检测限为10%，即PLS-DA模式识别技术能将掺入白首乌含量大于 或等于10 %的何首乌识别出伪品。
[0095] 化学模式识别对中药化学成分的分析和鉴定具有重要作用，本实验选择中药何首 乌及其常用伪品白首乌作为研究对象，从指纹图这一整体角度出发，系统研究了 PLS-DA化 学模式识别技术对何首乌的正品、伪品、掺伪样本的分析与预测能力，为何首乌的质量控制 和真伪鉴别提供了客观评价方法。
[0096] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在于，包括： 对待测何首乌样本进行取样，进行UPLC分析，得到UPLC指纹图谱； 在所述指纹图谱中选取所述待测何首乌样本的共有色谱峰的并集作为研究指标，通过 偏最小二乘法识别方法获取临界值； 将所述临界值与预测临界值相比较，当所述临界值当大于所述预测临界值时，所述样 本为真品，当所述临界值当小于所述预测临界值时，所述样本为伪品； 其中，在所述偏最小二乘法识别方法中，将所述色谱峰的出峰面积及保留时间形成输 入矩阵，分类结果的虚设变量作为输出矩阵，进而得到所述临界值。2. 如权利要求1所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在于，还 包括:预先选取何首乌及伪品样本，分别得到所述何首乌及所述伪品的UPLC指纹图谱，将所 述何首乌及所述伪品的指纹图谱中的多个共有色谱峰的并集作为研究指标，将出峰面积及 保留时间形成输入矩阵，分类结果的虚设变量作为输出矩阵，进而得到所述预测临界值。3. 如权利要求1或2所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在 于，所述伪品为白首乌。4. 如权利要求3所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在于，得 到所述指纹图谱包括如下步骤： 将所述何首乌及所述白首乌样本粉碎，过4号药典筛，分别取粉末，加入甲醇溶解，超声 后过滤，取续滤液进行UPLC分析；以及 在流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液，流速为0.3毫升/分钟，检测波长为260纳米，保留 时间为20分钟的色谱条件下，进行进样，得到所述指纹图谱。5. 如权利要求3所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在于，所 述待测何首乌样本为含有5 %~95 %的白何首乌伪品的何首乌样本。6. 如权利要求5所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在于，所 述待测何首乌样本为含有5%、10%、25%、50%、75%及95%的白何首乌伪品的何首乌样 本。7. 如权利要求6所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其特征在于，对 所述待测何首乌样本的制备包括:分别称取所述何首乌及所述白何首乌过4号药典筛的粉 末，制备含有5 %、10 %、25 %、50 %、75 %及95 %的白何首乌伪品的何首乌样本。8. 如权利要求4-7中任一项所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法，其 特征在于，所述指纹图谱分析以25个峰作为研究指标;其中，16个来源于所述何首乌的共有 色谱峰，9个来源于所述白首乌的共有色谱峰。9. 一种基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法的应用，其特征在于，包括:用于 鉴别掺有10%~95%白首乌的何首乌样本。10. 如权利要求9所述的基于UPLC指纹图谱模式识别鉴别何首乌的方法的应用，其特征 在于，用于鉴别掺有10%、25%、50%、75%或95%白首乌的何首乌样本。
【文档编号】G01N30/02GK106093229SQ201610382170
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月31日 公开号201610382170.X, CN 106093229 A, CN 106093229A, CN 201610382170, CN-A-106093229, CN106093229 A, CN106093229A, CN201610382170, CN201610382170.X
【发明人】任晓亮, 孙立丽, 张慧杰, 王萌, 刘亚男, 邱喜龙, 戚爱棣
【申请人】天津中医药大学