一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法
【专利摘要】本发明涉及一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法。该方法，以玄参配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰S峰哈巴俄苷、1号峰哈巴苷、2号峰和3号峰肉桂酸，选择S峰哈巴俄苷，确定了玄参配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测其质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
【专利说明】
一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方 法。
【背景技术】
[0002] 玄参配方颗粒是通过对中药玄参进行提取、浓缩、制粒所得。玄参为玄参科植物 Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，始载于《神农本草经》，玄参主要分布于东 北、华北与华东地区；具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，主要用于热病伤阴、舌绛烦渴、温毒 发斑、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、瘰疬、白喉、痈肿疮毒等的治疗。玄参主要含环烯醚 萜苷类、苯丙素苷类、芳香糖苷类等，其中环烯迷萜苷类主要含哈巴苷和哈巴俄苷等活性指 标成分。
[0003] 《中国药典》2015年版对玄参的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含 量测定等项目，文献也对玄参中化学成分进行阐述，包括含有哈巴苷和哈巴俄苷等环烯迷 萜苷类和苯丙素苷类、芳香糖苷类等成分，但是对于玄参配方颗粒这样有效成分类型多、组 分复杂的中药制剂，仅测定某类成分的含量，难以客观、有效地评价或控制药材的质量。
[0004] 然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别玄参配方颗粒，不能从整体上 检测和控制其质量；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别玄参配方颗 粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。
[0005] 因此，建立一种能够全面地、快速地检测玄参配方颗粒的方法，对于其全面质量检 测和整体质量控制具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明所要解决的是现有的玄参配方颗粒的检测方法单一检测指标不能从 整体上检测和控制其质量、多个检测指标联合检测费时、费力，难以广泛地应用于生产实践 的技术问题，从而提出一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明提供一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，该方法包括如下步骤：
[0009] (1)取待测玄参的药物制剂0.4-0.6重量份，精密称定，精密加入40~60%甲醇水 溶液40-60体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，取40 ~60%甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
[0010] (2)精密称取哈巴苷对照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004-0.00008重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
[0011] 精密称取哈巴俄苷对照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.00001-0.00003重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
[0012] 精密称取肉桂酸对照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.00001 -0.00003重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
[0013] (3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05%的 磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱:0-10min，A:B为5% : 95% : 92% ; 10-20min，A:B为8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B为27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B为35% :65% - 100% :0% ;检测波长为210nm(0~18min)和278nm(18~45min); 柱温为25°C，流速为lmL/min;
[0014] (4)分别精密吸取供试品溶液供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和对照品 C溶液0.010-0.020体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液 和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
[0015] (5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照 品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹 配，即得指纹图谱；
[0016] 所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
[0017] 优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，该方法包括如下步 骤：
[0018] (1)取待测玄参的药物制剂0.5重量份，精密称定，精密加入50%甲醇水溶液50体 积份，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取50%甲醇水溶液补 足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
[0019] (2)精密称取哈巴苷对照品，加50%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00006重量份 的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
[0020] 精密称取哈巴俄苷对照品，加50%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002重量份的 溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
[0021] 精密称取肉桂酸对照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002重量份 的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
[0022] (3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05%的 磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱:0-10min，A:B为5% : 95% : 92% ; 10-20min，A:B为8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B为27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B为35%:65% - 100%:0%;检测波长为210nm(0~18min)和278nm (18~45min); 柱温为25°C，流速为lmL/min;
[0023] (4)分别精密吸取供试品溶液供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和对照品 C溶液0.015体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液和、对照 品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
[0024] (5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照 品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹 配，即得指纹图谱。
[0025] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，以4.6mm X 250mm、5ym的Agilent Zorbax SB-C18、4·6mmX250mm、5ym的Diamonsil C18或4.6mmX 250mm、5μπι的Shim-pack VP-0DS为色谱柱。
[0026] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，所述药物制 剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂 或注射制剂。
[0027] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，所述玄参的 药物制剂通过以下方法制备而成：
[0028] 取玄参，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少0.5h，过 滤，合并滤液，滤液浓缩至60 °C相对密度为1.10~1.15，加入常规辅料，按照常规工艺，制成 临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口 服液体制剂或注射制剂。
[0029] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，所述玄参的 药物制剂通过以下方法制备而成：
[0030] 取玄参，加热回流提取1~5次，每次加入4~10重量倍量的水提取0.5~3 . Oh，过 滤，合并滤液，滤液浓缩至60 °C相对密度为1.10~1.15，加入常规辅料，按照常规工艺，制成 临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口 服液体制剂或注射制剂。
[0031] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，所述玄参的 药物制剂通过以下方法制备而成：
[0032] 取玄参，加热回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取2. Oh，第2次加入6重量 倍量的水提取1.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60°C相对密度为1.10~1.15,加入常规辅 料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、 速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
[0033] 所述药学上可接受的辅料为:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫 味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、 蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石 粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素 等;粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯 帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、 苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000、 PEG4000、虫蜡等。
[0034] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，所述玄参的 药物制剂的指纹图谱中，共有特征峰为:S峰哈巴俄苷、1号峰哈巴苷、2号峰和3号峰肉桂酸， 以S峰哈巴俄苷为内参考峰，各峰号相对保留时间分别为：1号峰0.22~0.26、2号峰0.75~ 0.89、S峰 1.00 和 3号峰 1.06~1.24。
[0035] 进一步优选地，本发明上述建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，所述玄参的 药物制剂的指纹图谱中，各峰号相对保留时间分别为：1号峰〇.24、2号峰0.82、5峰1.00和3 号峰1.15。
[0036] 本发明还提供上述方法在玄参的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。
[0037] 与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有以下优点：
[0038] 本发明所述玄参的药物制剂的指纹图谱的检测方法，以玄参配方颗粒为检测对 象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特 征峰S峰哈巴俄苷、1号峰哈巴苷、2号峰和3号峰肉桂酸，选择S峰哈巴俄苷，确定了玄参配方 颗粒的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、 快速地检测其质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用 的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
【附图说明】
[0039] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0040] 图1是本发明实验例1中不同的检测波长的色谱图，峰1是哈巴苷，S峰是哈巴俄苷， 色谱图1、2的检测波长为210nm+280nm，色谱图3、4的检测波长为为210nm+278nm;
[00411图2是本发明实验例1中不同流动相的色谱图，A:乙腈-0.03 %磷酸溶液;B:乙腈-0.04 %磷酸溶液；C:乙腈-0.05 %磷酸溶液；D:乙腈-0.06 %磷酸溶液；
[0042 ]图3是本发明实验例1中不同梯度洗脱程序的色谱图，A:梯度1; B:梯度2; C:梯度3;
[0043] 图4是本发明实验例1中不同色谱柱的色谱图，I :Agilent Zorbax SB-C18 5μηι， 4.6mmX250mm PN: 880975-902 ; Π : Diamonsi 1 (钻石）C18 (2 )5μηι 4.6mmX250mm Ser# 201042495 ;m: Shim-pack VP-ODS 5μπι4· 6mm X 250mm S/N 07111129484;
[0044] 图5是本发明实验例1中不同流速的色谱图，A: 0.8mL/min; B: 1. OmL/min; C: 1.2mL/ min；
[0045] 图6是本发明实验例1中不同柱温的色谱图，A: 25 °C ; B: 30 °C ; C: 35 °C ;
[0046] 图7是本发明实验例3中18批玄参配方颗粒的特征指纹图谱；
[0047] 图8是本发明实验例3中玄参配方颗粒的对照特征指纹图谱；
[0048] 图9是本发明实验例4中重复性实验结果；
[0049] 图10是本发明实验例4中精密度实验结果；
[0050] 图11是本发明实验例4中专属性实验结果，A:供试品;B:阴性对照品；
[0051 ]图12是本发明实验例4中溶液稳定性实验结果。
【具体实施方式】
[0052] 实施例1
[0053] 以下实施例和实验例中，玄参配方颗粒的制备方法为:取玄参，加热回流提取2次， 第1次加入8重量倍量的水提取2. Oh，第2次加入6重量倍量的水提取1.5h，过滤，合并滤液， 滤液浓缩至60°C相对密度为1.10~1.15，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
[0054] 实施例2
[0055] 本实施例建立玄参配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
[0056] (1)取待测玄参的药物制剂0.5g，精密称定，精密加入50%甲醇水溶液50mL，称定 重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取50 %甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤， 取续滤液，作为供试品溶液；
[0057] (2)精密称取哈巴苷对照品，加50%甲醇水溶液制成每lmL含0.00006g的溶液，摇 匀，作为对照品A溶液；
[0058] 精密称取哈巴俄苷对照品，加50%甲醇水溶液制成每111^含0.000028的溶液，摇 匀，作为对照品B溶液；
[0059] 精密称取肉桂酸对照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002重量份 的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
[0060] (3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.05%的磷酸溶液为流动相財安照 如下程序进行梯度洗脱:〇-l〇min，A:B为5% :95%-8% :92% ;10-20min，A:B为8% :92% - 22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25-30min，A:B为27.5% :72.5% - 28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40-45min，A:B为35% :65% - 100% :0% ;检测波长为210nm(0~18min)和278nm(18~45min);柱温为25°C，流速为lmL/ min；
[0061 ] (4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液0.015 体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和对 照品C溶液的液相色谱；
[0062] (5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照 品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹 配，即得指纹图谱。
[0063] 实施例3
[0064] 本实施例建立玄参配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
[0065] (1)取待测玄参的药物制剂0.4g，精密称定，精密加入40%甲醇水溶液60mL，称定 重量，超声提取20分钟，放冷，再称定重量，取40 %甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤， 取续滤液，作为供试品溶液；
[0066] (2)精密称取哈巴苷对照品，加40%甲醇水溶液制成每lmL含0.00004g的溶液，摇 匀，作为对照品A溶液；
[0067] 精密称取哈巴俄苷对照品，加40 %甲醇水溶液制成每lmL含0 . OOOOlg的溶液，摇 匀，作为对照品B溶液；
[0068] 精密称取肉桂酸对照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00001重量份 的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
[0069] (3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.05%的磷酸溶液为流动相財安照 如下程序进行梯度洗脱:〇-l〇min，A:B为5% :95%-8% :92% ;10-20min，A:B为8% :92% - 22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25-30min，A:B为27.5% :72.5% - 28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40-45min，A:B为35% :65% - 100% :0% ;检测波长为210nm(0~18min)和278nm(18~45min);柱温为25°C，流速为lmL/ min；
[0070] (4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液 0.010mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和 对照品C溶液的液相色谱；
[0071] (5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照 品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹 配，即得指纹图谱。
[0072] 实施例4
[0073] 本实施例建立玄参配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
[0074] (1)取待测玄参的药物制剂0.6g，精密称定，精密加入60%甲醇水溶液40mL，称定 重量，超声提取40分钟，放冷，再称定重量，取60 %甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤， 取续滤液，作为供试品溶液；
[0075] (2)精密称取哈巴苷对照品，加60%甲醇水溶液制成每lmL含0.00008g的溶液，摇 匀，作为对照品A溶液；
[0076] 精密称取哈巴俄苷对照品，加60%甲醇水溶液制成每111^含0.000038的溶液，摇 匀，作为对照品B溶液；
[0077] 精密称取肉桂酸对照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00003重量份 的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
[0078] (3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.05%的磷酸溶液为流动相財安照 如下程序进行梯度洗脱:〇-l〇min，A:B为5% :95%-8% :92% ;10-20min，A:B为8% :92% - 22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25-30min，A:B为27.5% :72.5% - 28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40-45min，A:B为35% :65% - 100% :0% ;检测波长为210nm(0~18min)和278nm(18~45min);柱温为25°C，流速为lmL/ min；
[0079] (4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液 0.020mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液和、对照品B溶液和 对照品C溶液的液相色谱；
[0080] (5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照 品A溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹 配，即得指纹图谱。
[0081 ] 实验例
[0082] 1、仪器与试药
[0083] 仪器包括:U11iMate 3000色谱系统，包括LPG-3400A四元栗、WPS-3000TSL自动进 样器、PDA二极管阵列检测器、色谱工作站；
[0084] 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18 5μπι 4.6mmX250mm PN:880975-902;天平：十万 分之一天平（METTLER TOLEDO(瑞士梅特勒）XS-205)，十万分之一天平(METTLER TOLEDO (瑞士梅特勒)XP-56);超声波发生器：（SK5200H上海科导超声仪器有限公司）；超纯水系统： 美国Millipore(密理博)公司。
[0085]试剂和试药包括：乙腈为色谱纯(赛默飞世尔科技（中国）有限公司），水为超纯水 (电阻率18.2πιΩ .cm)，其他试剂均为分析纯；玄参配方颗粒(序号1-18)由华润三九医药股 份有限公司提供，按照实施例1的制备方法制备而成。
[0086]实验例1色谱分析条件的确定
[0087] (1)检测波长的选择
[0088] 分别选用双波长(210+278nm)和双波长(210+280nm)对玄参配方颗粒进行检测，不 同的检测波长的色谱图如图1所示，其保留时间如表1所示。
[0089]表1不同检测波长下各峰的保留时间
[0091] 由表1和图1可知，结合文献报道，峰3为肉桂酸色谱峰，故玄参配方颗粒特征图谱 检测波长选用双波长(210+278nm) 〇
[0092] (2)流动相的选择
[0093] 考察乙腈-0.03 %磷酸溶液、乙腈-0.04 %磷酸溶液、乙腈-0.05 %磷酸溶液、乙腈-0.06%磷酸溶液等不同流动相系统，不同流动相的色谱图如图2所示。由图2可知，乙腈_ 0.05%磷酸溶液对玄参配方颗粒的各成分分离效果较好，故流动相系统确定采用乙腈-0.05 %磷酸溶液。
[0094] (3)梯度的选择
[0095]配方颗粒所含成分复杂，等度洗脱很难分离，故采用梯度洗脱方式。在实验过程中 采用了多个不同的洗脱梯度对同一份玄参配方颗粒提取样品进行测定，通过比较不同洗脱 程序所测定的样品色谱图，从中优选色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度高，基线较平稳且 分析时间较为合理的梯度，不同的梯度洗脱程序如表2~4所示，不同梯度洗脱程序的色谱 图如图3所示。
[0096] 表2梯度1(A:乙腈;B:0.05%磷酸溶液)的洗脱程序
[0098] 表3梯度2(A:乙腈;B:0.05%磷酸溶液)的洗脱程序
[0100] 表4梯度3(A:乙腈;B:0.05%磷酸溶液)的洗脱程序
[0102 ]由表2~4和图3可知，梯度3比梯度1、2分离效果好，梯度3得到的色谱图峰形良好， 分离度高，分析时间较为合适，故确定梯度3为最终的流动相梯度。
[0103] (4)不同色谱柱的考察
[0104] 取同一份玄参配方颗粒样品的供试品溶液，分别以色谱柱I:Agilent Zorbax SB-C18 5ym 4.6mmX250mm批号：880975_902; Π :Diamonsil(钻石）C18(2)5ym 4.6mmX250mm 批号：Ser#201042495;m : Shim-pack VP-0DS5ym 4.6mm X 250mm批号：S/N 07111129484，
[0105] 按l.OmL/min的流速进行梯度洗脱分析，不同色谱柱的色谱图如图4所示，不同色 谱柱测定的共有峰的相对保留时间结果如表5所示。
[0106] 表5不同色谱柱测定的共有色谱峰系统适应性参数
[0108] 由图4和表5可知，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱对各个峰的分离度较好，且分析 时间较短，故选定色谱柱I作为色谱柱。
[0109] (5)不同流速的考察
[ΟΙ10] 取同一份玄参配方颗粒样品的供试品溶液，分别以0.8mL/min、1. OmL/min，1.2mL/ min等不同流速测定，不同流速的色谱图如图5所示，不同流速测定的共有峰的相对保留时 间结果如表6所不。
[0111]表6不同流速测定的共有色谱峰系统适应性参数
[0114] 由图5和表6可知，流速发生微小变化时各个共有峰的测定结果影响不大，从系统 适应性参数中可看出，流速为1 .OmL/min流速的色谱效果相对较好。
[0115] (6)不同柱温的选择
[0116] 取同一份玄参配方颗粒样品的供试品溶液，考察不同柱温25°C、30°C、35°C对本品 的分离效果，不同柱温的色谱图如图6所示，不同柱温测定的共有峰的相对保留时间结果如 表7所示。
[0117] 表7不同柱温测定的共有峰的系统适应性参数
[0119]由图6和表7可知，柱温发生变化时各色谱峰分离效果相近，表明柱温发生变化对 测定结果影响较小。考虑到固定柱温能使测定环境更加稳定，因此选定接近常温的柱温25 °C作为本方法的测定温度。
[0120] (7)最终色谱条件
[0121] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相 B，按表8进行梯度洗脱;流速1. OmL/min，柱温25°C ;检测波长:前18min为210nm，之后换为 278nm。理论塔板数按哈巴俄苷计算应不低于5000。
[0122] 表8梯度洗脱程序
[0124] 实验例2供试品溶液的制备
[0125] 精密称取玄参配方颗粒(批号1306001S)5组，每组平行2份，每份0.5g，分别精密加 入50mL的水、30 %甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、100 %甲醇，超声提取30min。放冷后补足减失 的溶剂至原重量，摇匀，滤过，取续滤液以〇. 45μπι微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。分别 吸取各供试液l〇yL，注入液相色谱仪，测定哈巴苷与哈巴俄苷的峰面积积分值。玄参配方颗 粒不同提取条件下哈巴苷与哈巴俄苷峰面积积分值如表9所示。
[0126] 表9玄参配方颗粒不同提取条件下哈巴苷与哈巴俄苷峰面积积分值
[0128] 由表9可知，以出0、30%]\^0!1、50%]\^0!1、70%]\^0!1为提取溶剂，哈巴苷、哈巴俄苷 峰面积相差不大，其中以50 %MeOH为提取溶剂峰面积相对较高，故选择50 %MeOH为提取溶 剂。结合《中国药典》2010年版一部玄参【含量测定】供试品的制备条件，因配方颗粒经提取 后的物质较药材更易溶解，提取方式为超声提取，时间为30min。
[0129] 实验例3玄参配方颗粒特征指纹图谱的建立
[0130]参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的 "中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版"软件，通过对所得指纹图谱的进行相似度比 较(以平均数建立参照特征指纹图谱），并进行方法学考察。
[0131]根据实验例1和2,确定玄参配方颗粒HPLC特征图谱按如下方法建立：
[0132] (1)取玄参配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 50 %甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz) 30min，放冷，再称定重量， 用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0133] (2)高效液相色谱条件：以Agi lent Zorbax SB-C18 5μηι、4 · 6mm X 250mm(PN: 880975-902)为色谱柱；以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，按表8进行梯度洗 脱;流速1.0mL/min，柱温25°C;检测波长:前18min为210nm，之后换为278nm。理论塔板数按 哈巴俄苷计算应不低于5000。进样量:10yL。
[0134]表8梯度洗脱程序
[0136] 按上述方法进行玄参配方颗粒特征图谱的共有模式的建立。
[0137] 取18个批次的玄参配方颗粒样品作为供试品溶液，通过高效液相色谱得到玄参配 方颗粒特征图谱，18批玄参配方颗粒的特征图谱(S1~S18依次为批号A1301044、A1301045、 A1300816、1305369、1305370、1305371、G1306007、G1306008、G1306009、130701、130702、 130703、1303100、1303112、1303124、1306001S、1306002S、1306003S 的玄参配方颗粒的图 谱)如图7所示，采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件"中药色谱指纹图谱相似 度评价系统2012版"，生成的对照特征指纹图谱如图8所示，对配方颗粒特征图的检测结果 进行分析、比较，选取其中的哈巴俄苷作为参照峰(S峰），计算各特征峰与S峰的相对保留时 间规定值，所得结果如表1 〇~12所示。
[0138] 表10玄参配方颗粒对照特征指纹图谱相对保留时间
[0140]表12 18批玄参配方颗粒相似度结果
[0142] 由表10~12和图7~8所示，各批与对照特征指纹图谱的相似度均在0.90以上。
[0143] 实验例4玄参配方颗粒特征指纹图谱方法学验证
[0144] 4.1精密度
[0145] 4丄1重复性实验
[0146] 取同一批号供试品（批号1306001S)6份，按实验例3的条件分别测定4个共有峰的 相对保留时间，相对保留时间结果如表13所示，相似度结果如表14所示，色谱图如图10所 不。
[0147] 由表13~14和图10可知，1~3号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为 0.12%、0.04%、0.04%，相似度分别为1.00;这表明本方法的重复性较好。
[0148] 表13重复性实验结果
[0151]表14重复性实验相似度结果
[0153] 4.1.2精密度实验
[0154] 取同一份供试品溶液(批号1306001S)，按实验例3的色谱条件，重复进样6次，测定 4个共有峰的相对保留时间，相对保留时间结果如表15所示，相似度结果如见表16所示，色 谱图如图10所示。
[0155] 表15精密度实验结果
[0157]表16精密度实验相似度结果
[0159] 由表15~16和图10可知，1~3号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为 0.12%、0.03%、0.03%，相似度分别为1.00,这表明精密度较好。
[0160] 4.2专属性
[0161] 本品为玄参饮片的单方颗粒，供试品的提取溶剂为50%甲醇，故精密吸取供试品 溶液、阴性对照溶液各10yL，分别注入高效液相色谱仪，按实验例3的色谱条件测定，结果如 图11所不。由图11可知，结果阴性无干扰。
[0162] 4.3耐用性
[0163] 溶液稳定性实验
[0164] 取同一批号供试品(批号1306001S)，自制备后，按实验例3的色谱条件分别在0、2、 4、6、12、14、16、18、20、22、24小时进样，测定4个共有峰的相对保留时间，相对保留时间结果 如表17所示，相似度结果如表18所示，色谱图如图12所示。
[0165] 表17溶液稳定性实验结果
[0168] 表18稳定性实验相似度结果
[0169]
[0170] 由表17~18和图12可知，1~3号峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD分别为 0.21 %、0.02%、0.05%，相似度分别为1.00;这表明本发明的供试品制备方法所制得的供 试品溶液在24小时内稳定，相似度较好。
[0171]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： (1) 取待测玄参的药物制剂0.4-0.6重量份，精密称定，精密加入40~60%甲醇水溶液 40-60体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，取40~ 60%甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液； (2) 精密称取哈巴苷对照品，加4 0~6 0 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.0 0 0 0 4 - 0.00008重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液； 精密称取哈巴俄苷对照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.00001-0.00003 重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液； 精密称取肉桂酸对照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.00001 -0.00003重 量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液； (3) 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05%的磷酸 溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-10min，A:B为5% :95%-8% :92% ; 10-20min，A:B为8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B为27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B为35% :65% - 100% :0% ;检测波长为210nm(0~18min)和278nm(18~45min); 柱温为25°C，流速为lmL/min; (4) 分别精密吸取供试品溶液供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液 0.010-0.020体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液和、对照 品B溶液和对照品C溶液的液相色谱； (5) 利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A 溶液、对照品B溶液对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得 指纹图谱； 所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。2. 根据权利要求1所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于， 该方法包括如下步骤： (1) 取待测玄参的药物制剂0.5重量份，精密称定，精密加入50 %甲醇水溶液50体积份， 称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取50 %甲醇水溶液补足减 失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液； (2) 精密称取哈巴苷对照品，加50%甲醇水溶液制成每1体积份含0.00006重量份的溶 液，摇匀，作为对照品A溶液； 精密称取哈巴俄苷对照品，加50 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002重量份的溶 液，摇匀，作为对照品B溶液； 精密称取肉桂酸对照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002重量份的溶 液，摇匀，作为对照品C溶液； (3) 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05%的磷酸 溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-10min，A:B为5% :95%-8% :92% ; 10-20min，A:B为8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B为22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B为27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B为28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B为35% :65% - 100% :0% ;检测波长为210nm(0~18min)和278nm(18~45min); 柱温为25°C，流速为lmL/min; (4) 分别精密吸取供试品溶液供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液 〇. 〇 15体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液 和对照品C溶液的液相色谱； (5) 利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A 溶液和、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配， 即得指纹图谱。3. 根据权利要求1或2所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，以 4.6mmX250mm、5ym的Agilent Zorbax SB-C18、4·6mmX250mm、5ym的Diamonsil C18或 4 · 6mm X 250mm、5μηι的Shim-pack VP-ODS为色谱柱。4. 根据权利要求1-3任一项所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在 于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、 口服液体制剂或注射制剂。5. 根据权利要求1-4任一项所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在 于，所述玄参的药物制剂通过以下方法制备而成： 取玄参，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少0.5h，过滤，合 并滤液，滤液浓缩至60 °C相对密度为1.10~1.15，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床 上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液 体制剂或注射制剂。6. 根据权利要求5所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述玄 参的药物制剂通过以下方法制备而成： 取玄参，加热回流提取1~5次，每次加入4~10重量倍量的水提取0.5~3. Oh，过滤，合 并滤液，滤液浓缩至60 °C相对密度为1.10~1.15，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床 上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液 体制剂或注射制剂。7. 根据权利要求6所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述玄 参的药物制剂通过以下方法制备而成： 取玄参，加热回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取2. Oh，第2次加入6重量倍量 的水提取1.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60°C相对密度为1.10~1.15，加入常规辅料，按 照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制 剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。8. 根据权利要求1-7任一项所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在 于，所述玄参的药物制剂的指纹图谱中，共有特征峰为：S峰哈巴俄苷、1号峰哈巴苷、2号峰 和3号峰肉桂酸，以S峰哈巴俄苷为内参考峰，各峰号相对保留时间分别为：1号峰0.22~ 0.26、2号峰0.75~0.89、5峰1.00和3号峰1.06~1.24。9. 根据权利要求1-8任一项所述的建立玄参的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在 于，所述玄参的药物制剂的指纹图谱中，各峰号相对保留时间分别为：1号峰〇.24、2号峰 0.82、S峰 1.00 和 3 号峰 1.15。10. 权利要求1-9任一项所述的方法在玄参的药物制剂的质量检测和质量控制中的应
【文档编号】G01N30/88GK106093262SQ201610423663
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610423663.3, CN 106093262 A, CN 106093262A, CN 201610423663, CN-A-106093262, CN106093262 A, CN106093262A, CN201610423663, CN201610423663.3
【发明人】张辉, 郑晓英, 谭沛, 蔡少青, 马鹏岗
【申请人】华润三九医药股份有限公司