一种检测乳腺癌her2基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测乳腺癌HER2基因的方法，包括免疫组织化学染色法、荧光原位杂交法和双色银染原位杂交法；与现有技术相比，本发明能够快速检测判定乳腺癌HER2基因，为治疗乳腺癌的医疗技术奠定了基础，减轻患者的痛苦及提高患者生存率，具有推广使用的价值。
【专利说明】
一种检测乳腺癌HER2基因的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种生物检测方法，尤其涉及一种检测乳腺癌HER2基因的方法。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是危害人类健康甚至危及生命的常见恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升且年轻化趋势，在中国，乳腺癌已成为上升幅度最快的恶性肿瘤之一，严重威胁着患者的身心健康。随着现代分子免疫学、肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程学的深入研究，乳腺癌的研究已进入了一个新的分子水平阶段。筛检乳腺癌相关的细胞分子指标有助于预后分析并对选择肿瘤分子靶向治疗有积极意义，使治疗方案更为合理化、更为个体化。不断改进该领域实验方法对患者预后分析、指导用药特别是选择肿瘤分子靶向药物治疗Herceptin(赫赛汀)有重要意义，可有利于患者的个性化治疗，减轻患者的痛苦及提高患者生存率。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种检测乳腺癌HER2基因的方法。
[0004]本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
[0005]本发明包括免疫组织化学染色法、荧光原位杂交法和双色银染原位杂交法；
[0006]所述免疫组织化学染色法包括以下步骤:
[0007]石蜡切片脱蜡入水后，放入乙二胺四乙酸二钠认修复液在高压锅内抗原修复，再经PBS液冲洗后，3 ^H2O21min，PBS液冲洗后加入一抗4 °C过夜，复苏I小时，PBS液冲洗，加入二抗37 0C 40m in，PBS液冲洗后，加入DAB显色液，镜下观察信号并适时终止显色，苏木精复染，脱水、透明、封片；
[0008]所述荧光原位杂交法包括以下步骤:
[0009]石蜡切片4μπι厚，常规脱蜡，甲醇中浸泡5min后空气干燥，0.03 ^H2O2和85 %甲酸混合液中避光20min，用0.01mol/L HCL洗3min，将切片置于0.01mol/L HCL，系列70%—90%
—100%梯度脱水各3min后空气干燥15min，于聚丙烯睛液80°C预热，用0.0lmol/L HCL洗涤，酸性乙醇系列脱水后晾干，加蛋白酶工作液37°C预热1min，用0.01mol/L HCL洗1min，酸性乙醇系列脱水后晾干，加固定液，7 %甲醛PBS15min冲洗，蒸馏水冲洗5min，中性乙醇梯度脱水各3min后晾干，加1ui探针，加盖玻片;80 °C变性5min，杂交过夜16小时以上，PBS泡掉盖玻片，在421^&11￥&通洗液中孵育21^11，？85冲洗，经中性乙醇梯度脱水后避光干燥151^11，加二眯基苯基吲哚封片，荧光显微镜观察结果；
[0010]所述双色银染原位杂交法包括以下步骤:
[0011 ] (I)组织蜡块切片:厚度设置为，连续切片；
[0012](2)烤片:将载波片置于供烤约小时，至蜡融；
[0013](3)将切片放入牛奶中浸泡10-15min;
[0014](4)将处理好的切片放入全自动切片染色机上进行。
[0015]本发明的有益效果在于:
[0016]本发明是一种检测乳腺癌HER2基因的方法，与现有技术相比，本发明能够快速检测判定乳腺癌HER2基因，为治疗乳腺癌的医疗技术奠定了基础，减轻患者的痛苦及提高患者生存率，具有推广使用的价值。
【具体实施方式】
[0017]下面对本发明作进一步说明:
[0018]本发明包括免疫组织化学染色法、荧光原位杂交法和双色银染原位杂交法；
[0019]所述免疫组织化学染色法包括以下步骤:
[0020]石蜡切片脱蜡入水后，放入乙二胺四乙酸二钠认修复液在高压锅内抗原修复，再经PBS液冲洗后，3 ^H2O21min，PBS液冲洗后加入一抗4 °C过夜，复苏I小时，PBS液冲洗，加入二抗37 0C 40m in，PBS液冲洗后，加入DAB显色液，镜下观察信号并适时终止显色，苏木精复染，脱水、透明、封片；
[0021]结果:光镜下以细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性;O:无染色或<10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1 +:>10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色;2+:有两种情况，第一种为>10 %的浸润癌细胞呈现不完整和/或弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为<10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色;3+:>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。
[0022]所述荧光原位杂交法包括以下步骤:
[0023]石蜡切片4μπι厚，常规脱蜡，甲醇中浸泡5min后空气干燥，0.03^H2O2和85 %甲酸混合液中避光20min，用0.01mol/L HCL洗3min，将切片置于0.01mol/L HCL，系列70%—90%
—100%梯度脱水各3min后空气干燥15min，于聚丙烯睛液80°C预热，用0.0lmol/L HCL洗涤，酸性乙醇系列脱水后晾干，加蛋白酶工作液37°C预热1min，用0.01mol/L HCL洗1min，酸性乙醇系列脱水后晾干，加固定液，7 %甲醛PBS15min冲洗，蒸馏水冲洗5min，中性乙醇梯度脱水各3min后晾干，加1ui探针，加盖玻片;80 °C变性5min，杂交过夜16小时以上，PBS泡掉盖玻片，在421^&11￥&通洗液中孵育21^11，？85冲洗，经中性乙醇梯度脱水后避光干燥151^11，加二眯基苯基吲哚封片，荧光显微镜观察结果；
[0024]结果:应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号。在观察信号时，应根据情况随时调节显微镜的焦距，准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏。
[0025](I)当 HER2/CEP17比值彡 2.0时，为 HER2阳性;HER2/CEP17比值〈2.0，但平均 HER2 拷贝数/细胞彡6.0时也为HER2阳性。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的1 %以上。需要注意的是对于HER2/CEP17比值彡2.0，但平均HER2拷贝数/细胞〈4.0的病例是否应该视为ISH阳性目前尚存一定争议。
[0026](2)HER2/CEP17比值〈2.0且平均HER2拷贝数/细胞〈2.0时为HER2阴性。
[0027](3)HER2/CEP17比值〈2.0且平均HER2拷贝数/细胞〈6.0，但i>4.0时为HER2ISH结果不确定。单探针ISH:肿瘤细胞平均HEt/2拷贝数/细胞〈4.0为无扩增；肿瘤细胞平均HER2拷贝数/细胞多6.0为扩增。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10%以上。平均HER拷贝数/细胞在4?6之间为不确定。若众多HER2信号连接成簇时可不计数，直接视为基因扩增。对于ISH结果不确定的病例.需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。
[0028]所述双色银染原位杂交法包括以下步骤:
[0029](I)组织蜡块切片:厚度设置为，连续切片；
[0030](2)烤片:将载波片置于供烤约小时，至蜡融；
[0031](3)将切片放入牛奶中浸泡10-15min;
[0032](4)将处理好的切片放入全自动切片染色机上进行。
[0033]结果:DSISH:HER-2基因与CEP17分别为黑色及红色信号，选择细胞核及信号均清晰的浸润癌细胞，首先观察是否存在HER-2的异质性。连续计数20个细胞信号，HER-2/CEP17彡2.0为HER-2有扩增；
[0034]HER-2/CEP17 <2.0，平均HER-2拷贝数/细胞数彡6.0，也视为HER-2扩增；HER-2/CEP17 < 2.0，且平均HER-2拷贝数/细胞数< 4.0时，视为HER-2无扩增;HER-2/CEP17 <2.0，且平均HER-2拷贝数/细胞数<6.0，但彡4.0，视为结果不确定，再计数20个细胞。CEP17拷贝数/细胞数多3为17号染色体多倍体。
[0035]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种检测乳腺癌HER2基因的方法，其特征在于:包括免疫组织化学染色法、荧光原位杂交法和双色银染原位杂交法； 所述免疫组织化学染色法包括以下步骤: 石蜡切片脱蜡入水后，放入乙二胺四乙酸二钠认修复液在高压锅内抗原修复，再经PBS液冲洗后，3%H2 O2 1min，PBS液冲洗后加入一抗4°C过夜，复苏I小时，PBS液冲洗，加入二抗37 °C40min JBS液冲洗后，加入DAB显色液，镜下观察信号并适时终止显色，苏木精复染，脱水、透明、封片； 所述荧光原位杂交法包括以下步骤: 石錯切片4μηι厚，常规脱錯，甲醇中浸泡5min后空气干燥，0.03%? O2和85%甲酸混合液中避光20min，用0.01mol/L HCL洗3min，将切片置于0.01mol/L HCL，系列—100%梯度脱水各3min后空气干燥15min，于聚丙烯睛液80°C预热，用0.01mol/L HCL洗涤，酸性乙醇系列脱水后晾干，加蛋白酶工作液37°C预热lOmin，用0.0lmol/L HCL洗1min^I性乙醇系列脱水后晾干，加固定液，7%甲醛PBS15min冲洗，蒸馏水冲洗5min，中性乙醇梯度脱水各3min后晾干，加10μ1探针，加盖玻片;80 °C变性5min，杂交过夜16小时以上，I3BS泡掉盖玻片，在421^&11￥&通洗液中孵育21^11，？85冲洗，经中性乙醇梯度脱水后避光干燥151^11，加二眯基苯基吲哚封片，荧光显微镜观察结果； 所述双色银染原位杂交法包括以下步骤: (1)组织蜡块切片:厚度设置为，连续切片； (2)烤片:将载波片置于供烤约小时，至蜡融； (3)将切片放入牛奶中浸泡10-15min; (4)将处理好的切片放入全自动切片染色机上进行。
【文档编号】G01N33/574GK106093395SQ201610403492
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】杨义, 广茜茜, 耿春芳
【申请人】兖矿集团有限公司总医院