同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的新方法
【专利摘要】本发明公开了同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的新方法，（1）制备鉴定芯片；（2）将待鉴定溶液注入到步骤（1）中鉴定芯片的检测位点内，待鉴定溶液中的抗体分子与所述鉴定芯片上的抗原分子特异性结合，导致芯片的检测位点表面的分子膜层的厚度或密度发生变化；然后进行冲洗；（3）采用椭偏显微成像仪检测步骤（2）中的所述变化，由此判定待鉴定溶液中是否包含弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒以及获得它们的抗体含量。该方法可以快速、准确同时定性和定量检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒。
【专利说明】
同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的新方法
技术领域
[0001] 本发明属于检测鉴定技术领域，具体涉及同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹 病毒的新方法。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是专性细胞内寄生虫，球虫亚纲，真球虫目，等孢子球虫科、弓形体属。该虫 呈世界性分布，人和许多动物都能感染，可寄生在除红细胞外的所有有核细胞中，随血液流 动，到达全身各部位，损伤大脑、心脏、眼底，致使机体免疫力下降，患各种疾病。人体感染后 多处于隐性感染状态，只有当机体免疫力低下时，虫体被激活并迅速增殖，致病力增强。由 于Τ0Χ对人类健康造成了很大的威胁，对这种疾病的临床感染诊断的时效性、精确性的要求 也越来越高。
[0003] 风疹是由风疹病毒引起的一种急性呼吸道传染病。主要通过呼吸道和直接接触传 播。其临床特征为上呼吸道轻度炎症、发热、全身红色斑丘疹、耳后、枕后及颈部淋巴结肿 大，病情较轻，预后良好。孕妇在怀孕早期感染风疹，易导致胎儿发生先天性风疹综合症。风 疹病毒为RNA病毒，属于披盖病毒属。风疹病毒抗原结构稳定，只有一种抗原型，只感染人 类。
[0004] 单纯疱疼病毒(herpes simplex virus，HSV)是属于疱疼病毒科a病毒亚科的线性 双链DNA病毒。HSV能引起人类多种疾病，如龈口炎（gingivostomatitis)、角膜结膜炎 (keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。在感 染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中维持传 播链，周而复始地循环。根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。1型主要由口唇病 灶获得，2型可从生殖器病灶分离到。人群被病毒感染发生后四个月到数年被感染的人数可 达人口总数的50-90 %，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。此病可分为 口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹和卡波西病等。
[0005] 在弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹感染的实验室诊断中，PCR技术是目前实验诊断这 三种病毒感染的金标准，但一般实验室很难做到严格的质量控制，因而其临床推广受到一 定的限制。ELISA是目前最常用的方法，但是实验的假阳性率高。
[0006] 生物芯片是20世纪90年代发展起来的一种新的技术平台，具有集成化、高通量、高 密度的优势。根据固相载体上固定的生物分子的不同，可以将生物芯片划分为DAN芯片、蛋 白质芯片等。随着研究的进一步深入，蛋白质芯片已广泛应用于许多研究领域。蛋白质芯片 运用于医学检验，则是结合了微阵列的高通量、集成化和免疫检测的灵敏、特异的特点可以 方便、快速，并且准确地大批量、平行检测多样本、多项目。
[0007] 目前传统的蛋白质芯片技术在检测上以荧光标记方法为主。但是，蛋白质分子标 记常常可能导致以下几方面的问题。首先，蛋白质分子的化学不均一性，使得标记方法很难 用于定量分析。因为化学不均一性使得一些蛋白质分子的标记效果优于另外一些蛋白质分 子，即导致标记的不均一性，在缺少精确矫正的情况下，蛋白质芯片上荧光绝对强度是没有 统计学意义的。其次，实验需要严格控制标记条件，并且为每一种蛋白质分子建立矫正曲 线。最后，标记蛋白质分子可能影响其生物活性。目前所使用的蛋白质检测技术，如酶联免 疫反应、放射性核素及蛋白芯片技术等都需要分子标记，而表面增强激光解吸/离子化飞行 时间质谱（SELDI - TOF-MS)技术和光学蛋白质芯片技术不需要分子标记，可以直接分析待 测样品，但是SELDI技术设备非常昂贵，阻碍了它的应用。
[0008] 基于现有技术，目前并没有报道可以同时检测或/鉴定以上三种病原体的生物蛋 白芯片，并且由于弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹三种病原体抗原之间具有较大的差异，使得 结合在同一芯片上具有较大的难度。
[0009] 椭偏光学显微成像技术是近几年发展起来的一项用于超薄膜检测的技术。该技术 的特点是厚度分辨率极高，能够达到O.lnm。研究表明，绝大部分蛋白质在固体表面上形成 的单分子饱和吸附膜层几何厚度在2~l〇nm的范围内，膜层是薄而透明的，在物理上，属于 超薄相位体。由于相位体不引起探测光波的幅值变化，即使用显微镜也难以观测。但是这种 技术效果的呈现前提是需要筛选合适的蛋白芯片以及合适的操作条件，否则即使应用椭偏 显微成像技术也无法得到较好的检测和/或鉴定效果。
[0010] 检测和/或鉴定临床样本中的病原体(细菌、酵母和其它真菌、寄生虫和病毒)的经 典方法包括培养该样本以扩大所存在病原体的数目，直到可观察的菌落生长，然后该菌落 生长可以通过标准的实验室检验鉴定和计数。为了准确地鉴定感染种类，医生必须依赖于 可能需要从3天(如在大多数细菌的情况下)到8周之间的任何长度的时间的培养结果。为了 准确地鉴定细菌的种类，该培养随后进行可能需要另外数天甚至数周时间的大范围生物化 学检验。大多数情况下，由于疾病的严重程度，使这一确定过程快速和准确完成是非常重要 的。在采用经典方法时，有可能会产生错误，这些错误有时导致对病原体的不明确的鉴定， 而因此导致对病原体错误的判断。
[0011] 因此，一种快速、简单、直接、高通量的具体方法并能同时检测和鉴定弓形虫、风疹 病毒和单纯疱疹病毒是迫切需要的。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是利用椭偏显微成像技术检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯 疱疹病毒的新方法。
[0013] 本发明采用的技术方案是：
[0014] 本发明的第一个目的是提供一种用于同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒 的方法，包括以下步骤：
[0015] (1)制备鉴定芯片：
[0016] 将羧基改性表面的硅片装配鉴定探针：在检测位点上分别装配弓形虫、风疹病毒 和单纯疱疹病毒的抗原，然后进行冲洗;再采用封闭试剂封闭所述检测位点，得到鉴定芯 片；
[0017] (2)实施鉴定：
[0018] 将待鉴定溶液注入到步骤（1)中鉴定芯片的检测位点内，所述注入速度为1.4~ 1.6μ1/π?η，待鉴定溶液中的抗体分子与所述鉴定芯片上的抗原分子特异性结合，导致芯片 的检测位点表面的分子膜层的厚度或密度发生变化;然后进行冲洗；
[0019] (3)读取芯片：
[0020] 采用椭偏显微成像仪检测步骤(2)中的所述变化，由此判定待鉴定溶液中是否含 有弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒以及获得它们的抗体含量。
[0021] 优选的，所述单纯疱疹病毒的类型为单纯疱疹病毒2型。
[0022] 步骤（1)中，羧基改性表面的硅片的制备：首先采用去离子水冲洗硅片，然后采用 氨基硅烷和浓硫酸的混合液浸泡冲洗后的硅片，再采用无水乙醇冲洗浸泡后的硅片，最后 采用饱和琥珀酸钠无水乙醇溶液浸泡冲洗后硅片，获得羧基改性表面的硅片。
[0023] 其中，所述氨基硅烷和浓硫酸的体积比为1: (2~4)，优选为1: 3,采用氨基硅烷和 浓硫酸的混合液的浸泡时间为20~40min，优选为30min。所述饱和琥珀酸钠无水乙醇溶液 的浸泡时间为1.5~3h，优选为2h。
[0024]经过大量实验验证和分析，本发明优先选用硅片作为鉴定基片，硅片具有表面平 整，光滑度好，可以进行各种表面化学修饰，使得最终的检测和/或鉴定效果更加优异。由于 硅片的表面对于检测和/或鉴定结果非常重要，经过大量实验，对多种改性表面进行筛选， 筛选出来蛋白吸附能力好、本底灰度均匀、对检测干扰弱的羧基化学表面作为检测表面，尤 其是与表面醛基改性的硅片相比，羧基改性的芯片表面反应表面细腻均匀，本底灰度值低， 对试验干扰少。
[0025] 在装配抗原(探针)之前，需要将表面羧基改性的硅片置于微流控检测膜片上，采 用微流控芯片加样系统进行点加探针。加样流速对检测和/鉴定效果具有一定的影响，不合 适的加样流速会导致检测和/或鉴定结果不准确。本发明优选的探针微流控加样流速为1.4 ~1.6μ1/η?η(更优选为 1.5μ1/η?η)。
[0026] 本发明优选三种被鉴定物质的抗原作为探针，该探针与硅片表面结合力较高。 [0027] 本发明优选探针浓度为0.08~0.12mg/mL。本发明的探针浓度0.08~0.12mg/ml的 时候，检测和/鉴定效果较好，并且增加探针浓度，敏感性没有明显提高，经过反复实验确 定，0. lmg/ml为最佳探针浓度。
[0028]为了尽可能排除非特异性吸附，需要选择好的封闭试剂。本发明试验了多种封闭 试剂，选择芯片表面非特异性吸附越少封闭效果越好，优选BSA为封闭试剂，其浓度优选为6 ~8mg/mL(更优选为7mg/mL)。
[0029] 采用40~60μ1 (优选为50yl)PBS进行冲洗，冲洗速度为8~12μ1/η?η，优选为10μ1/ min〇
[0030] 步骤(2)中，步骤(2)中，所述待鉴定溶液为体液、血液、细胞培养上清液等。
[0031] 待鉴定溶液的注入速度为1.4~1.6μ1/π?η，用量为10~12μ1。实验发现，待鉴定溶 液的点加速度在1.5μ1/π?η时，反应效果较好，探针和被鉴定物能够充分特异性结合，并且 被鉴定物1〇μ1即可以被鉴定到。
[0032] 采用40~60μ1 (优选为50yl)PBS进行冲洗，冲洗速度为8~12μ1/η?η，优选为10μ1/ min〇
[0033] 步骤(3)中，在采用椭偏显微成像仪鉴定之前，对鉴定芯片进行处理，处理方法为： 采用去离子水冲洗后氮气吹干。
[0034] 上述检测和/或鉴定方法属于非诊断目的检测和/或鉴定方法。
[0035]本发明的第二个目的是提供一种椭偏显微成像蛋白芯片，该芯片是由以下方法制 备得到：
[0036] 将羧基改性表面的硅片装配鉴定探针：在检测位点上分别装配弓形虫、风疹病毒 和单纯疱疹病毒的抗原，然后采用PBS进行冲洗;再采用封闭试剂封闭所述检测位点，得到 椭偏显微成像蛋白芯片。
[0037] 其中，羧基改性表面的硅片的制备:首先采用去离子水冲洗硅片，然后采用氨基硅 烷和浓硫酸的混合液浸泡冲洗后的硅片，再采用无水乙醇冲洗浸泡后的硅片，最后采用饱 和琥珀酸钠无水乙醇溶液浸泡冲洗后硅片，获得羧基改性表面的硅片。
[0038] 其中，所述氨基硅烷和浓硫酸的体积比为1: (2~4)，优选为1: 3,采用氨基硅烷和 浓硫酸的混合液的浸泡时间为20~40min，优选为30min。所述饱和琥珀酸钠无水乙醇溶液 的浸泡时间为1.5~3h，优选为2h。
[0039] 弓形虫亦称速殖体或滋养体，是细胞内寄生虫，呈新月形，大小为5~13μπι;风疹病 毒是单正链RNA病毒，属于披膜病毒科(togavirus)是限于人类的病毒，电镜下多呈不规则 球形，直径50~70nm的核心；单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒大小约为180nm 左右；由于三种病原体在结构上和大小上具有非常大的差异，在设计芯片的最困难的部分 是设计成弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒三种病毒的抗原同时固定在同一芯片上，从而 使的在同一芯片上检测或/和鉴定这三种病毒的抗体成为可能。
[0040] 本发明优先选用上述羧基改性制备方法制备得到羧基改性表面的硅片，使得三种 抗原可以同时结合在该羧基改性表面的硅片上。这在现有技术中是不存在或不存在相应的 技术启示得到使用该羧基改性方法得到硅片可以同时结合这三种抗原。
[0041] 该椭偏显微成像蛋白芯片与上述的一种同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病 毒的方法中的鉴定芯片相同，不再赘述。
[0042]本发明的第三个目的是提供一种椭偏显微成像蛋白芯片的制备方法，包括以下步 骤:将羧基改性表面的硅片装配鉴定探针:在检测位点上分别装配弓形虫、风疹病毒和单纯 疱疹病毒的抗原，然后采用PBS进行冲洗;再采用封闭试剂封闭所述检测位点，得到光学蛋 白质鉴定芯片。
[0043] 其中，羧基改性表面的硅片的制备:首先采用去离子水冲洗硅片，然后采用氨基硅 烷和浓硫酸的混合液浸泡冲洗后的硅片，再采用无水乙醇冲洗浸泡后的硅片，最后采用饱 和琥珀酸钠无水乙醇溶液浸泡冲洗后硅片，获得羧基改性表面的硅片。
[0044] 其中，所述氨基硅烷和浓硫酸的体积比为1: (2~4)，优选为1: 3,采用氨基硅烷和 浓硫酸的混合液的浸泡时间为20~40min，优选为30min。所述饱和琥珀酸钠无水乙醇溶液 的浸泡时间为1.5~2.5h，优选为2h。
[0045] 本发明的蛋白芯片的制备方法，直接在羧基改性表面的硅片上进行装配抗原，无 需将羧基改性表面的硅片进行激活等步骤之后再进行装配，同时也说明了本发明的蛋白芯 片的羧基改性的表面能同时较好的固定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒抗原。
[0046] 本发明的第四个目的是提供上述椭偏显微成像蛋白芯片在检测和/或鉴定弓形 虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒中的应用，以及提供在制备用于同时检测和/或鉴定弓形虫、 风疹病毒和单纯疱疹病毒的试剂盒的应用。应用方法如下：
[0047]将待鉴定溶液注入到所述椭偏显微成像蛋白芯片的检测位点内，待鉴定溶液中的 抗体分子与所述芯片上的抗原分子特异性结合;然后采用椭偏显微成像仪检测所述芯片上 各检测位点分子膜层的厚度变化，由此判定待鉴定溶液中是否包含弓形虫、风疹病毒和单 纯疱疹病毒以及获得它们的含量。
[0048] 本发明的第五个目的是提供一种用于同时检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单 纯疱疹病毒的试剂盒，该试剂盒包含所述蛋白芯片;进一步，该试剂盒还包括PBS缓冲液、去 离子水、阴性对照品：人免疫球蛋白G等。
[0049] 光学蛋白质芯片是利用椭偏光生物显微成像技术发展起来的蛋白质芯片，通过对 蛋白质芯片上分子膜层的表面密度分布及厚度变化对入射光波进行调制，使得反射光或透 射光的椭偏状态发生改变，通过CCD摄像导入计算机，在相应的物理模型和图像处理下可以 显示样品分子膜层的密度分布与厚度，以此推导出蛋白质的信息。
[0050] 基于椭偏显微成像技术的蛋白质芯片是利用抗原-抗体特异性结合的原理，将具 有生物活性的蛋白质分子，装配于固相光学抛光的硅片表面上，形成单分子膜层，即感应表 面。感应表面接触待鉴定的溶液，如果溶液中的蛋白质分子与芯片上的蛋白质分子之间存 在特异性结合，就会在芯片表面形成复合分子，此复合膜层的厚度就会显著增加。通过椭偏 光学显微成像技术可以高分辨率地观察到基片上膜层厚度的变化，从而可以判断溶液中是 否含有能够与感应表面上的蛋白质分子发生特异性结合的生物分子。
[0051] 椭偏光学显微成像技术是用偏振光波为探测光照射样品，样品会对入射光波进行 调制，使得反射光中载有样品的信息。在基底消光条件下，基片表面的生物分子膜层的厚度 (或表面密度）同反射光强的平方根成正比。光强用灰度值表示，膜层的厚度(或表面密度） 愈大，灰度值愈高。
[0052] 本发明的有益效果是：
[0053] (1)椭偏显微成像蛋白芯片具体以下优点：1)无需任何标记:直接测量抗原-抗体 特异性结合的复合物，不需要像酶联免疫反应和普通蛋白芯片等对生物分子作标记，不会 对生物活性产生影响等。2)直接检测和/鉴定样品:在临床检测和/或鉴定时，可以直接鉴定 待鉴定样品，不需对样品预处理，这样更符合大规模临床检测和/或鉴定需要等。现代化临 床医学检验既需要结果准确、操作方便快捷、标准统一，又需要可以批量生产、成本低廉。3) 鉴定速度快:电子图像采样具有快速摄取图像的能力，为生物分子动力学研究提供了可能。 4)在椭偏显微成像蛋白芯片的阵列中，每一个位点只需要加入μL量级的试剂和样本即可以 进行检验，相对于传统的酶联免疫等检查方法的ml量级的试剂和样本量，节约了数百倍的 试剂和样本需求，大大节省了检验成本。5)检测灵敏度高，可以达到0.005IU/mL，与现在应 用的传统化学发光的灵敏度无差异。
[0054] (3)进一步的，通过反复实验，筛选优化得到了检测和/或鉴定方法的工艺参数，使 得采用椭偏显微成像技术检测弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒具有较好的检测和/或鉴 定效果。本发明筛选出了蛋白吸附能力好、本底灰度均匀、对检测干扰弱的羧基化学表面为 检测表面，并筛选出了合适的PBS冲洗液和流速，以尽可能冲洗掉非特异性吸附而又保留了 特异性吸附；筛选出了合适的封闭试剂BSA及其浓度、用量和流速，以及待鉴定样品的用量、 流速;并且经过进一步的优化筛选，建立了套标准化检测和/或鉴定程序。一旦条件被标准 化，病原体的检测和/或鉴定是十分简单可靠的，且能够由半熟练人员（非专业检验人员)完 成。
[0055] (4)进一步的，在弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒鉴定中，看到两个对照点与芯 片本底灰度几乎相同，说明选取的封闭试剂能够后极好的封闭芯片表面，极好的减少了非 特异吸附。在阳性检测位点上，灰度均明显的高于隐性位点，SPSS统计学分析表明有显著差 异，说明利用此蛋白芯片可以鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒。在进一步所做的鉴定 单纯疱疹病毒反应蛋白的研究中，研究发现，不同浓度梯度的样品通过检测位点后，所显示 的灰度（即分子膜层的厚度)也呈现不同灰度梯度，SPSS软件统计学分析表明被鉴定样品浓 度与对应的检测位点的灰度威尔逊相关系数达9.53,并且呈明显的线性关系，这说明采用 本发明筛选得到的椭偏显微成像技术的微流控蛋白芯片可以定量检测。
[0056] (5)本发明中提供的试剂盒能够同时检测和/或鉴定待检测溶液中的弓形虫、风疹 病毒和单纯疱疹病毒，具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
【附图说明】
[0057] 图1是分别检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒标准品的所得图像。
[0058] 图2是联合检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒标准品的所得图像。
[0059] 图3是联合检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒阳性血清的所得图 像。
[0060] 图4是检测和/或鉴定不同浓度梯度风疹病毒抗体标准品所得图像。
[0061 ]图5检测和/或鉴定风疹病毒IgG抗体标准品校准曲线。
[0062]图6检测和/或鉴定风疹病毒抗体阳性血清芯片图。
[0063]图7应用椭偏光学芯片检测结果与酶联免疫检测结果对比柱状图。
【具体实施方式】
[0064]本发明中所用的实验材料如下：
[0065]椭偏显微成像仪（中科院力学研究所研制），微流控芯片加样系统（中科院力学所 制造），单晶娃片(洛阳单晶娃片厂）；人免疫球蛋白G(Human IgG)(Sigma)、多克隆羊抗人免 疫球蛋白G抗体（Sigma)、人类血清白蛋白（HSA) (Sigma)、氨基硅烷（Sigma)、戊二醛 (Sigma)、单纯疱疹病毒2型抗原(北京高达生物科技有限公司），风疹病毒抗原、弓形虫抗原 (北京弘博康生物科技有限公司），单纯疱疹病毒2型抗体、风疹病毒抗体、弓形虫抗体 (ABcam公司），PBS缓冲液(PH7.4)溶解配制各种实验用溶液及北京化学试剂厂生产的浓硫 酸等。
[0066] 实施例1
[0067] -种同时检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的方法，包括以下步 骤：
[0068] 1、硅片表面改性方式优化：
[0069] 本实施例采用了多种改性方法，现筛选两种改性方式方法进行优化，步骤如下：
[0070] 1.1硅片去离子水冲洗3遍，氨基硅烷lmL、浓硫酸3mL浸泡硅片半小时，PBS冲洗硅 片3遍，戊二醛lmL、PBS 3mL浸泡硅片1小时，获得表面呈醛基化学性状的芯片。
[0071] 1.2硅片去离子水冲洗3遍，氨基硅烷lmL、浓硫酸3mL浸泡硅片半小时，无水酒精冲 洗硅片3遍，加入饱和琥珀酸钠无水酒精溶液浸泡硅片2小时，获得表面具有羧基性状的芯 片。
[0072] 1.3分别检测两种不同性质的硅片表面的均匀程度和本底灰度的大小以及吸附蛋 白的强弱，选择出合适的化学表面。
[0073] 2、芯片探针筛选
[0074] 2.1探针种类的选择对三种目标检测物的探针，分别选取2类公司产品，点加到检 测位点上，然后粗测与标准品目标检测物的结合强弱，选出结合好的用作探针。
[0075] 单纯疱疹病毒2型抗原优选为北京高达生物科技有限公司的产品，风疹病毒抗原、 弓形虫抗原优选为北京弘博康生物科技有限公司的产品。
[0076] 2 · 2探针浓度优化把选择好的探针分别按浓度0 · 05mg/mL、0 · lmg/mL、0 · 2mg/mL等 浓度点加到检测位点上，检测各不同浓度的探针与被检测样品的结合程度，选择结合好的 浓度作为探针浓度。
[0077] 3、封闭方法优化
[0078] 3.1封闭试剂的选择为了尽可能排除非特异性吸附，需要选择好的封闭试剂。分别 试验了 BSA和HAS等多种试剂，封闭装配有探针的芯片后，从检测位点上加样lmg/mL的人免 疫球蛋白溶液，然后PBS冲洗，芯片表面非特异性吸附越少封闭效果越好，筛选为封闭剂。 [0079] 3.2封闭试剂浓度的选择把选择好的封闭试剂按浓度2mg/ml、5mg/ml、7mg/ml等分 别封闭芯片，选择非特异吸附最少得浓度作为封闭试剂的浓度。
[0080] 4、微流控加样速度的优化
[0081 ] 4.1目标物检测用量、微流控加样速度和PBS冲洗速度优化
[0082] 选择点加样品的速度为1以1/11^11、1.5以1/1^11、2以1//1^11，以及？83冲洗速度541/ min、10yl/min、15yl/min等，选择效果最好的速度为微流控加样速度。
[0083] 5、标准化程序建立
[0084] 5.1通过以上摸索，本发明选择了合适的硅片化学表面、筛选到了合适的探针、合 适的表面封闭剂、加样速度和冲洗速度等参数。
[0085] 6、制备鉴定芯片
[0086] 6.1将表面羧基化处理后的硅片放置于微流控检测膜片上。
[0087] 6.2装配鉴定探针:在检测位点上分别装配选择好的风疹病毒、单纯疱疹病毒2型、 弓形虫抗原，浓度0.1mg/mL，每个检测位点10μ1，流速lmg/min，PBS缓冲液50μ1冲洗，流速10 μΙ/min。
[0088] 6.3封闭：711^/1111834封闭检测位点，流速1.5以1/1^11，？83缓冲液5(^1冲洗，流速10 μΙ/min。
[0089] 7、实施检测和/或鉴定：
[0090] 7.1标准品的检测和/或鉴定：
[0091] 7.1.1单个标准品的检测和/或鉴定:采用2X2点芯片检测标准样品，在第1行中选 择2点作为对照点，对照点1为空白对照，对照点2为阴性对照（检测注入10mg/ml的IgG 20μ 1，操作方法同下，以排除非特异性吸附），同一浓度标准品同时检测2点。结果如图1所示。
[0092] 7.1.2 3种标准品在同一芯片上检测和/或鉴定:采用2 X 4点芯片检测标准样品， 在第1行中选择2点作为对照点，对照点1为空白对照，对照点2为阴性对照(检测注入10mg/ ml的IgG 20μ1，操作方法同下，以排除非特异性吸附），同一浓度标准品同时检测2点。
[0093] 将被检测和/或鉴定标准品分别注入检测列位点，流速1.5yl/min，PBS液50μ1冲 洗，冲洗流速1 〇μ 1 /m i η。结果如图2所示。
[0094] 7.2血样检测和/或鉴定:分别选取了3种抗体阳性和阴性的血清，按照标准品检测 和/或鉴定方法检测，取2点为对照，对照点与阳性血清检测点对比，除了点加的为阴性血清 外，其余操作与阳性检测点相同，其余4点为阳性血清检测点。结果如图3所示。
[0095] 8、读取芯片：取下芯片，去离子水冲洗后氮气吹干，置于椭偏光成像系统样品板 上，鉴定芯片上各检测位点分子膜层的厚度变化将呈现在计算机显示器上，并且膜层厚度 和在显示器上的灰度呈一致性变化，观测和读取实验图像和图像的灰度值。
[0096] 9、阴性阳性检测点电脑灰度值用SPSS统计学软件做统计学分析。
[0097] 10、检测结果：
[0098] 10.1表面改性方式优化
[0099] 本发明发现在光学显像中，醛基化学表面的芯片相对对蛋白质吸附和羧基表面类 似，但羧基化学表面比醛基表面反应平面细腻均匀，本底灰度值低，对试验干扰少，基于以 上试验，优先选择羧基化学表面的芯片。
[0100] 10.2探针筛选
[0101] 分别从2种探针中选择和特异性抗体结合好的作为鉴定探针，并且发现探针浓度 0.1mg/ml的时候，检测和/或鉴定效果最好，并且增加探针浓度，敏感性没有明显提高， 0. lmg/ml为最佳探针浓度。
[0102] 10.3封闭试剂筛选
[0103] 经过对多种封闭试剂的筛选，选择BSA作为封闭试剂，浓度为7mg/ml。
[0104] 10.4目标检测和/或鉴定用量、微流控加样速度优化
[0105] 实验发现样品点加速度1.5μ1/π?η时，反应条件最好，探针和被检测和/或鉴定物 能够充分特异性结合，并且被检测和/或鉴定物1〇μ1即可以被检测和/或鉴定到。
[0106] 10.5标准化程序的建立
[0107]通过实验，本发明建立了标准化检测和/或鉴定程序：
[0108] (1)芯片表面应用羧基化学表面。
[0109] (2)封闭试剂选用BSA 7mg/mL。
[0110] (3)被检测和/或鉴定样品用量10μ1。
[0111] (4)试剂点加速度1.5yl/min，PBS冲洗速度ΙΟμΙ/min，冲洗50μ1。
[0112] 10.6检测三类抗体的结果：
[0113]从图3中可以看出，检测单元中，3类病毒阳性血清灰度明显高于阴性血清，说明检 测单元中各致病微生物抗原捕获到相应的致病微生物抗体并由光学芯片显示出来灰度信 号的增加，说明基于椭偏成像的蛋白芯片可以检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹 病毒，并可进一步根据检测单元灰度的高低定量被检测和/或鉴定分子。经过大量实验验证 和分析，检测灵敏度可以达到〇. 〇〇5IU/mL，灵敏度较高。
[0114]表1检测标准品时对照点与标准品检测点灰度值比较
[0116]表2检测阳性血清各抗体检测单元灰度值比较
[0118] 从表1和2中可以看出，检测单元中灰度值结果：阳性血清灰度值显著高于阴性血 清，应用SPSS统计学分析，3种被检测和/或鉴定物对应灰度值阳性结果与阴性结果比较具 有显著差异，p〈〇〇〇5。
[0119] 在本发明中，通过反复实验，筛选出了蛋白吸附能力好、本底灰度均匀、对检测干 扰弱的羧基化学表面为检测表面，并筛选出了合适的PBS冲洗液和流速，以尽可能冲洗掉非 特异性吸附而又保留了特异性吸附；筛选出了合适的封闭试剂BSA及其浓度、用量和流速， 以及检测样品的用量、流速，建立了一套标准化检测程序。在3种被检测物的检测中，看到两 个对照点与芯片本底灰度几乎相同，说明选择的封闭试剂能够后极好的封闭芯片表面，极 好的减少了非特异吸附。在阳性检测位点上，灰度均明显的高于隐性位点，SPSS统计学分析 表明有显著差异，说明利用此蛋白芯片可以检测弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒。在进一 步所做的检测C反应蛋白的研究中，我们发现，不同浓度梯度的样品通过检测位点后，所显 示的灰度（即分子膜层的厚度)也呈现不同灰度梯度，SPSS软件统计学分析表明被检测样品 浓度与对应的检测位点的灰度威尔逊相关系数达9.53,并且呈明显的线性关系，这说明用 椭偏显微成像技术的微流控蛋白芯片可以定量检测。通过该芯片系统来检测弓形虫、风疹 病毒和单纯疱疹病毒，更好的指导优生优育。
[0120] 综上所述，我们通过研究，得出结论，用基于椭偏显微成像技术的蛋白芯片可以检 测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒。
[0121] 实施例2
[0122] -种种椭偏显微成像蛋白芯片，该芯片是由以下方法制备得到：
[0123] 将羧基改性表面的硅片装配鉴定探针：在检测位点上分别装配弓形虫、风疹病毒 和单纯疱疹病毒的抗原，然后采用PBS进行冲洗;再采用封闭试剂封闭所述检测位点，得到 椭偏显微成像蛋白芯片;制备参数参考实施例1中的标准化检测和/或鉴定程序中的参数。
[0124] 风疹病毒抗体的定量检测
[0125] 1、临床血清样品的fe正曲线和定量检测
[0126] 建立校准曲线，血清样品（942号，218国际单位/毫升)进行系列稀释，稀释浓度为 0011，0043,0170,0681，272511]/11^5个浓度梯度的风疹病毒抗体，用?831'稀释。风疹病毒抗 原作为检测探针固定在芯片上，BSA封闭，分别检测5种浓度的标准血样，水平轴上为对应5 种不同浓度的灰度值的变化，Y轴上产生的校准曲线。
[0127] 在获得校准曲线后，可以根据其灰度值确定未知浓度的样品中的抗体浓度。传统 的酶联免疫吸附抗体试剂盒检测结果作为对照组，采用单因素分析法分析了两者之间的相 互关系。
[0128] 通过检测不同浓度梯度的风疹病毒抗体标准品取得了定量检测校准曲线，用48点 芯片检测病人血样，检测位点中，我们还留取不同检测点作为空白对照、阴性血清对照、以 及鼠 IgG抗体检测anti-IgG抗体，这些检测点给我们提供对比。
[0129] 2、统计分析
[0130]用Microsoft Office Excel，采用单因素方差分析计算相应P值。在定性和定量检 测方面，用检测区域的灰度值与空白对照区域进行比较，PS005表示两者差异有统计学意 义。与ELISA和BIE比较，P多005表示两种方法检测结果一致，无差异。
[0131] 3、结果
[0132] 3.1检测不同浓度梯度风疹病毒抗体标准品所得图像如图4所示。
[0133] 3.2检测不同浓度梯度风疹病毒抗体标准品所得浓度灰度值，如表3所示：
[0134] 表3
[0136] 3.3检测风疹病毒IgG抗体标准品校准曲线，如图5所示。
[0137] 3.4本实施例检测风疹病毒抗体阳性血清芯片图，如图6所示。
[0138] 3.5检测15例风疹病毒抗体阳性血清芯片检测点对照表，如表4所示。
[0139] 表4
[0142] 3.6应用椭偏光学芯片检测结果与酶联免疫检测结果对比柱状图，如图7所示。
[0143] 从两种方法检测结果可以看出，椭偏显微成像光学蛋白芯片检测结果与酶联免疫 检测方法具有相同的高低趋势。
【主权项】
1. 一种用于同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的方法，其特征是，包括以下步 骤： (1) 制备鉴定芯片： 在具有羧基表面改性的硅片的检测位点上分别装配弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒 的抗原，然后进行冲洗;再采用封闭试剂封闭所述检测位点，得到鉴定芯片； (2) 实施鉴定： 将待鉴定溶液注入到步骤（1)中鉴定芯片的检测位点内，待鉴定溶液中的抗体分子与 所述鉴定芯片上的抗原分子特异性结合，导致芯片的检测位点表面的分子膜层的厚度或密 度发生变化;然后进行冲洗； (3) 读取芯片： 采用椭偏显微成像仪检测步骤(2)中的所述变化，由此判定待鉴定溶液中是否含有弓 形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒以及获得它们的抗体含量。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1)中，羧基改性表面的硅片的制备方法如 下:首先采用去离子水冲洗硅片，然后采用氨基硅烷和浓硫酸的混合液浸泡冲洗后的硅片， 再采用无水乙醇冲洗浸泡后的硅片，最后采用饱和琥珀酸钠无水乙醇溶液浸泡冲洗后硅 片，获得羧基改性表面的硅片。3. 如权利要求1所述的方法，其特征是：所述氨基硅烷和浓硫酸的体积比为1: (2~~ 4)，采用氨基硅烷和浓硫酸的混合液的浸泡时间为20~40min，所述饱和琥珀酸钠无水乙醇 溶液的浸泡时间为1.5~3h。4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征是，步骤（1)中，在装配探针之前，需要将表面 羧基改性的硅片置于微流控检测膜片上，采用微流控芯片加样系统进行点加探针，微流控 加样流速为1.4~1.6μ1/π?η，用量为10~12μ1。5. 如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1)中，采用40~60μ1 PBS进行冲洗，冲洗 速度为8~12μ1/η?η。6. 如权利要求1所述的方法，其特征是:步骤(2)中，待鉴定溶液的注入速度为1.4~1.6 μL/min，用量为 10 ~12μ1。7. -种椭偏显微成像蛋白芯片的制备方法，其特征是，包括以下步骤:在具有羧基改性 表面的硅片的检测位点上分别点加弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的抗原，然后采用PBS 进行冲洗;再采用封闭试剂封闭所述检测位点，得到椭偏显微成像蛋白芯片；其中，羧基改 性表面的硅片的制备方法包括:首先采用去离子水冲洗硅片，然后采用氨基硅烷和浓硫酸 的混合液浸泡冲洗后的硅片，再采用无水乙醇冲洗浸泡后的硅片，最后采用饱和琥珀酸钠 无水乙醇溶液浸泡冲洗后硅片，获得羧基改性表面的硅片。8. 采用权利要求7所述的方法得到的椭偏显微成像蛋白芯片。9. 一种用于同时检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒的试剂盒，该试剂盒 包含权利要求8所述的蛋白芯片。10. 下述应用，包括： 权利要求8所述的蛋白芯片在同时鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒中的应用； 权利要求8所述的蛋白芯片在是制备用于同时检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯 疱疹病毒的试剂盒的应用； 权利要求9所述的试剂盒在同时检测和/或鉴定弓形虫、风疹病毒和单纯疱疹病毒中的 应用。
【文档编号】G01N33/68GK106093427SQ201610387434
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610387434.0, CN 106093427 A, CN 106093427A, CN 201610387434, CN-A-106093427, CN106093427 A, CN106093427A, CN201610387434, CN201610387434.0
【发明人】孙红柳, 王巧云
【申请人】滨州医学院