产品和方法

专利名称：产品和方法
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本发明涉及用于评定细胞中的基因转录水平的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针可被用于分析方法特别是诊断方法中。便利地，该探针以试剂盒的形式被提供。不同的探针组被用于该方法中，以制备基因表达模式，并鉴定、诊断或监控不同的状态，例如疾病、病症或其阶段。还提供了鉴定适当的探针的方法及其用于本发明的方法中的用途。
确定用于例如诊断应用的、快速和简便的样本分析方法，仍然是许多研究人员的目标。终端用户寻求的是低廉的、产生有重要统计意义的结果并且能被常规操作而无需技术高超的人员的方法。
对细胞内的基因表达的分析已经被用于获得关于这些细胞的状态的信息，重要的是该细胞来源的个体的状态的信息。各种基因在细胞中的相对表达已经被确定为反映了机体中的特定状态。例如，已知，癌症表现出多种蛋白质的表达发生变化，因此，转录物或者所表达的蛋白质可作为这些疾病状态的标志物(marker)。
因此，可以分析活组织检查的组织中是否存在这些标记，并且通过是否存在这些标记，在机体的其它组织或体液中确定源自疾病部位的细胞。此外，被改变的表达产物可能被释放到血流中，可以分析这些产物。此外，已经与疾病细胞接触过的其它细胞可能受其与这些细胞直接接触的影响，导致基因表达的改变，可以类似地分析它们的表达或者表达产物。
但是，这些方法受到一些限制。例如，使用特定的肿瘤标志物来确定癌症存在各种缺陷，例如缺乏特异性或灵敏度，除了特定类型的癌症，缺乏标志物与疾病状态的关联，难以在无病症个体中进行检测。
除了对一种或两种标志转录物或蛋白质的分析外，最近还对基因表达模式进行分析。涉及提示疾病诊断的大规模基因表达分析的大部分工作都涉及来源于疾病组织或细胞的临床样本。例如，多个最近公开的研究证明，可以用基因表达数据区分相似的癌症类型，这些研究都采用来自疾病组织或细胞的临床样品(Alon等1999，PNAS，96，6745-6750；Golub等1999，Science，286，53I-537；Alizadeh等，2000，Nature，403，503-5II；Bittner等，2000，Nature，406，536-540)。
但是，这些方法依赖于对样本的分析，该样品含有疾病细胞或这些细胞的产物或者与疾病细胞接触的细胞。对这种样本的分析依赖于对疾病存在及其定位的了解，这在无病症患者中是困难的。此外，不是总能够从疾病部位获取样本，例如在脑部疾病中。
在具有重要意义的发现中，本发明人鉴定机体中所有细胞的先前未被使用的潜力，提供与来源细胞的生物体的状态相关的信息。WO98/49342描述了对远离疾病部位的细胞的基因表达进行分析，例如从远离癌症部位所收集的外周血液。
这些发现是基于生物体的不同部分之间存在动态的相互作用的假设。当疾病作用于机体的一部分时，机体的另一部分也受到影响。这种相互作用是由疾病区域释放的生物化学信号的广谱作用产生的，影响机体的其它区域。虽然，由释放的信号引起的生物化学和生理变化的性质在不同机体部分是不同的，可以在基因表达水平上测定这种变化。并且用于诊断目的。
通过基因表达模式来确定生物体中的细胞的生理状态。该模式取决于所述细胞暴露的内部的和外部的生物刺激，而这些刺激在程度上或性质上的任何变化都会导致表达模式的改变，在细胞中不同基因以这种模式表达。人们逐步意识到，通过在生物样本中分析细胞中的基因表达模式的系统性变化，有可能获得关于作用于细胞的生物刺激的类型和性质的信息。因此，例如，通过在检测样本中监控细胞中的大量基因的表达，有可能确定这些基因是否以特定疾病、病症或其阶段的特征性模式被表达。因此，测定例如来自组织或体液的细胞中的基因活动的变化，已经成为用于疾病诊断的有力工具。
这种方法具有多种优点。通常，从疾病机体的特定区域获得临床样本是困难的，可能会在机体中产生不期望的侵入，例如，活组织检查常常被用来获得癌症样本。在有些情况下，如在阿尔茨海默病中，只能在死亡后获得大脑样本。此外，获得的组织样本常常是异源的(heterogeneous)，并且可能含有患病的和未患病的细胞的混合物，使得对生成的基因表达数据进行分析变得复杂而困难。
一般认为，在肿瘤的形态学表现上似乎发病均一(homogeneous)的肿瘤组织可能在分子水平上属于高度异质的(Alizadeh，2000，同上文)，并且实际上可能含有代表实质上不同种类的疾病的肿瘤(Alizadeh，2000，同上文；Golub，I999，同上文)。用于鉴定疾病、病症或其阶段，任何不需要直接来源于疾病组织或细胞的临床样本的方法是十分让人期望的，因为代表细胞类型均质混合物的临床样本可以从机体的容易接近区域获得。
目前，本发明人已经鉴定一组探针，其具有用于鉴定一种或多种疾病的令人惊讶的用途。因此，本发明人描述来源于无病细胞也未与疾病细胞接触的细胞的探针或探针组，该探针对应于相对于疾病个体在正常个体中具有改变的表达的基因，该探针用于鉴定、诊断或监控特定病症、特定疾病或其阶段的方法中。
因此，本发明提供一组寡核苷酸探针，其对应于在细胞中、表达受特定疾病、病症或其阶段的特征性模式影响的基因，其中所述基因系统性地受所述疾病、病症或其阶段影响。优选地，所述基因是代谢基因或看家基因，优选被组成型中度或高度(moderately or highly)表达。优选地，该基因在样本的细胞中被中度或高度表达，但是不在来自疾病细胞或与这种疾病细胞接触的细胞中表达。
特别地，当这种探针从远离疾病部位的细胞中分离得到时，该探针不依赖于疾病发展到临床上可识别的水平，并且可以在所述疾病或病症发作后的非常早的时期，甚至在出现其它主观的或客观的症状的数年前，检测该疾病或病症或其阶段。
如在此所用“系统性”受影响的基因是指基因未与疾病细胞或疾病部位直接接触并且被研究的细胞不是疾病细胞时，该基因在机体中的表达受到影响。
“接触”在此是指细胞相互地紧密邻近，使得可以观察到一个细胞对其它细胞的直接作用，例如，一种免疫反应，其中这些反应不是由第二种分子介导，所述第二种分子从第一种细胞释放，远距离地影响第二种细胞。优选地，接触是指物理接触或者空间上尽可能近的接触，便利地，相互接触的细胞存在于同一单位体积中，例如在Icm3中。
“疾病细胞”是出现表型变化并且在其生存历程的某一时期存在于疾病部位的细胞，例如在肿瘤部位的肿瘤细胞或者从肿瘤扩散的细胞，或者在大脑异常如阿尔茨海默病情形下的脑细胞。
“代谢的”或“看家的”基因是指那些负责表达参与分化和维持的产物的相应基因，例如非免疫功能相关基因。
“中度(moderately)或高度”的被表达基因是指以超过30-I00拷贝/细胞(假设每个细胞中平均3×I05个mRNA分子)的拷贝数存在于静止细胞中的那些基因。
在此提供了具有上述特性的特定探针。
因此，一个方面，本发明提供了一组寡核苷酸探针，其中所述探针组包括至少I0种寡核苷酸，其选自在表I中描述的寡核苷酸或来源于表I中描述的序列的寡核苷酸，或者具有互补序列的寡核苷酸或功能性相当的寡核苷酸。
“表I”在此是指表Ia和/或表Ib。表Ib包含在此公开的其它克隆和序列的参考。类似地，表2和4包括两个部分，a和b。
本发明还提供一种或多种寡核苷酸探针，其中各个寡核苷酸探针选自列举在表I中的、或者来源于表1中描述的序列的寡核苷酸或其互补序列。这种探针在本发明的产品和方法中的应用，构成了本发明的另一个方面。
如在此提及的“寡核苷酸”是在聚合结构中含有至少6个单体的核酸分子，即，核苷或其修饰形式。核酸分子可以是DNA、RNA或PNA(肽核酸)或其杂交物或其修饰形式，在合成过程中被甲基化或者由修饰的或非天然的碱基构成的，只要它们仍保留结合互补序列的能力，例如化学修饰形式，例如LNA(锁定核酸(Locked Nucleic acid))。这种寡核苷酸被用于本发明中，来探查目标序列，因此，在此也被称作寡核苷酸探针，或简称探针。
“来源于表1(或任何其它表)的序列的寡核苷酸”涉及表(例如表1-4)中公开的序列的一部分，其满足在此描述的寡核苷酸探针的要求，例如在长度和功能方面。优选地，所述部分具有下文描述的大小。
优选地，构成所述探针组的寡核苷酸探针至少长15个碱基，使得可以结合目标分子。特别地，优选所述寡核苷酸探针长度为20-200个碱基，例如30-150个碱基，优选长50-100个碱基。
如在此提及，术语“互补序列”是指具有连续互补碱基(即T:A，G:C)的序列，因此，该互补序列能够通过其互补性相互结合。
提及的“10种寡核苷酸”是指10种不同的寡核苷酸。表1的寡核苷酸、表1来源的寡核苷酸及其功能性等价物被认为是不同的寡核苷酸，互补寡核苷酸不被认为是不同的。但是，优选至少10种寡核苷酸是10种不同的表1的寡核苷酸(或表1来源的寡核苷酸或者它们的功能性等价物)。因此，所述10种不同的寡核苷酸优选能够结合到10种不同的转录物上。
优选地，所述寡核苷酸如表1所描述或者来源于表1中描述的序列。特别地，优选所述寡核苷酸如表2或表4所描述或者来源于在这些表的任何一个中所描述的的序列。特别地，优选所述寡核苷酸(或其衍生的寡核苷酸)具有表3中说明的高发生率，特别地优选＞40％，例如＞80或＞90，例如100％。
在此描述的“组(set)”是指独特寡核苷酸探针(即具有区别序列)的集合，并且优选由少于1000种寡核苷酸探针组成，特别地少于500种探针，例如优选10-500种，例如10-100种，200种或300种，特别地优选20-100种，例如30-100种探针。在有些情形下，使用少于10种探针，例如2-9种探针，例如5-9种探针。
可以预期，增加探针的数量，通过与其它会类似地改变被探查的特定基因的表达的疾病比较，将会防止不良分析例如误诊的可能性。也可以使用其它未在此被描述的寡核苷酸探针，特别当它们有助于寡核苷酸探针组的最终使用时。但是，优选地，所述探针组仅由所述表1的寡核苷酸、表1来源的寡核苷酸、或其互补序列或功能性等价的寡核苷酸、或其子集(例如具有上述大小)、优选序列在此被提供的子集(参见表1及其脚注)组成。特别地，优选所述探针组仅由所述表1的寡核苷酸、表1来源于的寡核苷酸或其互补序列或其子集组成。
在各个探针组中，可以存在多拷贝的每种独特的(unique)寡核苷酸探针，例如10个或多个拷贝，但是仅构成单一的探针。
优选将一组寡核苷酸探针固定在固体支持物上，或者用其它的方式进行这种固定，所述寡核苷酸探针组包括至少10种选自前文所述的那些探针的寡核苷酸探针。特别地，优选从那些具有如表3中描述的和如上提及的具有高出现率的核酸中选择所述探针。如上提及，这10种探针必需是独特的并且具有不同序列。但是，必需使用识别相同基因但是反映不同剪切事件的两种分别的探针。但是，互补并结合不同基因的寡核苷酸探针是优选的。
如在此描述，与表1中描述的那些序列或者来源于它们的序列的“功能性等价的”寡核苷酸，是指能够鉴定与表1的寡核苷酸或其来源的寡核苷酸所鉴定的相同的基因，即，其能够结合到与表1寡核苷酸或者表1来源的寡核苷酸(或其互补序列)相同的从基因(目标核酸分子)转录来的mRNA分子(或DNA)上。优选地，所述功能性等价的寡核苷酸是能够识别，即结合到与表1寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸相同的剪切产物上。优选地，所述mRNA分子是全长的mRNA分子，其对应于表1寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸。
如在此提及，“能够结合”或“结合”是指在下文描述的条件下杂交的能力。如下文所描述，可以表示为，功能性等价的寡核苷酸(或者互补序列)具有序列同一性，或者会杂交到目标分子的区域上，表1寡核苷酸或表1来源寡核苷酸或互补的寡核苷酸会结合该分子。优选地，功能性等价的寡核苷酸(或其互补序列)在下文描述的条件下杂交到对应于表1寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸的mRNA序列之一上，或者与对应于表1寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸的mRNA序列之一的一部分具有序列同一性。在本文中，“部分”是指一条至少5个碱基的链，例如至少10或20个碱基，例如5-100个，例如10-50个或15-30个碱基。
特别优选方面，功能性等价的寡核苷酸结合到靶核酸分子(mRNA或cDNA)的区域的全部或部分上，表1寡核苷酸或表1衍生的寡核苷酸结合到该核酸分子上。“目标”或“靶”核酸分子是基因转录物或者相关产物例如mRNA或cDNA，或其扩增产物。所述表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸结合的所述目标分子的所述“区域”是存在互补性的链。该区域最大为全长的表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸，但是如果整个表1的序列或表1来源的寡核苷酸不与该目标序列的区域互补时，该区域可以短一些。
优选地，所述目标分子的所述区域的所述部分为至少5个碱基的链，例如，至少10或20个碱基，例如5-100碱基，例如10-50个或15-30个碱基。例如，这可以通过具有多个与表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸的碱基相同碱基的所述功能性等价的寡核苷酸来实现。这些碱基可以在连续的链上相同，例如在功能性等价的寡核苷酸的部分上，或者可以不连续地存在，但是具有足够允许结合到目标序列上的互补性。
因此，在优选方面，所述功能性等价的寡核苷酸在高严紧条件下结合到表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸或其互补序列上。可以表示为，所述功能性等价的寡核苷酸与表1寡核苷酸的全部或部分具有高度序列同一性。优选地，所述功能性等价的寡核苷酸与表1的寡核苷酸的全部或其部分具有至少70％序列同一性，优选至少80％，例如至少90、95、98或99％的序列同一性。如在本文所用，在所述表1的寡核苷酸中，“部分”是指至少5个碱基的链，例如至少10个或20个碱基，例如5-100个，例如10-50个或15-30个碱基。特别优选地，当仅与所述表1的寡核苷酸的部分具有序列同一性时，序列同一性很高，如上所述，例如至少80％。
满足上面规定的功能要求的功能性等价的寡核苷酸包括那些来源于表1的寡核苷酸，以及那些通过一个或多个核苷酸碱基(或等价物)取代、添加和/或删除修饰的、但是保持功能活性的寡核苷酸，所述活性例如结合到与表1的寡核苷酸或表1来源的(derived)寡核苷酸相同的目标分子上，自表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸它们被进一步衍生或修饰。优选地，所述修饰为1-50个，例如10-30个，优选1-5个碱基。特别优选地，仅存在较小的修饰，例如小于10个碱基的改变，例如小于5个碱基的改变。
“添加”等价物的含义中包括含有添加的序列的寡核苷酸，该寡核苷酸与目标分子上连续的碱基链互补，表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸结合到该目标分子上。可替代地，该添加包括不同的、不相关的序列，其可能例如赋予另一种特性，例如提供一种固定方式，例如作为将寡核苷酸探针结合到固体支持物上的接头。
特别优选的是天然的等价物，例如生物学变体，例如等位基因的、地理的或同种异型的变体，例如对应于遗传变体的寡核苷酸，例如在不同种属中存在的。
功能性等价物包括具有被修饰碱基的寡核苷酸，例如采用非天然的碱基修饰的。这种衍生物可以在合成过程中或者通过生产后修饰来制备。
在低严紧条件下“杂交”的序列是那些在非严紧条件下(例如，室温下6×SSC/50％甲酰胺)结合，并且在低严紧条件下(2×SSC，室温，更加优选2×SSC，42℃)洗涤时仍保持结合。高严紧条件下的杂交是指上述条件，其中在2×SSC，65℃(其中SSC＝0 15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.2)条件下进行洗涤。
在此提及“序列同一性”是指当用C1ustalW(Thompson等，1994，Nucl.Acids Res.，22，4673-4680)以如下参数进行评价时获得的值成对排列参数-方法精确，矩阵IUB，缺口开口罚分15.00，缺口延伸罚分6.66；多重排列参数-矩阵IUB，缺口开口罚分15.00，延迟的％同一性30，逆矩阵(Negative matrix)无，缺口延伸罚分6.66，DNA变换权重(transitionsweighting)0.5。
特定碱基上的序列同一性意欲包括被简单衍生化的相同碱基。
本发明还涉及由表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸所结合的序列mRNA编码的多肽。本发明还涉及结合任何所述多肽的抗体。
如上文所述，便利地，可以将所述组的寡核苷酸探针固定在一个或多个固体支持物上。单一的或优选多重拷贝的各种独特探针被附着到所述固体支持物上，例如存在10个或更多的，例如至少100个拷贝的各种独特(eachunique)探针。
一种或多种独特寡核苷酸探针可以与分开的固体支持物结合，一起形成固定在多个固体支持物上的一组探针，例如一种或多种独特的探针被固定在多种珠、膜、滤器(filter)、生物芯片等上，一起形成一组探针，一起形成下文描述的试剂盒的模块(module)。虽然与各种探针相关的信号(如下文所述产生的)必需是分别地被检测，不同模块的固体支持物可便利地物理上相联在一起。
可替代地，探针必需被固定在同一固体支持物的分散部分上，例如各种独特的寡核苷酸探针，例如以多拷贝存在，可能被固定在单一的滤器或膜的不同和分散的部分或区域上，例如生成阵列。
这种技术的组合也可以被使用，例如可以使用数个固体支持物，每个支持物固定了多种独特的探针。
表述“固体支持物”是指能够通过疏水键、离子键或共价键结合寡核苷酸的任何固体材料。
如在此所用“固定”是指探针通过这种结合可逆地或者不可逆地结合到所述固体支持物上。如果是可逆的，所述探针保持与固体支持物结合足够长的时间，使得本发明的方法可以被实施。
许多适合用于固定按照本发明的成分的固体支持物在本领域是熟知的，并且在文献中被广泛描述，总之，固体支持物可以是当前被广泛使用的或者在化学或生物化学方法中用于固定、分离等的熟知支持物或材料的任何一种。这种材料包括，但是不限于，任何合成的有机聚合物，例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯；或者硝化纤维和纤维素乙酸酯；或者甲苯磺酰基活化表面；或者玻璃或尼龙或者任何具有适合共价偶联核酸的基团的表面。固定部分可以是颗粒、片、凝胶、滤器、膜、微丝条带(microfibre strip)、试管或平板、纤维或毛细管形式，由如聚合材料如琼脂、纤维素、藻酸盐、聚四氟乙烯、乳胶或聚苯乙烯或磁珠组成。可以提供阵列(优选以一维的形式)的固体支持物是优选的，例如片、滤器、膜、平板或生物芯片。
可以直接或间接地将核酸分子附着到固体支持物上。例如，如果使用滤器，可以通过UV-诱导的交联来进行附着。可替代地，可以利用寡核苷酸探针和/或固体支持物上携带的连接成分，间接进行附着，因此，例如可以使用一对亲合结合配偶体，例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或生物素、DNA或DNA结合蛋白(例如lac I阻遏蛋白或者其结合的lac操纵子序列)、抗体(可以是单克隆抗体或多克隆抗体)、抗体片段或表位或抗体的半抗原。在这些情况下，结合对中的一个配偶体被附着到固体支持物上(或者是内在的一部分)，而其它配偶体被连接到核酸分子上(或者是内在的一部分)。
如在此所用，“亲合结合对”是指识别并特异性地相互结合的两个成分(即优先结合另外一个分子)。当这种结合对结合在一起时，形成复合物。
可以通过本领域熟知的方法将适当的功能性基团附着到固体支持物上，其包括，例如通过羟基、羧基、醛基或氨基连接，可以通过处理固体支持物以生成合适的表面包被来提供这些基团。可以通过本领域知晓的常规方法来生产呈递用于附着结合配偶体的适当成分的固体支持物。
可以在合成或扩增过程中，通过连接或导入将适当的功能性基团附着到本发明的寡核苷酸探针上，例如采用携带适当成分例如生物素的引物或用于捕获的特定序列。
便利地，上文描述的探针组以试剂盒的形式提供。因此，从还有一个方面看，本发明提供一种试剂盒，包括被固定在一种或多种固体支持物上的上文描述的一组寡核苷酸探针。
优选地，所述探针被固定在单一的固体支持物上，并且各种独特探针被附着到所述固体支持物的不同区域上。但是，当被附着到多个固体支持物上时，所述多个固体支持物形成构成试剂盒的模块。特别地，优选所述固体支持物是片、滤器(filter)、膜、平板或生物芯片。
可选择地，该试剂盒还含有由正常或疾病样本产生的信号的信息(将在下文涉及试剂盒的使用中被更加详细地讨论)，标准化材料，例如用于比较目的的来自正常和/或疾病样本的mRNA或cDNA，用于结合到cDNA的标记，用于扩增目的导入核酸的连接物，用于扩增的引物和/或适当的酶，缓冲液和溶液。可选择地，所述试剂盒可能还含有包装插页，该插页描述如何实施本发明的方法，可选择地提供标准曲线、数据或者用于解释实施本发明所获得的结果的软件。
如下文描述的这种试剂盒用于制备标准的诊断基因转录本模式(standarddiagnostic gene transcript pattern)的用途构成了本发明的另一个方面。
在此描述的探针组具有各种用途。但是，它们主要地被用于评价被检测细胞的基因表达状态，以提供与来源所述细胞的生物体相关的信息。因此，该探针可用于诊断、鉴定或监控生物体中的疾病或病症或其阶段。
因此，在还有一个方面，本发明提供上文所述的一组寡核苷酸探针或试剂盒来确定细胞的基因表达模式，该模式反映所述寡核苷酸探针结合的基因的基因表达水平，至少包括步骤a)从所述细胞中分离mRNA，可选择地将该mRNA反转录成cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到在此定义的一组寡核苷酸探针或试剂盒上；和c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，以产生所述模式。
在本方法以及下文的方法中提及的mRNA和cDNA包括所述分子的衍生物或拷贝，例如这些分子的拷贝，如那些通过扩增生成的或互补链制备的，但是仍保持与mRNA序列的同一性，即能够在至少所述分子的一个区上，通过精确的互补性或序列同一性杂交到直接转录物(或其互补序列)上。可以预期，在整个区域上不存在互补性，在该区域上采用一些技术，例如通过引物扩增，截断转录物或者导入新序列。为了方便，优选在步骤b)之前扩增所述mRNA或cDNA。采用在此描述的寡核苷酸，可以修饰所述分子，例如通过在合成过程中使用非天然的碱基，同时保持互补性。这种分子可能还含有其它成分例如信号成分或者固定成分。
在制备这种模式的方法中包括的各种步骤将在下文被更加详细地描述。
如在此所用，“基因表达”是指特定的基因转录，生成特定的mRNA产物(即特定的剪接产物)。可以通过评价被转录的mRNA分子或从mRNA分子反转录得到的cDNA分子或者来源于这些分子的产物的量来确定基因表达水平，例如通过扩增。
通过这种方法产生的“模式(pattern)”是指例如通过列表和图形形式表示的信息，并且传递与两种或多种寡核苷酸相关信号的信息。优选地，所述模式被表达成与各种探针关联的表达水平相关的数量的排列。优选地，所述模式用如下线性模型来建立y＝Xb+f 方程式1其中，X为基因表达数据的矩阵，而y为因变量(response variable)，b为回归系数向量(regression coefficient vector)，而f为估计的残数向量(estimated residual vector)。虽然。可以用许多不同的方法来建立方程式1中提供的关系，特别优选地，采用偏最小二乘回归(Partial Least SquaresRegression)(PLSR)方法来建立方程式1中的关系。
因此，该探针被用于产生反映细胞在其分离时的基因表达模式。表达模式表征了细胞适合存在的环境，并且取决于该细胞曾受到的影响。因此，可以制备来自患有特定疾病或病症的个体的细胞的特征性基因转录模式标准或指纹图(标准探针模式)，并且可以被用于比较检测细胞的转录模式。这显然可以被用于诊断、监控或鉴定一种生物体是否患有特定的疾病、病症或其阶段。
通过确定来自一种或多种患有疾病或病症或其阶段的生物体样本的细胞的总mRNA(或cDNA或相关产物)的结合到所述探针上的程度，制备标准模式。这反映代表对应于各种独特探针的转录物的量。评价结合到不同探针上的核酸物质的量，这些信息一起构成该疾病或病症或其阶段的基因转录模式标准。各种这样的模式表征该疾病、病症或其阶段。
在还有一个方面，本发明提供一种制备表征生物体中的疾病或病症或其阶段的标准基因转录模式(standard gene transcript pattern)的方法，至少包括步骤a)从一种或多种患有疾病或病症或其阶段的生物体中分离mRNA，可选择地将mRNA反转录成cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到上文描述的特异于所述生物体及其样本的疾病或病症或其阶段的一组寡核苷酸或试剂盒上，该生物体和样本对应于被研究的生物体和样本；和c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，生成反映在患有疾病、病症或其阶段的样本中，所述寡核苷酸结合的基因的基因表达水平的特征性模式。
方便起见，所述寡核苷酸优选被固定在一种或多种固体支持物上。
采用特定探针确定的大量疾病或病症以及其不同阶段的标准模式被积累在数据库中，可供需要的实验室获取。
在此提及的“疾病”样本或生物体是指相对于正常生物体(或样本)发生病理紊乱的生物体(或从此获得的样本)，有症状或无症状的生物体，其由例如感染或获得性或先天性遗传缺陷产生。这种生物体已知具有或表现出所研究的疾病或病症或其阶段。
“病症(condition)”是指生物体的精神上或机体上的状态，未在疾病过程中出现，例如机体中存在一种致病因子(agent)，例如毒素、药物或者污染物，或者妊娠。
其“阶段(stage)”是指疾病或病症的不同阶段，其可能具有或不具有特定的生理或代谢改变，但是在基因水平上发生改变，可以以改变的基因表达来检测。可以预期，在疾病或病症过程中，不同转录本的表达是变化的。因此，在不同阶段，改变的表达由于相对于“正常”样本的特定转录物而未被展示。但是结合来自多个转录物的信息可以被用于产生指示疾病或病症的特定阶段的特征性模式，该信息显示在疾病或病症过程的一个或多个阶段的改变的表达。因此，例如可以确定癌症中的不同阶段，如前期I、I期、II期、II或IV期。
如在此所用，“正常物”是指用于比较目的的生物体或样本。优选地，从某种意义上说，如果不具有任何迹象表明患有或者被认为患有任何影响基因表达的疾病或病症，特别是它们将被用作正常标准物的相关疾病，则它们是“正常的”。但是，还可以预期，在这种情形下，可以比较疾病或病症的不同阶段，“正常的”样本对应于疾病或病症的较早阶段。
如在此所用，“样本”是指从生物体中例如被研究的含有细胞的人或非人的动物获得的任何物质，包括，组织、体液或机体废物，或者在为原核生物体的情况下是生物体本身。“体液”包括血液、唾液、脊髓液、精液、淋巴。“机体废物”包括尿液、咳出的物质(肺部患者)、粪便等。“组织样本”包括通过活组织检查、手术介入或者通过其它方法获得的组织，例如胎盘。但是，优选地，被检测的样本来自未明显受疾病或病症影响的机体区域。这些样本中的细胞不是疾病细胞，例如癌细胞，未与这种疾病细胞接触并且不是来源于疾病或病症部位。“疾病部位”被认为是以可以客观地被确定的方式显现出疾病的机体部位，例如肿瘤或炎症区域。因此，例如外周血被用于诊断非造血性癌症，该血液不需要存在来自血液中的癌症的恶性或分散的细胞。类似地，在脑部疾病中，由于血脑屏障，血液中没有发现疾病细胞，但外周血仍可以被用于本发明的方法中。
但是，可以预期，制备标准转录模式的方法和本发明的其它方法也可以被用于真核生物体的活的部分，例如细胞系和器官培养物和外植体(explant)。
如在此所用，提及的“相应”样本等是指优选来自同一组织、体液或机体废物的细胞，也包括来自足以类似用于制备标准或检测模式目的组织、体液或机体废物的细胞。当用于涉及“相应于”探针的基因时，是指尽管探针可能反映不同的表达剪切产物，但在序列上与探针相关的基因(其可能是互补的)。如在此所用，“评价”是指定量和定性的评价，其可以被绝对或者相对地确定。
可以如下实施本发明。为了制备特定疾病、病症或其阶段的标准转录模式，按照已知技术，从来自疾病个体或生物体的组织、体液或机体废物的细胞中提取样本mRNA(参见例如Sambrook等(1989)，Molecular CloningAlaboratory manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，纽约)。
由于难以操作RNA，优选在该阶段反转录RNA，以形成第一链cDNA。在该方法或者本发明的其它方法中，cDNA的克隆或从cDNA文库中选择或使用cDNA文库不是必需的。优选地，合成第一条链的cDNA的互补链，即第二条链的cDNA，但是这取决于在寡核苷酸探针存在哪一条相对链。但是，可替代地，直接使用RNA，而不需要反转录，如果需要，可进行标记。
优选地，通过已知的扩增技术扩增cDNA链，例如使用适当的引物进行聚合酶链式反应(PCR)。可替代地，可以用载体来克隆cDNA链，该载体用于转化细菌例如大肠杆菌，然后培养细菌以增加核酸分子。当cDNA序列是已知的时，引物可以定向于被导入的核酸分子的某些区域。因此，例如，可以将连接物连接到cDNA分子以及定向于所述用于扩增cDNA分子的这些部位的引物上。可替代地，在为真核生物样本的情况下，有利地采用polyA尾巴和RNA帽子来制备适当的引物。
为了生成特定疾病或病症或其阶段的标准诊断基因转录模式或指纹图，上述寡核苷酸探针被用于探查疾病样本的mRNA或cDNA，以产生杂交到各种特定寡核苷酸探针种类，即各种独特探针上的信号。如果需要，用来自正常样本的mRNA或cDNA制备标准的对照基因转录模式。因此，在允许杂交的适当条件下，将mRNA或cDNA与寡核苷酸探针接触。
当多种样本被探查，可以用同一探针连续进行，例如该探针位于一种或多种固体支持物上，即位于探针试剂盒模块上，或者通过同时杂交到相应的探针上，例如相应的探针试剂盒的模块。
为了确定杂交发生并获得结合到寡核苷酸探针上的转录物/cDNA分子数量的指示，有必要确定当转录物(或相关分子)杂交时产生的信号(例如在例如通过洗涤去除未被结合的分子后，通过检测双链核酸分子或检测被结合的分子数量)。
为了获得一种信号，杂交的一种或两种成分(即探针和转录物)携带或形成信号方式或其部分。这种“信号方式(signalling means)”是任何能够通过产生或呈递一种信号而直接或间接检测的成分。该信号是任何可检测的物理特性，例如被赋予放射激发、散射或吸收特性、磁性特性或现有分子(例如标记)或生成的分子(例如气体发射等)的其它物理特性，例如电荷、大小和结合特性。使得信号扩大的方法是优选的，例如从单一活性结合位点上产生多个信号事件，例如通过酶的催化作用产生多个可检测的产物。
便利地，信号方式可以是一种标记，其本身提供一种可检测的信号。便利地，这可以用放射性的或其它标记来实现，其可以在生产cDNA、制备互补cDNA链过程中，在扩增目标mRNA/cDNA中被加入或被直接添加到目标核酸分子上。
合适的标记是那些允许直接或间接地检测或测定转录物/cDNA的存在的那些标记。这种标记包括例如，放射性标记，化学标记，例如发色团或荧光团(例如染料如荧光素和罗丹明)，或者高电子密度的试剂例如铁蛋白、血蓝蛋白或胶体金。可替代地，该标记可以是酶，例如过氧化物酶或碱性磷酸酶，其中酶的存在通过与合适的实体例如一种底物相互作用来显示。该标记还可以构成信号对的一部分，其中该对的其它成分存在于或者紧密接近于转录物/cDNA所结合的寡核苷酸探针，例如，可以使用荧光化合物和淬灭荧光底物。可以在不同实体上提供标记，例如一种抗体，其识别附着到转录物/cDNA上的肽成分，例如附着到用于合成或扩增过程中的碱基上。
可以在杂交步骤之前、期间或之后导入标记来产生信号。可替代地，可以通过其它物理特性来确定杂交转录物的存在，例如它们的吸光率，在这种情形下，信号方式是复合物本身。
然后评价与寡核苷酸探针相关的信号量。该评价可以是定量的或定性的，并且基于单一的转录物种类(或相关cDNA或其它产物)结合到各种探针上或者多种转录物种类结合到多个拷贝的各种独特探针上。可以预期，定量结果将会给疾病的转录物指纹图提供更多信息，这些信息被汇集。该数据可以绝对值表示(在巨阵列情形下)或者被相对于特定的标准或参考值确定，例如相对于正常对照样本。
此外，可以预期，可以用一种或多种疾病样本(如果使用，正常样本)进行杂交步骤，来获得基因表达方面不偏向特定个体的变化的模式，以制备标准的诊断基因模式转录物。
使用探针来制备标准模式和标准的诊断基因转录模式，生成这些模式来用于鉴定或诊断或监控特定生物体中的特定疾病或病症或其阶段，构成了本发明的另一个方面。
一旦采用所测定的寡核苷酸探针鉴定特定疾病或病症的标准诊断指纹图或模式，该信息可以被用于鉴定不同检测生物体或个体中的疾病或病症的存在、缺乏或严重程度或发展阶段。
为了检查检测样本的基因表达模式，对应于用于制备标准模式的样本，从患者或被研究的生物体中获得组织、体液或含有细胞的机体废物的检测样本。然后如上文描述的标准模式，制备检测基因转录模式。
因此，在还有一个方面，本发明提供用于制备检测基因转录模式的方法，至少包括步骤a)从所检测的生物体样本的细胞中分离mRNA，其可选择地被反转录为cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到上文描述的特异于生物体及其样本的疾病或病症或其阶段的寡核苷酸或试剂盒上，该生物体和样本对应于被研究的生物体和样本；和c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，生成反映所述寡核苷酸结合的基因在所述检测样本中的基因表达水平的模式。
然后将检测模式与一种或多种标准模式比较，以评价样本中是否含有患有疾病、病症或其阶段的细胞。
因此，从还有一个方面看，本发明提供诊断、鉴定或监控生物体中的疾病或病症或其阶段的方法，包括步骤
(a)从所述生物体样本的细胞中分离mRNA，其可选择地被反转录为cDNA；(b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到上文描述的特异于生物体及其样本的疾病或病症或其阶段的寡核苷酸或试剂盒上，该生物体和样本对应于被研究的生物体和样本；和(c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，生成反映所述寡核苷酸结合的基因在所述样本中的基因表达水平的特征性模式；和(d)将所述模式与标准诊断模式比较，以确定在被研究的生物体中是否存在所述疾病或病症或其阶段，其中所述标准诊断模式是用来自对应于被研究的生物体和样本的生物体的样本按照本发明的方法制备的。
直到和包括步骤(c)的方法是对上述检测模式的制备。
如在此提及，“诊断”是指确定生物体中的一种疾病或病症或其阶段的出现或存在。“监控”是指确定疾病或病症的程度，特别是当已知该个体患有一种疾病或病症，例如监控治疗作用或疾病或病症的发展，例如确定治疗的合适性或提供一种预后。
可以通过确定标准的和检测的样本的模式间的相关程度来确定疾病和病症或其阶段的存在。这有必要考虑从正常或疾病样本中获得的数值的范围。虽然这可以通过获得多个结合到探针上的代表性样本的标准偏差来建立，以产生所述标准，但可以预期，如果检测样本与标准模式极其密切相关，单一样本足以生成用于确定疾病的标准模式。便利地，可以通过将指示性探针在检测样本中的表达水平相关的数据插入到按照方程式1建立的标准诊断探针模式中来预测检测样本中的疾病或病症或其阶段的存在、缺乏或疾病的严重程度或病症或其阶段。
用上面提及的方法产生的数据可以用来自从最基本的直观表示(例如关于强度)到更复杂的数据处理的各种方法来确定潜在的模式，该模式反映不同探针结合的各种基因的表达水平的相互关系，这种关系可以被量化并用数学方法表达。便利地，可以通过下文描述的数据加工和统计方法来处理生成的原始数据，特别是规范化(normalizing)和标准化(standardizing)数据，并将该数据拟合到分类模型上，以确定所述检测数据是否反映特定疾病、病症或其阶段的模式。
本文描述的方法可以被用于鉴定、监控和诊断疾病、病症或失调或其阶段或进展，寡核苷酸探针对它们具有指示作用。在此描述的“指示性”探针是这样的探针，其反映在质疑的疾病或病症或特定阶段中表达已被改变的基因。本发明的探针单独使用时，对于诊断目的不具有足够的指示性，但是被用作多个探针之一来产生特征性模式时具有指示性，例如用于上文描述的探针组中。
优选地，所述探针对应于系统性地受所述疾病、病症或其阶段影响的基因。特别地，优选产生本发明的探针结合的转录物的所述基因是代谢的或看家的基因，并且优选其适度地或高度地被表达。采用定向于中度或高度地被表达基因的探针的优点在于只需较小的临床样本来生成必要的基因表达数据集，例如少于1ml的血液样本。
此外，已经发现，那些已经被活跃转录的基因倾向于更容易正向或反向地受新刺激的影响。此外，由于已经在通常可检测的水平上产生转录物，这些水平上的小变化容易被检测，例如不必达到特定的可检测的阈值。
在本发明的优选方法中，本发明的探针组指示各种不同疾病、病症或其阶段。在此公开的探针的子集可以被用于诊断、鉴定和监控特定的疾病、病症或其阶段。
因此，该探针可以被用于诊断或鉴定或监控任何的病症、失调、疾病或反应，该反应导致任何或所有真核或原核生物体的指示性基因的活性的相对增强或减弱，而无论这些变化是否由细菌、病毒、朊病毒、寄生虫、真菌、辐射、天然或人工毒素、药物或过敏原引起，包括由应激、神经症、精神病引起的精神疾患(mental conditions)或者由于生物体老化引起的退化以及未知原因的病症或疾病，只要在此描述的探针子集能够指示所述疾病或病症或其阶段。
这种疾病包括那些引起代谢的或生理的改变的疾病，例如发烧相关的疾病，例如流感或疟疾。可以被检测的其它疾病包括例如黄热病、性传播疾病例如淋病、纤维性肌痛(fibromyalgia)、假丝酵母相关的综合症(candida-relatedcomplex)、癌症(例如胃、肺、乳腺、前列腺、肠道、皮肤、结肠或卵巢等)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、由逆转录病毒如HIV引起的疾病、老年痴呆症、多发性硬化和Creutzfeldt-Jakob病，等等。
本发明还可以被用于确定患有精神病或心理疾病的患者，例如精神分裂症和饮食紊乱。特别重要的是，用这种方法来检测用已知诊断方法不容易检测的疾病、病症或其阶段的用途，例如在HIV感染后的1-4月内，用已知方法通常是不能检测到的。可以鉴定的病症包括例如药物滥用，例如使用麻醉剂、乙醇、类固醇或提高机能的药物。
优选地，所述被鉴定或监控的疾病为癌症或退行性大脑异常(例如阿尔茨海默病或Parkinson病)。
特别地，一组寡核苷酸探针被用于诊断或鉴定或监控阿尔茨海默病的进展，其中所述探针组包括至少10种选自如下的寡核苷酸如表4中描述的寡核苷酸或来源于其中的寡核苷酸或具有互补序列的寡核苷酸，或功能等价的寡核苷酸。类似地，表2的探针和表2来源的探针及其功能性等价物可以被用于诊断、鉴定或监控乳腺癌的进展。特别地，优选用于乳腺癌分析的探针根据其在表3中列举或如上文描述的发生率来选择。
该诊断方法可以被单独使用，作为对其它诊断技术的替代或者对这种技术的补充。例如，本发明的方法可以被用作采用成像技术的诊断方法一种替代的或额外的诊断措施，成像技术如磁共振成像(MRI)、超声波成像、细胞核成像或X-射线成像，例如肿瘤的鉴定和/或诊断。
本发明的方法可以在来自原核或真核生物体的细胞中实施，可以是任何真核生物体，例如人类、其它的哺乳动物和动物、鸟类、昆虫、鱼和植物，以及任何原核生物体例如细菌。
在其中实施本发明的方法的优选非人类动物包括，但是不限于哺乳动物、特别是灵长类、家畜、牲畜和实验动物。因此，用于诊断的优选动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、猪、牛、山羊、绵羊、马。特别优选地，诊断、鉴定或监控人的疾病状态或病症。
如上所述，被研究的样本可以是任何的便捷的样本，可以从生物体上获得。但是如上提及，优选地，从远离疾病部位的位置上获得样本，并且该样本中的细胞是非疾病细胞、未与疾病细胞接触，并且不是来源于疾病或病症的部位。在这种情形下，虽然优选不含有这些细胞，但是样本中可能含有不满足这些标准的细胞。但是，由于本发明的探针与转录物相关，该转录物的表达在满足这些标准的细胞被改变，即使存在其它的背景细胞，该探针特定地定向于检测这些细胞中的转录水平的变化。
已经发现，来自这种样本的细胞在大量基因的基因表达上发生显著的和指示性的变化。因此，由于结合到该探针的转录物的特定水平或结合到该探针的程度相对于结合到其它探针上的程度的相互关系，同一探针(或几个探针)被发现指示关于两种或多种疾病、病症或其阶段的确定。结果，可能使用相对少的探针来筛选多种异常或疾病。已经有关于探针选择的结论，将在下文相对于探针的随机鉴定被讨论，但是也将单独一组探针用于一种以上的诊断。表9中给出本发明的优选探针，其指示阿尔茨海默病和乳腺癌的探针。
因此，本发明还提供用于诊断、鉴定或监控两种或多种疾病、病症或其阶段的探针组以及使用该探针组的试剂盒和方法，其中至少所述探针之一适合用于所述诊断、鉴定或监控至少所述疾病、病症或其阶段中的两种。优选地，至少5种探针，例如5-15种探针被用于至少两种诊断中。
因此，在还有一个优选方面，本发明提供上文描述的的诊断或鉴定或监控的方法，用于诊断、鉴定或监控生物体中的两种或多种疾病、病症或其阶段，其中在诊断方法的步骤c)中生成的所述检测模式在步骤d)中与至少两种如先前描述制备的标准诊断模式比较，其中各种标准诊断模式是为不同的疾病或病症或其阶段而制备。
同时，在一个优选方面，评价方法涉及来自检测样本的基因转录模式的发展以及该模式与标准模式的比较，可以通过检查表达产物以及这些产物的含量来检查特定标记的表达的增强或抑制。因而生成与被表达的产物有关的标准模式。
在这种方法中，由表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸结合的基因所表达的一组多肽的表达水平被分析。
可以用各种诊断方法来评价存在的多肽(或其片段)的量。可以例如通过将配偶体结合到可以被固定的多肽(例如抗体)上，从样本中分离所述多肽，然后确定多肽量，来检查多肽的存在或其浓度。
多肽的“片段”是指所述多肽的结构域或区域，例如抗原性片段，由于该片段来源于所述多肽，是可识别的，可以结合到特定的结合配偶体上。优选地，这种片段包括所述多肽的重要部分，并且对应于正常的合成后加工的产物。
因此，在还有一个方面，本发明提供用于制备表征生物体中的疾病或病症或其阶段的标准基因转录模式的方法，至少包括步骤a)从一种或多种患有疾病、病症或其阶段的生物体的样本中释放目标多肽；
b)将所述目标多肽与一种或多种结合配偶体接触，其中各种结合配偶体特异于由表1的寡核苷酸(来源于表1中描述的序列)结合的基因所编码的标志物多肽(marker polypeptide)(或其片段)，使得所述结合配偶体结合到所述目标多肽上，其中所述标志物多肽特异于生物体及其样本中的所述疾病或其状态，该生物体或其样本对应于被研究的生物体和样本；和c)评价结合到所述结合配偶体上的目标多肽，生成反映在具有疾病、病症或其阶段的样本中，表达所述标志物多肽的基因的基因表达水平的特征性模式。
如在此所用，“目标多肽”是指那些存在于被检测的样本中的多肽，而“标志物多肽”是由表1的寡核苷酸或表1来源的寡核苷酸所结合的基因编码的多肽。目标多肽和标志物多肽是相同的，或者至少具有高相似性的区域，例如可以识别和结合结合配偶体的表位区域。
目标多肽的“释放”是指适当地处理样本以提供容易被结合配偶体结合的形式的多肽，例如通过溶解存在多肽的细胞。这种情形下所使用的样本不是必需包含细胞，因为目标多肽可以被从细胞释放到周边组织或流体，并可对该组织或流体进行分析，所述流体例如尿液或血液。但是，优选地使用在此描述的优选样本。“结合配偶体”包括分开的实体，它们一起形成如上所述的亲合结合对，其中结合对的一个配偶体是目标或标志物多肽，而另一个配偶体特异性地结合该多肽，例如抗体。
设想各种排列来检测形成的结合对的量。在最简单形式中，可以使用夹层式分析例如免疫分析如ELISA，其中特异于多肽并携带标记(如本文其它部分描述的)的抗体可以被结合到结合对(例如第一抗体多肽对)并检测标记的量。
可以类似地改进在此描述的其它方法，分析表达的蛋白质产物，而不是基因转录和相关的核酸分子。
因此，本发明的另一个方面提供制备检测基因转录模式的方法，至少包括步骤a)从所述检测生物体的样本中释放目标多肽；b)将所述目标多肽与一种或多种结合配偶体接触，其中每种结合配偶体特异于由表1的寡核苷酸(来源于表1中描述的序列)结合的基因所编码的标志物多肽(或其片段)，使得所述结合配偶体结合到所述目标多肽上，其中所述标志物多肽特异于生物体及其样本中的所述疾病或其状态(condition)，该生物体或其样本对应于被研究的生物体和样本；和c)评价结合到所述结合配偶体上的目标多肽，以生成反映在所述检测样本中，表达所述标志物多肽的基因的基因表达水平的特征性模式。
还有一个方面，本发明提供诊断或鉴定或监控生物体中的疾病或病症或其阶段的方法，包括步骤a)从所述生物体的样本中释放目标多肽；b)将所述目标多肽与一种或多种结合配偶体接触，其中每种结合配偶体特异于由表1的寡核苷酸(来源于表1中描述的序列)结合的基因所编码的标志物多肽(或其片段)，使得所述结合配偶体结合到所述目标多肽上，其中所述标志物多肽特异于生物体及其样本中的所述疾病或其状态，该生物体或其样本对应于被研究的生物体和样本；和c)评价结合到所述结合配偶体上的目标多肽，生成反映在所述样本中，表达所述标志物多肽的基因的基因表达水平的特征性模式；和d)将所述模式与标准诊断模式比较，以确定指示在被研究的生物体中存在所述疾病或病症或其阶段的相关程度，标准诊断模式如上文所述用来自对应于被研究的生物体和样本的生物体的样本制备。
生成标准模式和检测模式(standard and test pattern)的方法以及诊断依赖于使用指示性寡核苷酸探针来产生基因表达数据。在某些情况下，有必要从可获得的探针的挑选中选择这些指示性探针用于特定方法，例如诊断特定疾病，可获得的探针如上文描述的探针(表1的寡核苷酸、表1来源的寡核苷酸，其互补序列以及功能性等价的寡核苷酸)。如下的方法学描述了一种用于确定这种指示性探针的便捷方法，或者更加特别地，如何从在此描述的探针中选择合适的探针子集。
用于分析特定疾病或其病症或其阶段的探针可以用大量本领域知晓的方法来鉴定，包括通过差异表达或通过文库递减(library subtraction)(参见，例如WO98/49342)。如下文所述，鉴于大多数转录物的高度信息含量，在起始点时，还可以简单地分析mRNA或cDNA种类的随机子集，并从该子集中挑选最具有指示性的探针。如下方法描述了使用被固定的寡核苷酸探针(例如本发明的探针)，来自不同样本的mRNA(或相关分子)结合到该探针上，鉴定哪种探针对于确定特定的样本类型，例如疾病样本，是最具有指示性的。
被固定的探针来源于各种不相关或相关的生物体，仅要求被固定的探针应当特异性地结合到检测生物体中的其同源配对物上。探针还可以来源于商业上可获得的或者公共的数据库，并如上所述，被固定在固体支持物上，它们被从cDNA文库中被随机挑选和分离，并被固定在固体支持物上。
被固定在固体支持物上的探针的长度应当足够长，足以特异性地结合到目标序列上。被固定的探针可以是DNA、RNA或其被改进的产物或PNA(肽核酸)形式。优选地，被固定的探针应当特异性地结合到其同源配对物上，该配对物代表了在检测生物体中被高度和中度表达的基因。便利地，所用的探针是在此描述的探针。
可以采用本领域现有技术例如如下文描述的微阵列或者巨阵列(macroarray)，或者采用在此描述的方法，生成生物样本中的细胞的基因表达模式。目前，几种技术已经被开发用于在生物样本中同时监控大量基因的表达水平，例如高密度寡阵列(high-density oligoarrays)(Lockhart等，1996，Nat.Biotech.，14，1675-1680)，cDNA微阵列(Schena等，1995，Science，270，467-470)和cDNA巨阵列(Maier E等，1994，Nucl.Acids Res.，22，3423-3424；Bernard等，1996，Nucl.Acids Res.，24，1435-1442)。
在高密度寡阵列和cDNA微阵列中，成千上万的探针寡核苷酸或cDNA被打点到玻璃载玻片或者尼龙膜上，或者被合成到生物芯片上。从检测和参考样本中分离的mRNA通过反转录用红色或绿色荧光染料标记、混合并杂交到微阵列上。洗涤后，用激光检测结合的荧光染料，产生两种影像，每种染料一种影像。获得的两种影像上的红色和绿色斑点比提供了与基因在检测样本和参考样本中的基因表达水平的变化相关的信息。可替代地，还进行了单道或多道微阵列研究。
在cDNA巨阵列中，不同cDNA被打点到固体支持物上，例如尼龙膜，相对于能够杂交到各个点上的检测mRNA的含量是过量的。从检测样本中分离的mRNA被通过反转录放射标记，并杂交到被固定的探针cDNA上。洗涤后，检测和量化与特异性杂交到固定的探针cDNA上的标记相关的信号。在巨阵列中获得的数据包含关于存在于检测样本中的转录物的相对水平的信息。巨阵列仅适合于监控有限数量的基因的表达，而微阵列可以被用于同时监控数千个基因的表达，因而是大规模基因表达研究的优选。
用于生成基因表达数据集的巨阵列技术已经被用于示例在此描述的探针确定方法。为了该目的，从感兴趣的样本中分离mRNA，用于制备标记的目标分子，例如如上所述的mRNA或cDNA。然后，被标记的目标分子杂交到固定在固体支持物上的探针。如先前所述，各种固体支持物可以被用于该目的。杂交后，未被结合的目标分子被去除，量化由目标分子杂交到固定探针上产生的信号。如果采用放射标记，用PhosphoImager来产生图片文件，该文件用于生成原始数据集。根据被选择用于标记目标分子的标记的性质，还可以使用其它设备，例如当用荧光素来标记时，可以用FluoroImager来从被杂交的目标分子中产生图片文件。
可以采用商业上可获得的用于图片分析的软件，从图片文件中获得对应于各个点的平均强度、强度中值或者信号量的原始数据。但是，由于数个因素会影响杂交信号的质量和数量，在分析之前，需要修正所获得的数据的背景信号，并标准化。例如，从样本中分离的mRNA的质量和数量在样本间变化，在各个反应过程中标记目标分子的效率的微弱变化以及非特异性结合的量在不同巨阵列之间的变化，都会在所得到的数据集中产生噪声，必需在分析前修正该噪声。
可以通过多种方法进行背景修正。斑点中的最小像素强度被用于背景消减或者斑点轮廓周围的像素线的平均值或中值可以被用于该目的。还可以根据从阴性对照中产生的信号定义代表背景强度的区域，将该区域的平均强度用于背景消减。
然后可以转化背景修正后的数据来稳定数据结构中的变异，并标准化探针强度中的差异。文献中已经描述了数种转化技术，简要综述可见于Cui，Kerr和Churchillhttp://www.jax.org/research/churchill/research/expression/Cui-Transform.pdf)。可以通过用各个斑点的强度除以巨阵列中的所有斑点或者微阵列中的一组斑点的集体强度、平均强度或中值强度来进行标准化，获得在巨阵列中杂交到固定探针上信号的相对强度。数种方法被描述用于标准化基因表达数据(Richmond和Somerville，2000，Current Opin.Plant Biol.，3，108-116；Finkelstein等，2001，In″Methods of Microarray Data Analysis.Papers fromCAMDA，Eds.Lin&Johnsom，Kluwer Academic，57-68；Yang等，2001，In″Optical Technologies and Informatics″，Eds.Bittner，Chen，Dorsel&Dougherty，Proceedings of SPIE，4266，141-152；Dudoit等，2000，J.Am.Stat.Ass.，97，77-87；Alter等2000，同上文；Newton等，2001，J.Comp.Biol.，8，37-52)。总之，首先计算出换算系数(scaling factor)或者函数，来修正强度作用，然后用于标准化该强度。也建议使用外部对照来提高标准化(normalization)。
在大规模基因表达分析中遇到的其它主要挑战为在不同时间点上进行试验中收集的数据的标准化。本发明人已经观察到，在背景修正和标准化之后，从相同试验中获得的样本的基因表达数据可以被有效地比较。但是在不同时间点上进行的试验中从样本中获得的数据，在分析之前需要进一步标准化。这是因为不同试验间的试验参数的细微差别，例如在不同时间点上提取的mRNA的质量和数量的差别，用于目标分子标记的时间、杂交时间或暴露时间的差别会影响测定值。此外，一些因素，如被研究的转录物的序列的性质(其GC含量)以及它们之间的含量决定了它们在试验过程中受多大细微变化的影响。例如，它们决定了在第一条链合成过程中，对应于特定转录物的第一条链的cDNA被转录和标记的效率，或者在杂交过程中相应的标记目标分子结合到其互补序列上的效率。在印迹过程中，各个批量之间的差别也是生成的表达数据中发生变化的主要因素。
不能适当地找出并校正这些影响，导致试验系列之间的差别会掩盖了在基因表达数据中包含的感兴趣的主要信息，即来自不同试验系列的组合数据中的差别。附

图1提供一种这样的例子，显示了根据对来自两个试验系列的组合数据的主成分分析(Principal Component Analysis)(PCA)进行的分类，其中主要目的是区分阿尔茨海默病/非阿尔茨海默病患者。
PCA(也被称作单值分解(singular value decomposition)是用于研究一组变量的依存系数和潜在关系的方法。根据一些重要因子或者主成分(principalcomponents)(PC′s)以及残数(residuals)，对这些数据建模。PC′s包含主要现象并定义存在于数据中的系统性变异性，而残数代表被视为噪声的变异性。对PCA的详细描述可见Jollife(1986，Principal Component Analysis，Springer-Verlag，NY)以及Jackson(1991，A User′s Guide to PrincipalComponents，Wiley，NY)。附图1的结果表明，形成代表来自两个试验系列而不是阿尔茨海默病/非阿尔茨海默病差别的两个簇(cluster)。这是两系列试验间共有8个样本，理想地，如果它们被恰当地标准化，应当相互指向或者相互接近。
现在，本发明人发现不同试验间的基因表达数据可以被有效地标准化，通过在下一个试验系列中包括来自一个试验系列的样本子集并采用直接标准化方法(DS)，该方法最初被Wang和Kowalski描述(Anal.Chem.，1991，63，2750和J.Chemometrics，1991，5，129-145)。虽然DS方法在分析化学领域是熟知的，其还未在基因表达数据分析领域中被描述和使用过。
在DS中，校正代表例如试验系列2的二次数据(第二次测量，R2)，与在第一次测量中测定的代表来自系列1(R1)的最初数据的数据匹配，而校准模型仍未改变。在DS中，通过转化矩阵F将两个试验系列的反应矩阵相互关联，即R1＝R2F (1)其中，F为方阵(square matrix)，基因对基因形成维(dimensioned gene bygene)。从(1)中，计算出变换矩阵(transformation matrix)为F＝R2+R1(2)用相对较小的样本子集计算方程式(2)中的变换矩阵F，所述样品根据主要的第一个和第二个系列数据(the master primary and the secondary series ofdata)测定。
最后，在第二个系列的rT2，un测定的未知样本的应答被标准化到从第一个系列预期的应答向量 v^1,unT=rT21,unF^---(3)]]>从前面的方程式可看出，转化矩阵的列i包含在第二个系列中测定的一组基因的扩增倍数(multiplication factor)，以获得在修正系列的点i上的强度。
在试验系列R1和R2中重复的样本数应当等于它们的行(rank)，在这种情况下，等于被保留用于解释R1和R2中的变化的主成分的数量。例如，如果三个主成分被保留用于解释数据集中的变化，应当在R1和R2之间重复三个样本的最小值。应当在不同系列中重复的样本，理想地应当是那些在基因表达模式中显示基因高杠杆作用(high leverages)的样本。有时，两个样本就足够了，而在其它情况下，应当包括两种以上样本，以获得更好的代表性。在有些情况下，在所有被比较的试验系列中，所选择的样本可以是相同的(参考样本)，而在其它情况下，通过在各个试验后分析表达模式继续选择代表性的样本。然后具有高杠杆作用的所选择的样本被包括在下一个试验系列中。使用直接标准化的结果被示于附图1中。
用于规格化和标准化基因表达数据集的另一种方法是将各个DNA阵列与从检测样本中制备的目标分子以及等量的从代表性的参考样本中制备的标记目标分子杂交。为了测定杂交到固定探针上的标记的目标分子的强度，有必要采用不同标记，从检测和参考样本中制备标记分子，例如不同荧光染料可以被用于制备标记材料。从参考样本中制备的标记分子可以与从检测样本中制备的标记材料一起被添加到杂交溶液中。然后获得代表检测样本和参考样本中的不同基因表达模式的来自各个阵列的数据文件，通过上述直接标准化方法规格化和标准化。在杂交过程中，来自参考样本的包括不同标记的目标分子的直接优点在于，能够有效地比较新检测样本与已经存储在数据库中的数据集。
监控大量基因在数个样本中的表达会导致产生大量数据，这些数据过于复杂，以至不容易被解释。已经证明，从这些大的数据集中提取有意义的生物学信息时，数种无监控(unsupervised)和被监控的(supervised)多元数据分析技术已经被证明是有效的。聚类分析(Cluster analysis)是迄今用于基因表达分析的最常用技术，并且已经被实施来确定以相似方式被调控的基因，并且用基因表达模式来确定新的/未知的肿瘤种类(Eisen等，1998，PNAS，95，14863-14868，Alizadeh等2000，同上文，Perou等2000，Nature，406，747-752；Ross等，2000，Nature Genetics，24(3)，227-235；Herwig等，1999，Genome Res.，9，1093-1105；Tamayo等，1999，Science，PNAS，96，2907-2912)。
在聚类方法中，基因根据其表达模式被分到功能性类别(簇)中，满足两个标准同质性(homogeneity)-相同簇中的基因在表达方面相互高度相似，和分离性(separation)-不同簇中的基因在表达方面相互之间具有低的相似性。
已经被用于基因表达分析的各种聚类技术的例子包括等级聚类(hierarchical clustering)(Eisen等，1998，同上文；Alizadeh等2000，同上文；Perou等2000，同上文；Ross等，2000，同上文)、K-平均值聚类(K-meansclustering)(Herwig等，1999，同上文；Tavazoie等，1999，Nature Genetics，22(3)，281-285)、基因修剪(gene shaving)(Hastie等，2000，Genome Biology，1(2)，research 0003.1-0003.21)、区段聚类(block clustering)(Tibshirani等，1999，Tech repot Univ Stanford.)、格子花模型(Plaid model)(Lazzeroni，2002，Stat.Sinica，12，61-86)以及自组织图(self-organizing maps)(Tamayo等1999，同上文)。此外，相关的多元统计分析方法，例如那些采用单值分解的方法(Alter等，2000，PNAS，97(18)，10101-10106；Ross等2000，同上文)或多维排列(multidimensional scaling)在减少被研究的对象的维数方面是有效的。
但是，如聚类分析和单值分解的方法是纯粹探索性的，仅提供数据中存在的内部结构的概略。它们是无监控的方法，其中在分析中不使用与被研究的类别的性质相关的可获信息。通常，特定样本中发生的生物紊乱的性质是已知的。例如，有时基因表达模式正被分析的样本是否来源于疾病或健康个体是已知的。在这种情况下，判别分析(discriminant analysis)可以被用于根据基因表达数据将样本分类到各个组中。
在这样一个分析中，通过整理数据建立分类器(classifier)，该分类器能够识别特定种类的成员或非成员。该通过整理的分类器(trained classifier)可用来预测未知样品的类别。已经在文献中描述的识别方法的例子包括SupportVector Machines(Brown等，2000，PNAS，97，262-267)、最近邻居(NearestNeighbour)(Dudoit等，2000，同上文)，分类树(Classification trees)(Dudoit等，2000，同上文)、表决分类(Voted classification)(Dudoit等，2000，同上文)、权重基因表决(Weighted Gene voting)(Golub等1999，同上文)以及贝叶斯分类(Bayesian classification)(Keller等2000，Tec report Univ of Washington)。此外，最近描述一种方法(Nguyen&Rocke，2002，Bioinformatics，18，39-50和1216-1226)，其中PLS(部分最小二乘方(Partial Least Square)回归分析被首先用来减少基因表达数据集中的维数，接着采用对数判别分析和二次(quadratic)判别分析(LD和QDA)进行分类。
基因表达数据对经典的分类示差方法(classical discriminatory method)的挑战是，相对于被分析的样本的数量，其表达被分析的基因的数量非常大。但是，在大多数情况下，仅这些基因中的小部分在示差分析问题中是指示性的。而且，存在一种危险，来自无关基因的噪声会掩盖或扭曲来自指示性基因的信息。在本领域中，多种方法已经被建议来确定和选择在微阵列研究中具有指示性的基因，例如，t-统计(Dudoit等，2002，J.Am.Stat.Ass.，97，77-87)、变异分析(Kerr等，2000，PNAS，98，8961-8965)、邻居关系分析(Neighbourhoodanalysis)(Golub等，1999，同上文)，组间与组内的平方和的比例(Ratio ofbetween groups to within groups sum of squares)(Dudoit等，2002，同上文)、非参数打分(Non parametric scoring)(Park等，2002，Pacific Symposium onBiocomputing，p52-63)以及似然选择(Likelihood selection)(Keller等，2000，同上文)。
在此描述的方法中，已经被规格化和标准化的基因表达数据用偏最小二乘回归(PLSR)来分析。虽然PLSR起初是一种用于连续数据的回归分析的方法(参见附件A)，但其也可以被用作使用基于二进制编码的虚拟反应矩阵(dummy response matrix)来建模和判别分析的方法。类别分配是根据单一的两个级别(simple dichotomous distinction)，例如乳腺癌(类别1)/健康(类别2)，或者根据基于多重疾病诊断的多级别(multiple distinction)，例如乳腺癌(类别1)/阿尔茨海默病(类别2)/健康(类别3)而进行的。用于分类的疾病的列表可以根据对应于其它疾病或病症或其阶段的可获得样本而增加。
被用作分类方法的PLSR被称作PLS-DA(Da表示判别分析)。PLS-DA是PLSR运算的扩展，其中Y-矩阵是含有n行(对应于样本数量)和K列(对应于类别数量)的虚拟矩阵(dummy matrix)。如果X的相应第i个对象属于类别k，则通过将1插入到第k列和将-1插入到所有其它列来构建Y-矩阵。通过将Y回归到X，通过选择对应于被拟合的最大成分的组来对新样本进行分类，y^(x)=(y^1(x),y^2(x),...,y^k(x)).]]>因此，在-1/1反应矩阵中，小于0的预测值意味着该样本属于被称作-1的类别，而大于0的预测值意味着该样本属于被称作1的类别。
PLSR-DA的优点在于所获得的结果容易以两种不同图形、分值和加载图形(loading plot)表示。分值图形表示样本映射到主成分上，显示样本在分类模型中的分布及其它们之间的关系。加载图形展示存在于数据集中的变量间的相关性。
通常推荐使用PLS-DA作为分类问题的起始点，这是由于其能够处理同线数据(collinear data)，以及PLSR作为维数减少技术的特性。一旦达到该目的，有可能采用其它方法例如线性判别分析，LDA，已经证明LDA在提取更多信息方面是有效的，Indahl等(1999，Chem.and Intell.Lab.Syst.，49，19-31)。这种方法基于首先用PLS-DA分解数据，然后采用分值向量(替代最初的变量)作为向LDA的输入值。关于LDA的进一步描述可见Duda和Hart(Classification and Scene Analysis，1973，Wiley，USA)。
在建模后的下一个步骤是模型确认。该步骤被认为是多变量分析中最重要的方面，并检测已经建立的校准模型的“优度”。在该工作中，一种交叉确认方法被用于确认。在这种方法中，在各个节段，搁置一个或少量样本，而模型是根据剩下的数据采用完全交叉确认来建立。然后，被搁置的样本被用于预测/分类。重复简单的交叉确认过程数次，为各个交叉确认保留不同样本，产生所谓双交叉确认过程。已经证明，这种方法对于有限量的数据来说是有效的，在本文描述的一些实施例中即是这样的。此外，由于重复交叉确认步骤数次，模型偏离和过度拟合的风险降低。
一旦校准模型被建立和确认，如本文他处所提及，可以通过现有技术中描述的用于变量选择的方法来选择具有与在模型中描述期望信息最相关的基因表达模式的基因。变量选择将有助于降低最终模型的复杂性，提供一种极其简单的模型，从而产生可被用于预测的可靠模型。此外，使用较少的基因来进行诊断，将会降低诊断产品的成本。通过这种方式，可以确定将会结合到相关基因上的指示性探针。
本发明人发现，在建立了校准模型后，基于再采样方法学的统计方法如Jackknife(Effron，1982，The Jackknife，the Bootstrap and other resampling plans.Society for Industrial and Applied mathematics，Philadelphia，USA)可以被有效地用于选择或确认重要变量(指示性探针)。
PLS回归系数B的近似不确定变量(approximate uncertainty variance)可以通过如下估计S2B=Σm=1M((B-Bm)g)2]]>其中S2B＝B的估计的不确定变量；B＝使用全部N个对象，在交叉确认A行的回归系数；Bm使用除了在交叉确认分段m中搁置的对象外的所有对象，在A行的回归系数；和g＝换算系数(scaling coefficient)(在此g＝1).
在本发明方法中，已经将Jackknife与交叉确认一起实施。对于各个变量，首先计算出被交叉确认的子模型中的B-系数Bi与全部模型的Btot之间的差异。然后计算所有子模型中的差的平方的总和，得到变量的Bi估计的差异的表达式。用t检验计算Bi估计的显著性。因此，生成的回归系数用对应于个标准偏差的不定性限定来表示，由此可以探测到重要变量。
由于该步骤已经在商业上可获得的软件The Unscrambler，CAMO ASA，Norway中实行，在此不对该步骤的实施或使用作进一步的详细描述。此外，关于用Jackknife进行变量选择的详细描述可见Westad&Martens(2000，J.Near Inf.Spectr.，8，117-124)。
如下方法被用于从基因表达数据中选择指示性探针a)在每个交叉确认分段(per cross-validation segment)中搁置一种独特(one unique)的样本(包括其重复，如果数据集中存在该重复)；b)采用PLSR-DA，用剩下的样本建立校准模型(交叉确认分段)；c)用Jackknife标准为步骤b)的模型选择重要基因；d)重复上面的3个步骤，直到数据集中的所有单个样本都被搁置一次(如步骤a所述)。例如，如果数据(data set)集中存在75种独有的样本，则建立75种校准模型，生成了不同的75组重要探针的集合；e)采用发生频率标准(frequency of occurrence criterion)，在步骤d)中生成的重要探针组中选择最重要的变量。例如，在所有组中出现的一组探针比仅在步骤d)中产生的组的50％中出现的探针更具有指示性。
一旦已经选择了一种疾病的指示性探针，则建立和确认最终模型。两种最常用的确认模型方式为交叉确认(cross-validation)(CV)和测试装置确认(test set validation)，在交叉确认中，将数据分成k个子集。然后训练该模型k次，每次搁置一个子集不用于训练，但是仅用该省略的子集来计算误差标准，RMSEP(预测的均方根误差(Root Mean Square Error of Prediction))。如果k等于样本大小，这是所谓“搁置一个(leave-one-out)”的交叉确认。仅当各个试验之间的协方差等于零的情况下，这种在每个确认分段中搁置一个和少量样本的方法才是有效的。因此，在含有重复的情形下，每次一个样本的方法(one sample at-a-time approach)不能在包含重复的情况下被调整(justified)，因为搁置所述重复之一将会在本发明方法中引入系统性偏离。在这种情形下，正确方法是一次搁置同一样本的所有重复，这将满足CV-分段之间的协方差为零的假设。
用于模型确认的第二种方法是采用分别的检测集合(test-set)来确认校准模型。这需要进行被用作检测集合的各组试验。如果可以获得真实的检测数据，该方法是优选的。
然后，最终模型被用于在检测样本中确认疾病、病症或其阶段。对于该目的，从检测样本中产生所选择的指示性基因的表达数据，然后用最终模型来确定该样本是否属于疾病的或非疾病的类型或具有一种病症或其阶段。
因而，从还有一个方面看，本发明提供鉴定可用于在生物体中诊断或鉴定或监控一种疾病或病症或其阶段的探针的方法，包括步骤a)将一组寡核苷酸探针固定在固体支持物上，优选为上文所述的寡核酸探针；b)从正常生物体的样本(正常样本)中分离mRNA，可选择地将mRNA反转录为cDNA；c)从来自生物体的样本中分离mRNA，该生物体对应于步骤(b)中的样本和生物体，已知其患有疾病或病症或其阶段(疾病样本)，可选择地将mRNA反转录为cDNA；d)将步骤(b)和(c)的mRNA或cDNA杂交到步骤(a)的所述被固定的寡核苷酸探针上；和e)评价杂交到所述寡核苷酸探针上的mRNA或cDNA的量，确定在所述正常和疾病样本中所述寡核苷酸探针结合的基因的基因表达水平，生成各个样本的基因表达数据集；f)规格化和标准化步骤(e)的所述数据；g)构建分类校准模型(calibration model)，优选采用统计方法部分最小二乘判别分析(PLS-DA)和线性判别分析(LDA)；h)进行JackKnife分析，鉴定将所述疾病和正常样本划分到其各自组中所需的那些寡核苷酸探针。
优选地，用与按照上述方法鉴定的探针相关的数据产生用于分类目的的模型。优选地，样本如先前所描述。优选地，在步骤(a)中被固定的寡核苷酸如下文所述被随机选择，或者是上文所述的探针。这种寡核苷酸具有相当的长度，例如当使用cDNA时(其被包括在术语“寡核苷酸”的范围内)。将这种cDNA分子鉴定为有用的探针，使得可以开发反映cDNA分子特异性而更容易被加工和操作的较短寡核苷酸。
然后，上述模型可以被用于产生和分析检测样本的数据，因此可以被用于本发明的诊断方法。在这种方法中，从检测样本中产生的数据提供了基因表达数据集，该数据集如上述被规格化和标准化。然后，将该数据集拟合到上述校准模型中，进行分类。
在此描述的方法还可以被用于同时选择数种相关和不相关疾病或病症的指示性探针。根据哪些疾病或病症已经被包括在校准或整理集合(trainingset)中，为所述疾病或病症选择指示性探针。为一种疾病或病症选择的指示性探针可以与为另一种感兴趣的疾病或病症选择的指示性探针相似或不相似。所选择的基因在疾病、病症或其阶段的过程中彼此相对表达的模式，可确定这些基因是否所述指示疾病、病症或其阶段。
也就是说，根据在由所研究的疾病、病症或其阶段产生的反应的影响下，指示性基因的表达如何与其它所选择的指示性基因的表达相关，来选择指示性基因。在下文提供的实施例1和2中，通过整理(training)代表乳腺癌/非乳腺癌样本或者阿尔茨海默病/非阿尔茨海默病样本的1435种或758种随机挑选的cDNA克隆的基因表达数据集，选择139种指示性探针用于乳腺癌的诊断，选择182种探针用于阿尔茨海默病的诊断。在选择用于乳腺癌和阿尔茨海默病的探针中，约10种探针均指示乳腺癌和阿尔茨海默病的诊断。
为了分离指示性探针或同时鉴定数种相关和不相关的疾病、病症及其阶段，基因表达数据集必须包含关于当患者患有所研究的特定疾病、病症或其阶段时，基因如何被表达的信息。从一组健康的或疾病的样本中产生数据集，其中特定样本可能含有仅一种疾病、病症或其阶段的信息，或者也可能含有关于多种疾病、病症或其阶段的信息。例如，如果为了分离阿尔茨海默病、乳腺癌和糖尿病的指示性探针，可以从患有乳腺癌和糖尿病的阿尔茨海默病患者中获取全血样本。因此，该方法还教导一种用于减少分离指示性探针所需的样本的数量的有效试验设计方法，通过选择代表不只一种疾病、病症或其阶段的指示性探针。
如先前所提及，鉴于大部分转录物的高信息含量，用于诊断、监控或鉴定特定疾病、病症或其阶段的指示性探针的鉴定和选择可能被显著地简化。因此，在其中进行选择以鉴定指示性探针的基因集合被根本性地简化。
不同的是，在现有技术中，例如在微阵列中，从在细胞中被表达的数千基因的群体中选择指示性探针，而在此描述的方法中，从有限量的随机获得的基因中选择指示性探针。例如随机从人全血cDNA文库中挑选的1435个cDNA克隆的群体中，可以选择用于乳腺癌诊断的139种指示性探针(参见实施例1和表2)。
因此，在上面提及的鉴定用于诊断或鉴定或监控生物体中的疾病或病症或其阶段的探针的方法的一个优选方面，在步骤(a)中被固定的所述一组寡核苷酸随机选自较大组的寡核苷酸，例如选自cDNA文库或其它寡核苷酸集合，该集合可以、但是优选不是选自在此提供的组。优选地，所述较大组包括对应于被中度或高度表达的基因的寡核苷酸。因此，优选地，在本发明的方法中，按照本发明的寡核苷酸组用随机选自例如商业上可获得的寡核苷酸或cDNA文库的一组寡核苷酸替换。
如在此提及，“随机”是指基于转录物相对于疾病、病症或所研究的生物体所携带的信息程度，未被偏离的选择，即不存在朝向可能被用作为指示性探针的偏向。可以从转录物(或相关产物)的集合中进行随机选择，该集合已经偏向例如高度或中度表达的转录物，优选地，从未偏离的或者通过基于序列标准选择的转录物集合中进行随机选择。因此，较大的集合可能含有对应于高度和适度表达的基因的寡核苷酸，或者可替代地，富集那些对应于高度和适度表达的基因的寡核苷酸。
可以通过各种方式，从高度和适度表达的基因中进行随机选择。在该工作中采用的策略，但是完全无限制，包括从用所研究的生物学样本中构建的cDNA文库中随机挑选大量cDNA克隆。由于在cDNA文库中，对应于以高度或中度量存在的转录物的cDNA克隆以比对应于低量存在的cDNA的转录物更高的频率存在，前一种cDNA克隆倾向于较后一种cDNA克隆更频繁地被挑选。富集对应于被高度和适度表达的基因的富集的cDNA集合可以通过这种方法来分离。
为了在用于本发明的方法中的分离群体中鉴定被以高度或中度含量表达的基因，可以用数种现有技术产生关于感兴趣的样本中的转录物的相对含量的信息。非基于序列的方法如示差展示或RNA指纹以及基于序列的方法如微阵列或巨阵列都可以被用于该目的。可替代地，可以设计被高度和适度表达的基因的特异性引物序列，可以使用方法如定量RT-PCR来确定被高度和适度表达的基因的水平。因此，熟练的操作人员可以采用本领域知晓的各种技术来确定生物学样本中的mRNA的相对含量。
特别地，优选用于在上述方法中分离mRNA的样本如先前所描述，并且优选不是来自疾病部位，而且所述样本中的细胞不是疾病细胞并且未与疾病细胞接触过。
如下实施例仅为了进一步阐述而给出，其中提及的附图如下
附图1显示直接标准化(DS)对在两个不同系列试验中测定的阿尔茨海默病数据的影响，其中AD表示阿尔茨海默病样本和A，B是非阿尔茨海默病样本。两个系列中的样本被系统地标记为(xx_7/xx_8)，而来自系列8(在b，c，d中)的修正样本被标记为(xx_c)，因此，例如，AD2-7表示在试验系列7中编号2的阿尔茨海默病样本。画圈的斑点表示被选择作为转移样本(transfersample)的样本。附图b，c，d中的连线表示重复样本在应用DS后的接近程度。附图a，c，d中的虚线表示划分类别的判别边界。这些不是根据任何统计标准画出的，只是起在视觉上划分类别的目的。所有四张附图都显示来自(a)基于非标准化数据的PCA分析的分值图形(PC1-PC2)，(b)使用3种转化样本直接标准化后的分值图形，(c)使用4种转化样本直接标准化后的分值图形，(d)使用8种转化样本直接标准化后的分值图形；附图2显示将正常的(包括良性的)和乳腺癌的样本映射到用44种指示性基因通过PLSR-DA产生的分类模型上，其中PC为主成分，而N和C分别为正常和乳腺癌样本；附图3显示将患有和未患有阿尔茨海默病的个体映射到用182种指示性基因通过PLSR-DA产生的分类模型上；附图4、6和8显示如附图2的映射图形，其中分类模型分别用719种、111种和345种cDNA产生，其中PC是主成分，N表示正常的样本，而B表示乳腺癌样本；附图5、7和9显示分别用719种、111种和345种cDNA的数据产生的基于3种主成分的预测图形。
附图10显示如附图3的映射图形，其中分类模型用520种cDNA产生；和附图11是对应于附图10的预测图形。
实施例1乳腺癌的诊断方法从乳腺癌患者和具有良性肿瘤的患者的手臂上采集全血(挪威的Ullev_l医院和Haukland医院)。所有患有乳腺癌的患者都具有恶性乳腺肿瘤(疾病样本)。从上面的两个医院中收集健康的血液，或者在挪威的 或者DiaGenicAS的护理站，从未报导有乳腺癌体征的雌性供体的手臂上收集健康血液。来自健康个体或者具有良性肿瘤个体的血液包括正常样本。将血液收集到含有EDTA的试管中并立即存储在-80C，或者被收集到PAXgene试管中，在室温下存储12-24小时，最后在使用前将它们存储在-80℃。表5提供对被采集血液的乳腺癌患者和良性肿瘤患者的进一步描述。
从29位乳腺癌患者和46位正常供体的血液中分离mRNA，在存在α33P-dATP时，通过反转录制备标记探针。正常和疾病样本的第一链cDNA分别结合到固定在固体支持物(尼龙膜)上的1435种cDNA克隆上。没有这些cDNA克隆的基因序列的任何现有知识，从用550位健康个体的全血构建的cDNA文库中随机挑选这些克隆(Clontech，Palo Alto，USA)。这些方法按如下进行。
对于插入物的扩增，将细菌性克隆培养在含有150μl具有50μg/ml羧苄青霉素的LB的微量滴定板中，在37℃搅拌培养过夜。用50μl水稀释5μl的各种培养物，并在95℃培养12分钟，以溶解细胞。在存在1.5mM MgCl2时，用20pM的M13正向引物和反向引物对2μl的该混合物进行PCR反应。用如下的循环方案进行PCR反应95℃4分钟，接着在RoboCycler_Temperatue Cycler(Stratagene，La Jolla，USA)或DNA Engine Dyad PeltierThermal Cycler(MJ Research Inc.，Waltham，USA)中进行25个循环的94℃1分钟，60℃1分钟和72℃3分钟。通过用NaOH(0.2M，最终浓度)培养30分钟来使扩增产物变性，并用MicroGrid II工作台按照生产商的推荐(BioRoboticsLtd，Cambridge Egland)将其打点到Hybond-H+膜(Amersham PharmaciaBiothech，Little Chalfont，UK)上。被固定的cDNA用UV交联剂(HoeferScientific Instruments，Sanfrancisco，USA)固定。
除了1435种cDNA，印迹的阵列还含有用于评价该分析的背景水平、一致性和灵敏性的对照。这些对照被打点在多个位置上，包括对照例如PCR混合物(物任何插入物)；SpotReportTM10阵列确认系统(Stratagene，La Jolla，USA)的阳性和阴性对照以及对应于组成性表达的基因例如b-肌动蛋白、g-肌动蛋白、GAPDH、HOD和亲环蛋白的cDNA。此外，对应于SIX1、b-微管蛋白、TRP-2、MDM2、肌球蛋白轻链C(Myosin Light C)、CD44、乳腺丝抑蛋白、层粘连蛋白和SRP 19的寡核苷酸被包括在检测分散的癌症细胞。
来自被收集的EDTA试管中的血液的总RNA用Trizol LS Reagent方案(Invitrogen/Life Technologies)纯化。按照供应商的推荐(PreAnalytiX，Hombrechtikon，Switzerland)，从包含在PAXgene试管中的血液纯化总RNA。用不含DNA的试剂盒(Ambion，Inc.Austin，USA)，通过DNAase I处理从分离的RNA中去除污染DNA。在琼脂凝胶电泳后，通过检查28S和18S核糖体条带的完整性，从视觉上确定RNA质量。
通过测定260nm和280nm下的吸光率，确定被提取的RNA的浓度和纯度。用Dynabeads按照生产商的推荐(Dynal AS，Oslo，Norway)，从总RNA中分离mRNA。
分批进行标记和杂交试验。在各个批量中分析的样本的数量在6-9个之间变化。在样本被分析一次以上(平行重复)的情况下，来源于同一mRNA集合的等分试样被用于探针合成。对于探针合成，对应于4-5μg总RNA的mRNA的等分试样与oligod T25NV(0.5μg/ml)以及SpotReportTM10的阵列确认系统的mRNA峰(10Pg；峰2，1pg)混合，加热到70℃来去除二级结构，然后在冰上冷却。从存在50μCi[α33P]dATP，3.5μM dATP，0.6mM各种dCTP、dTTP、dGTP，200个单位的SuperScript反转录酶(Invitrogen，LifeTechnologies)和0.1M DTT时，通过反转录在35μl的反应混合物中制备探针，在42℃标记1.5小时。合成后，通过在70℃加热10分值来灭活酶，在37℃在4个单位Ribo H (Promega，Madison USA)中培养反应混合物20分钟来去除mRNA。用ProbeQuant G 50柱(Amersham Biosciences，Piscataway，USA)去除未被掺入的核苷酸。
杂交前，于室温在4×SSC中平衡膜2小时，并且在65℃下，在10ml的预杂交溶液(4×SSC，0.1M NaH2PO4，1mM EDTA，8％硫酸葡聚糖，10×denhardt溶液，1％SDS)中预杂交过夜。将新制备的探针添加到5ml的同一预杂交溶液中，在65℃下继续杂交过夜。在65℃下，在逐渐升高的严紧度下洗涤膜(2×30分钟。每次在2×SSC，0.1％SDS；1×SSC，0.1％SDS；0.1×SSC，0.1％SDS中进行)，以除去非特异的信号。
用Phospholmager评价和量化结合到各个点上的被标记的第一链cDNA的含量，生成基因表达数据集。该数据用Phoretix软件版本3(Non LinearDynamics，England)生成。从各个点获得的总强度中减去各个点轮廓周围的像素的线的中值对生成的数据进行背景消除(background substration)。
然后通过从各个膜上选择出50个最弱和50个最强信号，标准化(normalized)和转化减去背景后的数据。该步骤是排除高度变异表达的基因。由于膜与膜之间的基因是不同的，从数据集中去除来自497种基因的表达数据。然后，用不同方法例如外部对照，标准化剩余的938种基因的数值，将各个点除以各个膜中的观察信号的中值强度，排列标准化来自各个膜的数据，然后以对数(log)转化得到的数据。
然后，上述获得的被加工的数据被用于分离指示性探针，通过a)在每个交叉确认分段(per cross validation segment)中搁置一个独特的样本(包括所选择的样本的全部重复)；b)用PLSR-DA在剩余样本上建立校准模型(calibration model)(交叉确认的)；c)采用Jackknife标准，为步骤b的模型选择重要的基因集合；d)重复步骤a)，b)和c)，直到所有独特样本被搁置(keep out)一次(因此，全部75种不同校准模型建立了(在重复步骤b后)75次)，产生75种不同组的重要探针(在重复步骤c后)75次)；e)采用发生频率标准(frequency of occurrence criterion)，在75种不同组的重要探针中选择重要变量。
基于发生频率标准选择的指示性探针被用于构建分类模型。基于在如上所述分离指示性探针的步骤之后生成的集合的至少90％中出现的探针的分类模型的结果被示于附图2中，其中这些基因的表达模式能够将大部分患有乳腺癌的妇女和未患有乳腺癌的妇女划分到不同组中。在该附图中，PC1和PC2表示两种在统计学上来源于该数据的主成分，其最佳地定义存在于该数据中的系统性变异。这使得每种样本，以及来自与样本的标记的第一链cDNA结合的每种指示性探针的数据作为单一的点被呈现在分类模型上，这是将样本映射到主成分-分值图形上。
通过双交叉确认方法(double cross-validation approach)，可确定基于分离的指示性探针的生成的模型预测其它样本的能力。根据发生频率标准进行的对乳腺癌的诊断性检测被呈现在表6中。
实现了对大部分乳腺癌细胞的正确预测。这包括从患有原位导管癌(DCIS)的妇女中获得的所有三个样本、11/15个从患有I期乳腺癌的妇女中获得的样本，全部五个从患有II期乳腺癌的妇女在中获得的样本，以及从两个患有III期乳腺癌的妇女在中获得的一个样本。有趣的是，两个正确预测的I期样本从具有直径＜5mm的肿瘤的妇女中获得。
该模型还正确预测大部分非癌症样本的类型(41/46)，包括那些从患有非癌症性乳腺异常的妇女中获得的样本。
通过数种证据确认该基因转录物不是来源于分散的疾病细胞。第一，指示性基因在妇女的血液细胞中被高水平或中度水平组成性地表达，而无论该妇女是否患有癌症或未患有癌症。第二，在该实施例中描述的分析中，为了鉴定转录物，在血液样本中需要至少720个分散的细胞(disseminated cell)。因为在乳腺癌的不同阶段中存在的分散细胞的平均数量更加低(器官限制性乳腺癌，0.8细胞/ml；仅扩散到淋巴结中的侵入性乳腺癌，2.4细胞/ml；和转移性乳腺癌，6细胞/ml；SD＞100％)(29)，本发明人认为，被检测的信号来源于外周血细胞，而不是来源于分散的细胞。第三，本发明人未能检测到任何来自八个癌症标记的信号，已知这些标记在恶性癌细胞中的表达被提高，包括分散在血液中的细胞。
实施例2阿尔茨海默病的诊断用来自阿尔茨海默病的患者的样本进行类似的试验。在这种方法中，在Ullev_l大学医院的记忆力门诊部(Memory Clinic)中被诊断患有阿尔茨海默病的7位患者被用于该试验中。基于如下标准确认患者患有阿尔茨海默病*用IQCODE、ADL标准(scale)和测量患者的行为的标准(Green scale)与护理人员进行的标准会晤*用MMSE、画圈测试(Clock drawing test)、轨迹测试(Trailmaking test)A和B(TMT A和B)，Kendrick目标学习测试(视觉记忆测试)、部分Wechsler量表(battery)和Benton测试，进行神经心理学评价*用检测抑郁症的标准进行精神病学评价，MADRS用于会见患者和Cornell标准用于会见护理人员*身体检查*实验室检测血液样本以排除其它疾病*大脑CT扫描*大脑SPECT患者的平均年龄为72.3岁，年龄范围在69-76岁。平均MMSE值为22.0(可获得的最大值为30)。
六名年龄相符的未被诊断为阿尔茨海默病的个体被用作对照。他们都进行了MMSE测试，具有为28的最低分(平均分为28.4)。正常对照组的平均年龄为73.0岁，年龄范围在66-81岁。来自16岁的个体的样本，其患阿尔茨海默病的概率最小，也被作为额外的对照。
采用上述的方法(除了杂交到758个cDNA克隆上，而不是杂交到1435个cDNA克隆上)，根据发生频率标准选择指示性的探针，用于构建分类模型。在用该方法分离指示性探针后，基于探针在生成的集合中至少出现一次的分类模型的结果被显示在附图3中，其中可以看出，这些基因的表达模式能够将患有和未患有阿尔茨海默病的个体划分到不同组中。在该附图中，PC1和PC2表示两种在统计学上来源于该数据的主成分，其最佳地定义存在于数据中的系统性变异。这使得各样本，以及来自样本的cDNA所结合的各指示性探针的数据作为单一的点被呈现在分类模型上，这是将样本映射到主成分上-即形成分值图形。
通过双交叉确认方法，确定基于分离的指示性探针的生成的模型预测其它样本的能力。根据发生频率标准进行的对阿尔茨海默病的诊断性检测被呈现在表7中。
附件A偏最小二乘回归(partial least squares regression)(PLSR)将多变量回归模型定义为Y＝XB+F其中X为具有N个预测变量(基因)的N×P矩阵；Y(N×J)为第J个被预测的变量。在这种情况下，Y表示含有虚拟变量的矩阵；B为回归系数的矩阵；和F为残数的N×J矩阵。
PLSR模型可以被写成X＝TPT+EA′和Y＝TQT+FA′其中T(N×A)是分值向量矩阵，该向量与x-变量线性相关(linear combination)；P(P×A)具有x加载向量(x-loading vector)pa为列的矩阵；Q(J×A)具有y加载向量(y-loading vector)qa为列的矩阵；
Ea(N×P)为考虑因素A后的X的矩阵；和Fa(N×J)为考虑因素A后的Y的矩阵。
PLSR中的标准是最大化被解释的[X，Y]的协方差。这通过加载加权向量(weights vector)wa+1来实现，wa+1是EaTFaFaTEa的第一个特征向(eigenvector)(Ea和Fa是考虑一种因素或PLS成分后的收敛(deflated)的X和Y。
回归系数通过如下获得B＝W(PTW)-1QT满秩的PLSR模型，即最大数量的成分(maximum number ofcomponents)，相当于MLR方案。对PLSR的进一步描述可见Marteus&Naes，1989，Multivariate Calibration，John Wiley&Sons，Inc.，USA和Kowalski&Seasholtz，1991，同上文。
实施例3实施例1的对乳腺癌的诊断的确认通过将实施例1中确定的指示性探针用于新的乳腺癌和对照样本，来确认实施例1的结果。
方法采用实质上如在实施例1中所述的方法。同如表8中描述的，从患者中采集血液。但是，将血液收集在PAXgene试管中，而第一链标记的cDNA与如实施例1中描述的其它对照一起杂交到被打点在尼龙膜上的719种cDNA上。在用对照斑点消除背景后，用内部分位数排列(inter quantile range)标准化各个膜的数据。如实施例1中所述分析数据，通过交叉确认(crossvalidation)证实该模型。
被打点的719种cDNA是在实施例1中被打点的cDNA的子集，包括111种在表2中描述的cDNA，并且它们在实施例1中被发现具有指示性。结果结果被显示在附图4-9中。附图4、6和8是类似于附图2的映射图形，显示将正常和乳腺癌患者的样本映射到用全部719种cDNA生成的分类模型上。附图6是类似的，但是采用由111种与实施例1共有的探针生成的分类模型。附图8使用719种序列中的345种，这719种序列的序列信息已在此提供。在各种情况下，划分正常组和乳腺癌组都是可能的。附图5、7和9显示反映生成的模型正确诊断乳腺癌的能力的预测图形。在所示的3个预测图形中，疾病样本出现在x轴的+1处，而非疾病样本出现在-1处。y轴描述被预测的类别的关系。在预测过程中，如果预测是正确的，则疾病样本应当在0以上，而非疾病样本应当在0以下。在各种情况下，几乎所有样本都被正确地预测。
实施例4实施例2的对阿尔茨海默病诊断的确认通过将实施例2中确定的指示性探针用于新的阿尔茨海默病患者样本，来确认实施例2的结果。
方法采用实质上如在实施例2中所述的方法。
12名在Ullev_l大学医院的记忆力门诊部被诊断患有阿尔茨海默病的女性患者被用于该试验中，根据实施例2的标准，这些患者被确认患有阿尔茨海默病。患者的平均年龄为72.3岁，年龄范围为66-83岁。平均MMSE值为22.0(可以得到的最大值为30)。
16名未被诊断患有阿尔茨海默病的年龄相符的女性个体被用作正常的对照组。都进行了MMSE测试，具有29的最小值。正常对照组的平均年龄为74.0岁，年龄范围为66-86岁。
在将血液转移到PAXgene试管后，按照生产商的推荐(PreAnalytiX，Hombrechtikon，Switzerland)，从阿尔茨海默病的血液和对照组供体的血液中分离总mRNA。存在α33P-dATP时，在反转录过程中标记被分离的mRNA，得到被标记的第一链cDNA。
如先前所述杂交到730种cDNA克隆上，这些克隆是从来自550位健康个体的全血的cDNA文库中挑选出来的，这些随机的cDNA克隆的基因序列是未知的。
结果结果被显示在附图10和11中。附图10是用520种已经被测序的探针生成的映射图形。附图11是预测图形，显示几乎所有样本都被正确预测。
表1a用于疾病诊断的指示性探针的列表
表1b用于疾病诊断的指示性探针的列表请参照脚注
注表1中如下序列序号的序列没有提供，并且这些序列序号也对应于表2和4中的序列序号
298，301，305，307，312，317，318，319，320，332，333，334，336，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，367，372，375，376，377，379，385，392，393，404，437，439，440，443，444，445，449，455，457，465，466，467，468，470，486，498，501，511，514，516，517，520，522，528，531，535，547，548，549，550，551，552，553，554，555，556，557，558，559，573，584，604，608，616，620，623，640，659，662，664，667，668，673，677，678，679，681，695，702，712，716，825，886，894，902，909，916，1101，1108，1109，1177，1187，1193，1204，1220，1239，1255，1256，1342，1347，1354，1357，1362，1363，1364，1373，1375，1379，1403，1404，1405，1406，1413
表2a用于乳腺癌诊断的指示性探针列表
表2b用于乳腺癌的指示性探针的序列列表请参照表1的脚注。缺少一些序列。

表3根据在可变选择(variable selection)中发生频率(occurrence criterion)选择的用于乳腺癌诊断的指示性探针(克隆序号)的列表
*100％＝在所有75个交叉确定模型中出现的基因；90％＝在75个交叉确定模型中至少68个中出现其它基因；5％＝在75个交叉确定模型中至少4个中出现其它基因，等等。
表4a用于阿尔茨海默病诊断的指示性探针列表
表4b用于阿尔茨海默病的指示性探针序列的列表请参考表1的脚注
表5样本
*在月经后的第1，2，3，4，5周从一名妇女身上采集的全血。因此，在实验中所检测的特定正常/良性样本数为75。患有乳腺癌的妇女的信息
存在于所检测的妇女中的其它疾病/病症存在于所检测的妇女中的其它疾病/病症
所检测妇女中的癌症病史
表6通过双交叉确定(double cross validation)检测的样本数以及通过所选择的指示性基因诊断乳腺癌的成功率通过双交叉确定所检测的样本数
根据所选择的指示性基因诊断乳腺癌的成功率
*100％＝在所有75个交叉确定模型中出现的基因；90％＝在75个交叉确定模型中至少68个中出现其它基因；5％＝在75个交叉确定模型中至少4个中出现其它基因，等等。
表7根据182个指示性基因的表达，成功诊断阿尔茨海默病的双交叉确定(Double cross-validation)以及诊断检测的详细情况确定结果 诊断试验的成功
表8血液供体的一些相关情况B，患有乳腺癌的雌性供体；N，乳腺照片(mammogram)存在疑问，但没有乳腺癌的雌性供体；IDC，侵入性导管腺癌(invasive ductal carcinoma)；DCIS，原位导管腺癌；na，未获得nd，未检测到；++，mRNA没有降解并且在样本中没有核糖体污染，+，mRNA没有降解但样本中有核糖体污染。
表9同时指示阿尔茨海默病和乳腺癌的探针的序列列表
序列表序列序号-93nt405GGATCCTGTGGCCCACAGAGCTGCCCCAGCAGACGCTCCGCCCCACCCGGTGATGGAGCCCCGGGGGGACAATCGTGCCTGGGGAGGAGCAGGGTACAGCCCATTCCCCCAGCCCTGGCTGACCTGGCCTAGCAGTTTGGCCCTGCTGGCCTTAGCAGGGAGACAGGGGAGCAAAGAACGCCAAGCCGGAGGCCCGAGGCCAGCCGGCCTCTCGAGAGCCAGAGCAGCAGTTGAATGTAATGCTGGGGACAGGCATGCTGCCGCCAGTAGGGCGGGGACCCGGACAGCCAGGTGACTACCAGTCCTGGGGACACACTCACCATAAACACATCCCCAGGCAGGACAGATCGGGGAAGGGGTGTGTACCAGGCTATGATTTCTCTTGCATTAAAATGTATTATTATT序列序号-108nt550GGCTTTGACAGAGTGCAAGACGATGACTTGCAAAATGTCGCATCTGGAACGCAACATAGANACCATCATCAACACCTTCCACCAATACTCTGTGAAGCTGGGGCACCCAGACACCCTGAACCAGGGGGAATTCAAAGAGCTGGTGCGAAAAGATCTGCAAAATTTTCTCAAGAAGGAGAATAAGAATGAAAAGGTCATAGAACACATCATGGAGGACCTGGACACAAATGCAGACAAGCAGCTGAGCTTCGAGGAGTTCATCATGCTGATGGCGAGGCTAACCTGGGCCTCCCACGAGAAGATGCACGAGGGTGACGAGGGCCCTGGCCACCACCATAAGCCAGGCCTCGGGGAGGGCACCCCCTAAGACCACAGTGGCCAAGATCACAGTGGCCACGGCCACGGCCACAGTCATGGTGGCCACGGCCACAGCCACTAATCAGGAGGCCAGGCCACCCTGCCTNTACCCAACCAGGGCCCCGGGGCCTGTTATGTCAAACTGTCTTGGCTGTGGGGCTAGGGGCTGGGGCCAAATAAAGTCTCTTTCTCC序列序号110ACGAAGACAGACATCTGTGGAATGATTCACATCCTCTCAAGTTAGGAGGATGGAGGCCTGCTTCATTAAGAAGCTGGGGGTAGGGTGGGGGTGGGGAGAACACTTAACAACATGGGGACCAGTCAGGGGAATCCCCTTATTTCTGTTTTGCATATGAGGAACCCTAGAGCAGCCAGGTGAGGCTCTCTAGTTTAATAAAAATCATGGAAAGACTCTTAATGCAGACTCTTCTTAAGTGTTAATAGGGATTTTTTCAGCTTATTTTGGTTGCAGTTTCCAATTTTTAAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTGTAGATGCATTAGTGTTGAACCAATGCTTTCTCATGTCTCAATTCTTTGTATATGCATTCTTTTCAGATGTATTAAACAAACAAAAACCCTTC序列序号-192nt286CCGGTAATAGAATAGAAAAGGGAGAGTGTCTTCATGCAATGTGGCATCCTGGATTGGGTCTCGNNACAAAAACAGGACATTAGTGGGAAAATTGGAAATCTGAAAAAAGTCTGAATTTTAGTTAATATACCAATTTCAGTCTCTTGGTTTTGACAGATGTACCATGGTGATGTAAGATGTTGACCTTGGGGTAGGCTGGGTGAAGGGTATACAGGAACTCTTTGTACTATCTCTGCAACTTCTCTGTAAATCTAGTATCATTCCAAAATAAAAGTTTATTTAATTT序列序号250
GTGGAAGTGACATCGTCTTTAAACCCTGCGTGGCAATCCCTGACGCACCGCCGTGATGCCCAGGGAAGACAGGGCGACCTGGAAGTCCAACTACTTCCTTAAGATCATCCAACTATTGGATGATTATCCGAAATGTTTCATTGTGGGAGCAGACAATGTGGGCTCCAAGCAGATGCAGCAGATCCGCATGTCCCTTCGCGGGAAGGCTGTGGTGCTGATGGGCAAGAACACCATGATGCGCAAGGCCATCCGAGGGCACCTGGAAAACAACCCAGCTCTGGAGAAACTGCTGCCTCATATCCGGGGGAATGTGGGCTTTGTGTTCACCAAGGAGGACCTCACTGAGATCAGGGACATGTTGCTGGCCAATAAGGTGCCAGCTGCTGCCCGTGCTGGTGCCATTGCCCCATGTGAAGTCACTGTGCCAGCCCAGAACACTGGTCTCGGGCCCGAGAAGACCTCCTTTTTCCAGGCTTTAGGTATCACCACTAAAATCTCCAGGGGCACCATTGAAATCCTGAGTGATGTGCACTGATCAAGACTGG序列序号299CAGCGCAGGGGCTTCTGCTGAGGGGGCAGGCGGAGCTTGAGGAAACCGCAGATAAGTTTTTTTCTCTTTGAAAGATAGAGATTGNTACAACTACTTAAAAAATATAGTCAATAGGTTACTAAGATATTGCTTAGCGTTAAGTTTTTAACGTAATTTTAATAGCTTAAGATTTTAAGAGAAAATATGAAGACTTAGAAGAGTAGCATGAGGAAGGAAAAGATAAAAGGTTTCTAAAACATGACGGAGGTTGAGATGAAGCTTCTTCATGGAGTAAAAAATGTATTTAAAAGAAAATTGAGAGAAAGGACTACAGAGCCCCGAATTAATACCAATAGAAGGGCAATGCTTTTAGATTAAAATGAAGGTGACTTAAACAGCTTAAAGTTTAGTTTAAAAGTTGTAGGTGATTAAAATAATTTGAAGGCGATCTTTTAAAAAGAGATTAAACCGAAGGTGATTAAAAGACCTTGAAATCCATGACGCANGGAGAATTGCGCATTTAAAGCCTAGTTACGCATTTACTAAACGCAGACGAAAATGGGAAGATTAATTGGGAGTGGTAGGATGAAACAATTTTGGAGAAGATAGAAG序列序号300CTCAAAGGAGAAAAAAAACCTTGTAAAAAAAGCAAAAATGACAACAGAAAAACAATCTTATTCCGAGCATTCCAGTAACTTTTTTGTGTATGTACTTAGCTGTACTATAAGTAGTTGGTTTGTATGAGATGGTTAAAAAGGCCAAAGATAAAAGGTTTCTTTTTTTTTCCTTTTTTGTCTATGAAGTTGCTGTTTATTTTTTTTGGCCTGTTTGATGTATGTGTGAAACAATGTTGTCCAACAATAAACAGGAATTTTATTTTGCTGAGTTGTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA序列序号302AGTAGAGACGGGGTTTCACTGTGTTAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCCGGCCACCTCGGCCTCCCGAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACGGCGCCCAGCCCCAGCCTGTCACTTAAACTGATAAACGACAGATTAACAGTAGAAAAATTTTATTTTGCATACATAATGAGGCTTCACAAAAGAGAAGTGAAAACCCAAGTAG
GAGTTTAGGGCTGGGGGCTTATATACCATTTAACAAGGGGTGATAAATTGTAAGAGAATAG序列序号304TCCTTGGTTTCGATTTGTGGCAACAATCCAGTCTTTTTGTTTTTTTCAGGGATACCATATGTAACAGGTGCCATTGTTACTGTAACTTTTCACACATGCCTTCAGTTTGATGTCAAAGTCATCATTTAGTGTAAACAGCAAGTTATCTGTTAGGCTGCACATCATGAACTTTACTTTTAGAAAGTCTTATCTTTTATGCCACAGAAATAGCATTTGGCTATTAGTCATGGATGGCAAAGAAATTAATTTTGAGTTGTTTGGATAAAAATGTTTCAGTTGACTGTAGTGTGTATTGAGAGACACTGCCAGTAAACAAACTCTCTTGGTAGGTGGAAATCCCCTAGAAGTTACAGAAAATTGGGAGGAGGTGAACTTAATTAAATAACTTGAATTGTTTAGACATATTCAGAGCTTCTTATGACCTTGAAGAAATCACCCAACTTCAAAAGACCTCGGTTTCTTCATTTGTAAAATTAGGGAGTTTGACTAGATGTGTAAATCTAGTTGTTAGTTAACTTCTAAGATGTAAAAACCCTCTTGTTTAACAAAAACCTACAAGATCAAGTTGCTTATCTGAAATCTTTATGAATCAACACTAGTCACTAAGTCTAGCTCGACC序列序号306CTTTTCCTCCCGCTGTCCCCCACGGAGGGGACTGCTCTCCCCCGCTGCATCCTTTCTGTGAGGTACCTTACCCACCTCAGCACCTGAGAGGGTGAAATAGAATTCTAACCTCGACATTCGGGAAGTGTTTTTGAGAAGTCTCGGTCGGTAAGGGAAGTCTTCCAAGTCCGTGCAGCACTAACGTATTGGCACCTGCCTCCTCTTCGGCCACCCCCCAGATGAGGCAGCTGTGACTGTGTCAAGGGAAGCCACGACTCTGACCATAGTCTTCTCTCAGCTTCCACTGCCGTCTCCACAGGAAACCCAGAAGTTCTGTGAACAAGTCCATGCTGCCATCAAGGCATTTATTGCAGTGTACTATTTGCTTCCAAAGGATCAGGCCCTGAGAACAATGACCTTATTTCCTACAACAGTGTCTGGGTTGCGTGCCAGCAGATGCCTCAGATACCAAGAGATAACAAAGCTGCAGCTCTTTTGATGCTGACCAAGAATGTGGATTTTGTGAAGGATGCNCATGAANAAATGGACNAGCTGTG序列序号-308nt373AAGTGGGTCTTGCCATCCCTGAACTGNAATCATCCCTAACATATTCATACCTGTTTTCATTTTAAAAGTTGGGTCAGTTTTTTTATTAGTACATGTATTTCTATCCTACTGATTTATTTGCTATATCATCTAATTTAGTTTGAATATTCCATAATTTACTTAATTAGTCCTGTATGGAGACCTAGCTCTTCTCAGTGTCTACTATTATAAACAATGCTACAGTGAATATTGGTGNATAAATCCATACNCACCACGTACATATCTTAAGTTCTGGAAGAGATATTGCTAAACCAGAAGATAACCTGCATTTAAAATTTGACTGCTAGGGNCAGGGNCACATTTAATTAAATTAGAACAANGAATGCATAATGNC
序列序号309CCGGAATCGCGGCCGCGTCGACGAAAATATGTGCCCTGGCCAACTCCACAGGACTAGTTCTAGGCAATCTGAAGGAAACCAGAAAATGTGAATTTCTCTTCCCTCAAAAAGCTATACTGAAGTAGTATTTAATATTCAAGTACTTGTAAATTTGCAGAACAGTACTTTTTAATTTGACCCATGAATTCTATTTAAATTTGTCACTTAATATTTAGCCAAGAAGCAAACCATCTAAAAAGATTTCTGGTTTATTTCTCCAACTCCTAATAAATAGGGTCACATATTTTTTAACTTTTTTCTAATTTGAAAAGTAATACAGGCATATGGTATTTTAAAAATGAAACAACACAAAGGGATATGTTTTGAAAAGTGGTCTTGCCATCCCTGAACTGTAATCATCCCTAACATATTCATACCTGTTTTCATTTTAAAAGTTGGGTCAGTTTTTTTATTAGTACATGTATTTCTATCCTACTGATTTATTTGCTATATCATCTAATTTAGTTTGAATATTCCATAATTTACTTAATTAGTCCTGTATGGAGACCTAGCTCTTCTCAGTGTCTACTATTATAAACAATGCTACAGTGAATATTGGTGNATAAATCCTACACACCACGTAACATATCTTAAGTTCCTGGAAGAGATATTGCTAAACCAGAAGATAACCTGCATTTAAAATTTGACTGCTAGGGTCAGGGTCACATTTAAATTAAATTAGAACAAGGAATGCATAATGTCTTCGATAGCAATCTATTCAAGGTGCACCGTGGTCACAAAGGAAAGCAAAACTGTC序列序号-310nt564CCTGGNCAGAGGCCTCTATCCTGTANTGATAATTGCCATCAAAATTGTCAAAAANGATTTAATTTCTATGGGNAATAGTCCTTTTCTTAGCTTCTGCCNNTCACTTGCTTATTTTTTGTGTGGGAATGGGGTTGGATAAACCAATGAACTTTATTATAAACAAATCCCACCTATATCTANCAAATTTATATTTTCGGTGAAATACAGATATTTGCCTTTCTGGAGTANTATAGAAGCTGTCAATATGTATCTACTGTACAGTACTAAATAGTATTCATTTATGAAATGAGTAGTGTTTGGGTGGCTGGGGTTAAGGAAAAATGAGACTTGGAATTGTAGCTTTTATCCAAGTTTTGAGTATAAATAGGGTTTTGTTTTGTTTTTTTTAACCTAAAAACTGAAATGCCATATAGAAAAACAGCATTGTTTTTACAGTTTGTAGTAAGTAACTTTTTAAAGATTTTATCAAAAAGAATTTTGTCTATNGTGAGTAAAAGAAGTTCTAATAATGGCCTAATCACTGCATTTTTAAAAAACAAAGTTCAACACAAATGACATTTGTTT序列序号311CCTCTCCTCCATCTAAAGGCAACATTCCTTACCCATTAGTCTCAGAAATTGTCTAAGCAACAGCCCCAAATGCTGGCTGCCCCCGGCCAAGCATTGGGGCCGCCATCCTGCCTGGCACTGGCTGATGGGCACCTCTGTTGGTTCCATCAGCCAGAGCTCTGCCAAAGGCCCCGCAGTCCCTCTCCCAGGAGGACCCTAGAGGCAATTAAATGATGTCCTGTTCCATTGG
序列序号-313nt554CCCGGAATCGCGGCCCGCGTCGACAACAAACCTGCATGTTCTGCACATGTATCCAGGAACTTAAAAAAAAAAAAAGATAGTTTGTGTGTCTTAATTGAATAATAGTAGATTTATAGATTAAAGATCTATGGGTTTTTAATATGGATTANAAATCTGTGGGTTTTTGATATGGATTANAAATCTGTGGGTTTTTAATATGGATTGGAAATCTGTGGGTTTTTAATATGGATTAAAAAACATCTGTGGGTTTTTAATATGGATTAAACATCTGTGGGTTTTTAATATGGATTAAACATCTGGGTTTTTAATATGGATTAAACATCTGTGGGTTTTTAATATGGGTTAAAAATCAAAAGAAAATGAACTATTTGCTCCAGTGCAGGAAAATACAGGCAATACTGGATACAATTAGATGGTCAGGAGCGATAACCCGGTTGCCATTGTTTGAAGAAGAGAATAAGGNGCTAGCATTCCTATCCGTAGATAATTTGACAGCTAGGAAATAGGGGGAGTCTTCTATGTAGTTAGTGAAGGCTAAATGAACTATTATATGC序列序号314CTTTTCCTCCCGCTGTCCCCCACGGAGGGGACTGCTCTCCCCCGCTGCATCCTTTCTGTGAGGTACCTTACCCACCTCAGCACCTGAGAGGGTGAAATAGAATTCTAACCTCGACATTCGGGAAGTGTTTTTGAGAAGTCTCGGTCGGTAAGGGAAGTCTTCCAAGTCCGTGCAGCACTAACGTATTGGCACCTGCCTCCTCTTCGGCCACCCCCCAGATGAGGCAGCTGTGACTGTGTCAAGGGAAGCCACGACTCTGACCATAGTCTTCTCTCAGCTTCCACTGCCGTCTCCACAGGAAACCCAGAAGTTCTGTGAACAAGTCCATGCTGCCATCAAGGCATTTATTGCAGTGTACTATTTGCTTCCAAAGGATCAGGCCCTGAGAACAATGACCTTATTTCCTACAACAGTGTCTGGGTTGCGTGCCAGCAGATGCCTCAGATACCAAGAGATAACAAAGCTGCAGCTCTTTTGATGCTGACCAAGAATGTGGATTTTGTGAAGGATGCACATGAAGAAATGGAGCAGGCTGTGGAAGAATGTGACCCTTACTCTGGCCTCTTGAATGATACTGAGGAGAACAACTCTGACAACCACAATCATGAGG序列序号315TGGTACAGATACAAACTGGACTCTCAGGACAAAACGACACCAGCCAAACCAGCAGCCCCTCAGCATCCAGCAGCATGAGCGGAGGCATTTTCCTTTTCTTCGTGGCCAATGCCATAATCCACCTCTTCTGCTTCAGTTGAGGTGACACGTCTCAGCCTTAGCCCTGTGCCCCCTGAAACAGCTGCCACCATCACTCGCAAGAGAATCCCCTCCATCTTTGGGAGGGGTTGATGCCAGACATCACCAGGTTGTAGAAGTTGACAGGCAGTGCCATGGGGGCAACAGCCAAAATAGGGGGGTAATGATGTACGGGCCAAGCACTGCCCAGCTGGGGGTCAATAAAGTTACCCTTGTACTTG序列序号316
CGCCACTTATCCAGTGAACCACTATCACGAAAAAAACTCTACCTCTCTATACTAATCTCCCTACAAATCTCCTTAATTATAACATTCACAGCCACAGAACTAATCATATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA序列序号321CAGAACAGTACTTTTTAATTTGACCCATGAATTCTATTTAAATTTGTCACTTAATATTTAGCCAAGAAGCAAACCATCTAAAAAGATTTCTGGTTTATTTCTCCAACTCCTAATAAATAGGGTCACATATTTTTTAACTTTTTTCTAATTTGAAAAGTAATA CAGGCATATGGTATTTTAAAAATGAAACAACACAAAGGGATATGTTTTGAAAAGTGGTTCTTGCCATCCCTGAACTGTAATCATCCCTAACATATTCATACCTGTTTTCATTTTAAAAGTTGGGTCAGTTTTTTTATTAGTACATGTATTTCTATCCTACTGATTTATTTGCTATATCATCTAATTTAGTTTGAATATTCCATAATTTACTTAATTAGTCCTGTATGGAGACCTAGCTCTTCTCAGTGTCTACTATTATAAACAATGCTACAGTGAATATTGGTGTATAAATCCATACACACCACGTAACATATCTTAAGTTCCTGGAAGAGATATTGCTAAACCAGAAGATAACCTGCATTTAAAATTTTGACTGCTAGGGTCAGGGTCACATTTAAATTAAATTAGAACAAGGAATGCATAATGTCTTCGATAGCAATCTATTCCAGGTGCACCGTGGTCACAAAGGAAAGCAAAACTGTCAATAACTTTCTTCTCA序列序号322TAGCATTTGGCCTTTTAAAACATTTGTTTATTTTTTTTCTGAGAATGGCTAACACACTTTATTGAGGTTCGAAATTAATAAAGAAAATAAAAGAAATGTATCTTCATTCATTCTGTATGTTAGTGTTTTAATTACCCTTAGAATATATGGATAAAAAATACTATTCTTTGTCTTGGAGAAGGTAAGAGTCTAGTTAGATGAATAAGGGTTATCTATGTAGAACAACTAGAGAATGAGAAGAGAGCTTATGAGATTGAGTACTACGTTATGCAGTAGAGTAGCACGTCATCTGCTACTGAGTATGGTGTGATAACATTGTGTAACAGGAAAGTATGATCAATATCTACTTAAAATTAAGGACAATATTAGCACTACATTGCTTTATTTTAAAGTAAAAATTAGAGAACTAAACACAAGCATTGTAAGTACAATAAAAGCTGATCTTTCTAGTTAAGCAGAATAATACATGTTCAAGCATCTGCTAAATCATTAAATATAAGAATATAGGGGTTTTCTATAATCTTATTTTCTTTGGAAGAGTACCTCATTTTCAAGANGAGAAGTTTCTAATTGCCACTTCTTTAAAAATAAAACAGGGTTTTAATGTTCCCAGCACAAAAATTAATATCTCTTCAAAAAGTCTCTTGTGATTAAGTTTGAATCCCTTGTCATACTGCTTCTAATATTGACACTGACCTCCTTAGGTATTTTTCAGGGGTTATAATCTTTTCTTAAGGTATCTTTTTTCAAGAATTGGATACCTTGGGCTT序列序号323CGCGTCGACTTTTAAAGTCATCTCTATAGGAAGGTGCTGGGCAGGGATCCCAGAGAAAGAAAGGGTCCAAGACTCCATTAACTGCCCTGGATGAAGGGCACTGCTACA
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AAGTNTNTTAATGAGACTCCTTGGATGAAAGTAACCAAAACCAGTAAAAATAAGGTAATAAGGATGTAATAGTTTCTTATGGACACTCAACAGCTAGAATGCAGTTAGTCTCAGAAAAGAATTAGAACAAATAACTGGAAGGCCATCAGGAGTCCAAAACCATCACTCTTTTATATTTTATATTTTATTTTTCTCTCTTCANATGAGCATTCTCTTTCTATGTCCATATGGTANAAGGCGGCAGCTCCATAGATTATGGCTTCAGATGTTACAGTTCCGCTNAATGCAGGGACAGACTTGCTATCTTTCAGTCCCCTTACATATCCTGGGGAGAGAGCAAATGATTGACTGGCTTGAGTCAGGTGCCCGTTCCCTTTCCAATCT序列序号-487nt224GTTTGNTTGTGACCATCTGTACTTGTAATTTCTTTACNTTCATTGGTATGAAAAATATGTTCTTAGAAGCANGAAAAAGAATTCAGNTTTGCTTTGTATACTAAATTAAATGCTGTAATTTTGATAAAATGAAAAATCTGCTTTATTTGCAACAATTGGTTTCTTCCTTGACGTCAGCCTCACTCTTGGACTTTGGTATTCAGCCNGNCACCCCTGGGAATTCC序列序号-488nt349GTGCCTCCCTGTGTGAGTAGCCTAAGGTGCATTGAAAAAGACTGGGATGTGTTTTATTTTTTTGTATTAGATAGCATTAACCTTACTGTTGAAGTATTTTTGGTGGAGTATTAGTGACAAGCCATTGAGTCTTAAGCCTTACGGCTTCCTATAAAATCACTAATTTCGTGTGTGTTTGTGTGTAGGTTACGTTATATATAGGATTCGTGTTCGCCGTGGTGGCCGAAAACGCCCAGTTCCTAAGGGTGCAACTTACGGCAAGCCTGTCCATCATGGTGTTAACCAGCTAAAGTTTGCTCGAAGCCTTCAGTCCGTTGCAGAGGANCGAGCTGGACNCCCTGGGGGGCTC序列序号489TTAACAGCTGCATAGAGTTTTAAAAGTACATTATATTTTGTCAGACAAGTAAAATATCTGTTTTTCACGCAAAAAAAGCCATGAAATACGTAATTTTTTAAAGACAAAAAATCATCTTTTGAGTTTGCTCTTTGGTTTTTCTTCATTCCTTTTGAGGATTGGGAAAACAGAAAGATTCTTTGATTTGGGTAATGAAGAGGTAATTTGGGACAGTGTGGTGGTACCAGGAAGAAAGAGGATTGGAAAGGCCAGTACTGTTTTAGTTGCTCGGCACTGTTGGTTTTGTTTTAATGTGGTTGCCCTGTCCACTACATGGTTCTATCAGTAGTGTAATCCATTTTCAATGTAAAGCTCTTTTAGTTTTTGTCATAGACATAAATTAATATTTTGAGAGGCATCCCTCACCTGTTCATTTCTTCTGTGTTGAAATGAAGTACTTAAAATTACCGTTATACATGAACTTTGTGGACTGTAAGATTTGTTATATATGTTCAAATGCCTTTTAGCTGGCTTTTTAATTAATATGCCTGTTTTGAGTGCTTAATACAATGTAATGNGGATTGTAAATCATACCTATTTTAAATCATTCCTTCCTGTATATTTGNACTCAGAGAGCCTTATTTTATTCTTCCAGC
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TCAAAGAACTGAGAGTGATTGAGAGTGGACCACACTGCGCCAACACAGAAATTATTGTAAAGCTTTCTGATGGAAGANAGCTCTGTCTGGACCCCAAGGAAAACTGGGTGCANAGGGTTGTGGANAAGTTTTTGAAGAGGGCTGAGAATTCATAAAAAAATTCATTCTCTGTGGTATCCAAGAATCAGTGAAGATGCCAGTGAAACTTCAAGCAAATCTACTTCAACACTTCATGTATTGTGTGGGTCTGTTGTAGGGTTGCCAGATGCAATACAAGATTCCTGGTTAAATTTGAATTTCAGTAAACAATGAATAGTTTTTCATTGTACCATGAAATATCCAGAACATACTTATATGTAAAGTATTATTTATTTGAATCTACAAAAAACAACAAATAATTTTTAGATATAAGGATTTTCCTGGATATTGCACGGGAGA序列序号532GAATTGTGATAGTTCAGCTTGAATGTCTCTTAGAGGGTGGGCTTTTGTTGATGAGGGAGGGGAAACTTTTTTTTTTTCTATAGACTTTTTTCANATAACATCTTCTGAGTCATAACCAGCCTGGCAGTATGATGGCCTANATGCAGAGAAAACAGCTCCTTGGTGAATTGATAAGTAAAGGCAGAAAAGATTATATGTCATACCTCCATTGGGGAATAAGCATAACCCTGAGATTCTTACTACTGATGAGAACATTATCTGCATATGCCAAAAAATTTTAAGCAAATGAAAGCTACCAATTTAAAGTTACGGAATCTACCATTTTAAAGTTAATTGCTTGTCAAGCTATAACCACAAAAATAATGAATTGATGAGAAATACAATGAAGAGGCAATGTCCATCTCAAAATACTGCTTTTACAAAAGCAGAATAAAAGCGAAAAGAAATGAAAATGTTACACTACATTAATCCTGGAATAAAAGAAGCCGAAATAAATGAGAGATGAGTTGGGATCAAGTGGGATTGANGANGCTGTGCTGTGT序列序号533CTTGAACCTCGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTCGGGGACAGAGCAAGACTCCATCTCAAAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAACAGATATACACTGAACACAGCACAAGTGGGACATAAGAGATTTAAAAGGGTTAGAGATGTAAAATGGATCTAGGAATGGAAACCATAAGGNGGGATTTATCAACTGGATTCTGCANAATGCTGTTAAGGCCAGATGTTAGCAGGTGTTACATAAAAAAGGGATACCATGAGCAAAAGTATTTGAACATGGGCAATGGTTGAAACAAGTTTAAACAGATTATNTTTATTACCAAATCTCTCAAACCTTTAATATGCTATAAACATTGTGAAACAATAAAAAAACTTTCCAAAA序列序号534GGGAAGGGAGCTATGAGTGTGTGTGTTGTGTATGGACTCACTCCCAGGTTCACCTGGCCACAGGTGCACCCTTCCCACACCCTTTACATTCCCCAGAGCCAAGGGAGTTTAAGTTTGCAGTTACAGGCCAGTTCTCCAGCTCTCCATCTTANAGAGACAGGTCACCTTGCAGGCCTGCTTGCAGGAAATGAATCCAGCAGCCAACTCGAATCCCCCTAGGGC
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序列序号568TATATATGTAATGCCCTTAACCTAGTGTTTGGCATGATCGTTGCTGAAAGGGAAGCTTGTGGGTACAGTGTCCCCTCAGAAGCCAAAGCCCAGGGAAGGTCGCCTGCCCAGGTCAGGCTCCCAGCGAGTTTGTCTGGGGAGGGGCCATTCATACCTCCAGGTCAGGACAGAGGCTCGGGCTGAGGGAACCCTACACAGGTCCTGGAAGCAGATCCTTCCTGCCTAAGCCAGCAGGACAGCTCAACAGGAAGCATCTTCCAGCCACGGGAGGAGAGGCAGCACCTTTTTTGGAACCATACAGAGCTAAGAATGGTGGTACAAGTAATAGATTCTGTACTGGCAACCCCACTTGGTGGAGCAAGTTCTAGGAAAAGGGGGCTGTCCTTGAGTCAGCCATGGGGTCAGCCACACAGTCACCGCAGCTGCTCTTTGGCACCGGGCGCTGGAAAGACCTAGGATGACACAGCCTGGAAAGAGCTTGGGAAAAGCTCATCTTCCACAGAACTACCTGCTATACCAGCCAGGGCAGGTGCTTATTCCCACAACAGCCCTCTGTTGTAGGCGGCAGTGCCATCCTGAANGTGCCGTGGTACCTTCTGAANACCCAGCTGAGGGCCTGTAATGGCACTTGCATGCCACATGGNACACCCTTTCCCGGTTAA序列序号570ACCGCGGCCGCGTNAANAAAAAAAAAAAAAGAATTCCACTTGATCAACTTAATTCCTTNTCTTTATCTTCCCTCCCTCACTTCCCTTTTCTCCCACCCTCTTTTCCAAGCTGTTTCGCTTTGCAATATATTACTGGTAATGAGTTGCAGGATAATGCAGTCATAACTTGTTTTCTCCTAAGTATTTGAGTTCAAAACTCCTGTATCTAAAGAAATACGGTTGGGGTCATTAATAAAGAAAATCTTTCTATCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA序列序号-571nt457TTAGAGAGGTGAGGATCTGGTATTTCCTGGACTAAATTCCCCTTGGGGAAGACGAAGGGATGCTGCAGTTCCAAAAGAGAAGGACTCTTCCAGAGTCATCTACCTGAGTCCCAAAGCTCCCTGTCCTGAAAGCCACAGACAATATGGTCCCAAATGACTGACTGCACCTTCTGTGCCTCAGCCGTTCTTGACATCAAGAATCTTCTGTTCCACATCCACACAGCCAATACAATTAGTCAAACCACTGTTATTAACAGATGTAGCAACATGAGAAACGCTTATGTTACAGGTTACATGAGAGCAATCATGTAAGTCTATATGACTTCAGAAATGTTAAAATAGACTAACCTCTAACAACAAATTAAAAGTGATTGTTTCAAGGTGATGCAATTATTGATGACCTATTTTATTTTTCTATAATGATCATATATTACCTTTGTAATAAAACATTTTTCCC序列序号572
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GTAAATGCGTTTTATGTTTAAATAAAGAGGAAAATTTTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTT序列序号656TAGAGGCCTGAATAGGTAGACAATGGCAGCAGCGTTTTTAATCACAGTCCTATTCATGCCCTAATTCGGGAGTGATGATTAAAGGACATTAGAGGGAGCACTTTGACATCTGATCCTTTGAACTGACGTCTGTGCAGGCTGCACTCCATAGAGCTCACTTGGCCAAACTGATTTCCTTAAATAAAGTGCTGTGATTTCCAATGTAGGAAATATTACATTAGAGCCTATTGAAATGATTAGGAATTGAGGAGCTTTTCTTTAGGTGGGAATGTGGTGTATGCTGTATACTCACAAAAGTGAGATCATTAATATTGCATGTACTACTTTGAATATCAGGGACCACAGAGAAATAGCATGAGAAACGCCTTCCTGCAGTCATGCACTTAAAATGAATATGAACAAAAATGTGGAACTCTGCTGTCATAGCTCTCCG序列序号657GGGGCTTCTGCTGAGGGGGCAGGCGGAGCTTGAGGAAACCGCAGATAAGTTTTTTTCTCTTTGAAAGATAGAGATTAATACAACTCTTAAAAAATATAGTCAATAGGTTACTAAGATATTGCTTAGCGTTAAGTTTTTAACGTAATTTTAATAGCTTAAGATTTTAAGAGAAAATATGAAGACTTAGAAGAGTAGCATGAGGAAGGAAAAGATAAAAGGTTTCTAAAACATGACGGAGGTTGAGATGAAGCTTCTTCATGGAGTAAAAAATGTATTTAAAAGAAAATTGAGAGAAAGGACTACAGAGCCCCGAATTAATACCAATAGAAGGGCAATGCTTTTAGATTAAAATGAAGGTGACTTAAACAGCTTAAAGTTTA序列序号658GACCTTTGAGAAAATTAATTTAAATCCTAGAACTTTGGGTGAACCGAAGAAATTTATAATATTTGTTTAGTTAATAACAGATAAAAAGGAAAGATTCAAGCCTATTGGATGAGAATTTGTACATTATTTTAGAGCTAATAATAATGGTTTTCAGTTTAGTGAGGATTTAAAAAATGTTTTTGAATCAAACTTTTTTTCTTTATAATCCTTTTTAACTAACTCAGGAAATAAGGTATTATGAAATCCACACACTGTTACCTCCTTAAAGTATGAGGATACTTCCCACTGTTTGGTCCACTAGTGGCTGATTATTTTGTTTGTGGATTATTTGTAATTTTCTTTTTAATTCTTCCTTAAAGAGCATGGCATTTGGAGTCACAGACCTATATTTGAATCCTGTCATTTACTAGCGTTTTGACCTTGAACAATTATGCTCAGAGTCTCAGTTTTTTCTTGTAAAGTGATGATGATACTACTTAACTCACAGGGTTGTAGTGAAGATCAAATGAGATCATGTCTGTANAACACCCTGCCCGGCACTCAATAAGTATTAATAGGAACCCATATACCTC
序列序号660TGTTTTTATTTTTTAAAAGGTATAAACACCAAAAAAAAAATTAACATTGTATGAAGATGGAAAATAAGAAGATGCACTTTCTGTAACTTTGTCTAAGGATTTAAATTACTAACTTATGAACTCCAATTTGAATTGAACTTAACTATCGGCTTTCTTACTGGTAAAATTATATGGTTTATTTTAAATGCGTACATATTGACCAATGGCCTCTGAAAAAGCACATTTTAGATACTGAAATTGAAGGAAAGAAAATGCATCTTCAAACATTTTTTGGAATCTCACCACATATACTTTGTTANATTTGTGTATTGTAGGGTGTTTGTTTTGTATTTTTGTATTGTATATGAACTTTTTTTAAATGTGACAGTTAAACACATCTTTAAAAGCATAGTCACAGACAAAAGCATACAGTATAAAAATTTCCTTGAAAACTCCTACAATATTATATTTGGAGGCAGCTTCAGACTGTTTTATTGGSeqeunce ID 661CTCTGGCACACATTAGTTCCTCTTATATTACATTGATATAAGCAAGTCATATGGATTTATCTGAGTGTAAGGAGAGCTGGAAAAAATAGTTTCTAGCAGGTCAGCCACCTCCCAGTGAGGGCTGCATACCATAGAAGGGGAGAATGAATTTTGGGAAAACAGGTAATTATCTCTGTCACAGAAGGGGATGAAAAGTATGGTAGTTACNCAAGTTANACATCTGTATGGAAAATACCACTTGGTTCTACAAATGNGG序列序号-663nt627GCCTCCCGGGTTCAGGGATTTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTGGCTGCATTGCAGGCACCTGCCACCACGCCTTGCAAATTTTTGTGTTTTTAGTGGAGATGGGGTTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGGACTCCTGACCTCAGGTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAGAGGGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCTGGCCCCAAGTTTTGCATCTTTTAATGCCCTCTGAACAAATACATAGAGAAAACTCTCAGAACAATTAAAACCTGCAGAGCAACAGTGTCCTCCATGTCTTAGGTTTCAAGTTTGCCTCTAAAATTCTAATCCATATTTTTCTACTTCTCAGATAATTTATGTGTGTGTACTCTTCCTAGACGTACAAGAGACTTTTTAATGCTAAATATTTGTCAGTGCTTAACAAAAACTCAATTTCACATTACTCATATTGTTTTTGTTTTAATTGAATGTGAATTAAATTTTTATTAGTTATTTGATTTGGAATGTTATGTATGCCATTAACACTATTAGGGGAATCTCTAGCATTTCTGTATTTTTAAAGAATTTGATTCTTTTGTANATTCTGCCTGTGTGGCATTTTAAACATGTGTGACAT序列序号-665nt345ACCGGCGACATGGCCAAACGTACCAAGAAAGTCGGGATCGTCGGTAAATACGGGACCCGCTATGGGGCCTCCCTCCGGAAAATGGTGAAGAAAATTGAAATCAGCCAGCACGCCAAGTACACTTGCTCTTTCTGTGGCAAAACCAAGATGAAGAGACGAGCTGTGGGGATCTGGCACTGTGGTTCCTGCATGAAGACAGTGGCTGGCGGTGCCTGGACG
TACAATACCACTTCCGCTGTCACGGTAAAGTCCGCCATCAGAAGACTGAAGGAGTTGAAAGACCAGTAGACGCTCCTCTACTCTTTGAGACATCACTGGCCTATAATAAATGGGTTAATTTATGTA序列序号-666nt252ATAATTCAGAACTTCTTCATATGCTCGAGTCTCCAGAGTCACTCCGTTCTAAGGTTGATGAAGCTGTAGCTGTACTACAAGCCCACCAAGCTAAAGAGGCTGCCCAGAAAGCAGTTAACAGTGCCACCGGTGTTCCAACTGTTTAAAATTGATCAGGGACCATGAAAAGAAACTTGTGCTTCACCGAAGAAAAATATCTAAACATCGAAAAACTTAAATATTATGGAAAAAAAACATTGCAAAATATAAAAT序列序号669TTACTTTTAACCAGNGAAATTGACCTGCCCGTGAANAGGCGGGCNTGACACAGCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTTATTAATGCAAACGGTACCTAACAAACCCACAGGTCCTAAACTACCAAACCTGCATTAAAAATTTCGGTTGGGGCGACCTCGGAGCAGAACCCAACCTCCGAGCAGTACATGCTAAGACTTCACCAGTCAAAGCGAACTACTATACTCAATTGATCCAATAACTTGACCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATT序列序号670GGCTGATTCCTGAGCTATAAAAGCATAATTGCTTTATATTTTGGATCATTTTTTACTGGGGGCGGACTTGGGGGGGGTTGCATACAAAGATAACATATATATCCAACTTTCTGAAATGAAATGTTTTTAGATTACTTTTTCAACTGTAAATAATGTACATTTAATGTCACAAGAAAAAAATGTCTTCTGCAAATTTTCTAGTATAACAGAAATTTTTGTAGATGAAAAAAATCATTATGTTTAGAGGTCTAATGCTATGTTTTCATATTACAGAGTGAATTTGTATTTAAACAAAAATTTAAATTTTGGAATCCTCTAAACATTTTTGTATCTTTAATTGGTTTATTATTAAATAAATCATATAAAAATT序列序号671CAGGAAGTCACCTGGGATTGGCTGCCTCACCCACTCACAGTGCCATCCCTGCCCCAGGCCTCCCAGTGGCAATTCCAAACCTGGGTCCCTCCCTGAGCTCTCTGCCTTCTGCTCTGTCTTTAATGCTACCAATGGGTATTGGGGATCGAGGGGTGATGTGTGGGTTACCTGAAAGAAACTACACCCTACCTCCACCACCTTACCCTCACCTGGAGAGCAGTTATTTCAGAACCATTCTACCTGGCATTTTATCTTATTTAGCTGACAGACCACCTCCACAGTACATCCACCCTAACTCTATAAATGTTGATGGTAATACAGCATTATCTATCACCAATAACCCTTCAGCACTA
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AAGACTTTGGTTATTTTACTTTTTGGAAAAGAATAAACCAAGAATTGATTGGGCACATCATTTCAAGAAG序列序号-1212nt374AGAGCAGCAGCCATGGCCCTACGCTACCCTATGGCCGTGGGCCTCAACAAGGGCCACAAAGTGACCAAGAACGTGAGCAAGCCCAGGCACAGCCGACGCCGCGGGCGTCTGACCAAACACACCAAGTTCGTGCGGGACATGATTCGGGAGGTGTGTGGCTTTGCCCCGTACGAGCGGCGCGCCATGGAGTTACTGAAGGTCTCCAAGGACAAACGGGCCCTCAAATTTATCAAGAAAAGGGTGGGGACGCACATCCGCGCCAAGAGGAAGCGGGAGGAGCTGAGCAACGTACTGGCCGCCATGAGGAAAGCTGCTGCCAAGAAAGACTGAGCCCCTCCCCTGCCCTCTCCCTGAAATAAAGAACAGCTTGACAG序列序号-1213nt567GAATTATTGACTTTGAATTGCATTTCAGTACCATGAAGTCAAAGTCAGTGGTGTATTTGCTCATTTGTTCATTCTTTCTTTTCCACCAACATTACTGCCTGCAGAGCCAGAGGTGAGTGCAGAAATCCTGTCAATTCGTCACTTGTGGACAACCTGCAGCTTGCCACAGCCTACAGTTCCACCACTGTGACCTCTGAAAACCTCCTGAACAAAAGGAAGGAGACTTGGAAATCCTGAATGGGCTTGGAGACATTAAGGGAGAACTGCCTCCCTGGACCAAGGCAGAATTCAATAGAACCAGCAAGAAATTTTCCTATGAATGGGAAAGCAGGTGGCAGGGGGCAGGGGTGGAAAAGCTTTGTACAGGAATTGTGGAAAAGCTTTTGCATTATCTCTAGTCTGAAAGTCACATTTCTCAGTTCCTTTCCACTCTCTTCTGTCAACTTGCTGTGAGTAAATGACATCTGTCACCTGTGACACGGGCCAGGGACTATCACCATATGGCCCCCACACATTATCTAGTACCAGCCTGCCTGGGCCATGCCTTTTCCAGTCACTGTACCAGCC序列序号-1214nt620CTCTCCTGTCAACAGCGGCCAGCCTCCCAACTACGAGAATGCTCAAGGAGGAGCAGGAAGTGGCTATGCTGGGGGCGCCCCACAACCCTGCTCCCCCGACGTCCACCGTGATCCACATCCGCAGCGAGACCTCCGTGCCCGACCATGTCGTCTGGTCCCTGTTCAACACCCTCTTCATGAACACCTGCTGCCTGGGCTTCATAGCATTCGCCTACTCCGTGAAGTCTAGGGACAGGAAGATGGTTGGCGACGTGACCGGGGCCCAGGCCTATGCCTCCACCGCCAAGTGCCTGAACATCTGGGCCCTGATTTTGGGCATCTTCATGACCATTCTGCTCGTCATCATCCCAGTGTTGGTCGTCCAGGCCCAGCGATAGATCAGGAGGCATCATTGAGGCCAGGAGCTCTGCCCGTGACCTGTATCCCACGTACTCTATCTTCCATTCCTCGCCCTGCCCCCAGAGGCCAGGAGCTCTGCCCTTGACCTGTATTCCACTTACTCCACC
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GATGGCTATGTGCTAGAGGGCAAAGAGTTGGAGTTCTATCTTAGGAAAATCAAGGCCCGCAAAGGCAAATAAATCCTTGTTTTGTCTTCACCCATGTAATAAAGGTGTTTATTGTTTTTGTT序列序号1491CTTNCACATACTGATTGATGTCTCATGTCTCTCTAAAATGTGTAAAACCAAGCTGTGCCCCAACCACCTTGGGNACATGTGGNGAGGACCTCCTGAGGCTGTGTCATGGGCACACCTTAACCCTGGGAAAATAAACTTTCTAAACTGACTTGAGAGCTGTCTCAGATATTCTGAGCTTACAGTTATTGTGAAATCATTTTAATTATAAATTAAGTGGAGATTTACTTAAAATCATGTGTAGAAGTAGCCTGTGATATAGTCCTAGATACATACATTATCATCTTATGTATCTTCCCTCCCTCTTCCAGGTTCTGATAAAAACAGATGAAATCTGAAAGACCATGACAGTAGTATTTTGAAAATGACAGTATTTGAAATTAAAAAATTGTAAAAGTGTTCTGTTCTATCACTGCCAAAGGATAAGTTACAAATTGGTTCTTGGAACGTAATATGTACTATGTGCTTGCTATTTAATAATTTACCAGTCTTAGTCTTTTTTATTCAGACTAATTTTACCTTTTTTTAACCTATGACTCTTTAGTTATAGTAGTACAAAAAAGTAGTTTTAGTTATAGTTTTAGTTGTAGTACAAAAAAGCATTTTCTGTAAGCTTAATTTCTTTCCCCTTCCCGCTTTCCCAGTCAGATGACTTTAGTGATTTGGAGTTGTGTGCTTTATAAGTGCATTCCTCAGAGGACTTAATATTACTAAGATTTTAGCAACNCTGAAATATGTT序列序号1492TGTNCCTGTAGTCCTGTGTGGGAGGATTGCCTGAGCCTAGGAGCTCAAAGTTGCAGTGAGCCCAGATCGNGNCATTGCAGTCCAGCCTGGGTGACAGAGTGAGACCCCATGTCAAAAAAAAAAAAACAAAAAACAGGGGCCTGCCTCANCCAGCAGGTGAGGTCTGCCACTGAGAGCACTTCTAGCAGCAGGAACAGCCTCCACCCCCACACTGCAATCAAGTTTTTTGGGTCAGCCTTAGGAGCTAANAAAGGGCCTAGTTTGNCTAAATAGCAGGAGTTATATCCAGGGATCTTCAGGCCCAGGAATGCTAATGAGTAGGCATTCCATGGGCCCTGGGAATGGCTTTGTGTGCCANAAATGATGGCCACAAAGGCCTTGCTGCCTTTTTTCAAAATGGCTGCATCCAGCTGAGTGCTCTCTGCCAAAGGGGANAANAAAATAAGTCTCCAGTGCATTTAGATTGGTCTCTCATCATCTCTCTCCTTTTTGTTTTTATTAGTCTCCTTAACCAAAACTGCCAAGAAAGGCTTGGAATTGAAACAAAACCTGATANAANAGGTAAGAGGTTGTTCTTTT序列序号1493TGTNTCAAAAAAAAAAAAAAGAACGGNAATGTACTGGAGATGTATTTGATAACCAAGGNTTTAGGTAAATTTTCACCAGTATTAGTTNTATTTGCAAACTGAAAAATGTTGTAGGCTTAATATAAAATAACCACATTAGTGAACATTATATCTCTTAGAAGAAAG
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权利要求
1.一组寡核苷酸探针，其中所述组包括至少10种选自如下的寡核苷酸表1中描述的寡核苷酸或来源于表1描述的序列的寡核苷酸，或具有互补序列的寡核苷酸，或功能性等价的寡核苷酸。
2.权利要求1中要求保护的一组寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针选自在表2中描述的寡核苷酸或来源于在表2描述的序列的寡核苷酸，或具有互补序列的寡核苷酸，或功能性等价的寡核苷酸。
3.权利要求1中要求保护的一组寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针选自表4中描述的寡核苷酸或来源于在表4描述的序列的寡核苷酸，或具有互补序列的寡核苷酸，或功能性等价的寡核苷酸。
4.权利要求1-3的任何一项中要求保护的一组寡核苷酸探针，其中所述组中的各种探针结合到不同转录物上。
5.权利要求1-4的任何一项中要求保护的探针组，由10-500种寡核苷酸探针组成。
6.一种寡核苷酸探针，其中所述探针选自列举在表1中的寡核苷酸，或来源于在表1中描述的序列的寡核苷酸，或其互补序列。
7.权利要求1-5的任何一项中要求保护的一组寡核苷酸探针或权利要求6中要求保护的寡核苷酸探针，其中各种所述寡核苷酸探针长度为15-200个碱基。
8.权利要求1-5或7的任何一项中要求保护的一组寡核苷酸探针或权利要求6或7中要求保护的寡核苷酸探针，其中所述探针结合的转录物来源于被组成型地中度或高度表达的基因。
9.权利要求1-5、7或8的任何一项中要求保护的一组寡核苷酸探针或权利要求6-8中要求保护的寡核苷酸探针，其中所述探针被固定在一种或多种固体支持物上。
10.权利要求9要求保护的一组寡核苷酸探针或寡核苷酸探针，其中所述固体支持物是片、滤器、膜、平板或生物芯片。
11.由权利要求6中定义的寡核苷酸结合的mRNA序列编码的多肽。
12.权利要求11中定义的多肽的抗体。
13.包括固定在一种或多种在权利要求9或10中定义的固体支持物上的一组寡核苷酸探针的试剂盒。
14.权利要求13要求保护的试剂盒，其中所述探针被固定在单一的固体支持物上，各种独有的探针被附着到所述固体支持物的不同区域上。
15.如权利要求13或14要求保护的试剂盒，还包括进行标准化的物质。
16.权利要求1-5或7的任何一项所述的一组探针或者权利要求13-15中所述的试剂盒在确定细胞的基因表达模式中的用途，该模式反映所述寡核苷酸探针结合的基因的基因表达水平，其至少包括步骤a)从所述细胞中分离mRNA，可选择地将mRNA反转录为cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到权利要求1-5、7-10或13-15的任何一项定义的一组寡核苷酸或试剂盒上；和c)评价杂交到所述探针上的mRNA或cDNA的含量，以生成所述模式。
17.一种制备标准基因转录模式的方法，该标准基因转录模式是生物体的疾病或病症或其阶段特征性的，该方法至少包括步骤a)从所述一种或多种患有疾病或病症或其阶段的生物体的样本的细胞中分离mRNA，可选择地将mRNA反转录为cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到特异于所述生物体及其样本的疾病或病症或其阶段的权利要求1-5、7-10或13-15的任何一项定义的一组寡核苷酸或试剂盒上，该生物体和样本对应于被研究的生物体及其样本；和c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，以生成特征性模式，该模式反映患有疾病、病症或其阶段的样本中，所述寡核苷酸结合的基因的基因表达水平。
18.一种制备检测基因转录模式的方法，至少包括步骤a)从所述检测生物体的样本的细胞中分离mRNA，可选择地将mRNA反转录为cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交到特异于所述生物体及其样本的疾病或病症或其阶段的权利要求1-5、7-10或13-15的任何一项定义的一组寡核苷酸或试剂盒上，该生物体和样本对应于被研究的生物体及其样本；和c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，以生成反映所述检测样本中，所述寡核苷酸结合的基因的基因表达水平的所述模式。
19.一种诊断或鉴定或监控生物体的疾病或病症或其阶段的方法，包括步骤a)从所述生物体的样本的细胞中分离mRNA，其可选择地被反转录为cDNA；b)将步骤(a)的mRNA或cDNA杂交特异于生物体及其样本的疾病或病症或其阶段的权利要求1-5、7-10或13-15的任何一项定义的一组寡核苷酸或试剂盒上，该生物体和其样本对应于被研究的生物体和其样本；和c)评价杂交到各种所述探针上的mRNA或cDNA的量，生成反映所述寡核苷酸结合的基因在所述样本中的基因表达水平的特征性模式；和d)将所述模式与标准诊断模式比较，以确定指示在被研究的生物体中存在所述疾病或病症或其阶段的相关程度，该标准诊断模式如权利要求17所述，用来自生物体的样本来制备，所述生物体和样本对应于被研究的生物体和样本。
20.权利要求17-19的任何一项中要求保护的方法，其中mRNA或cDNA在步骤b)之前被扩增。
21.权利要求17-20的任何一项中要求保护的方法，其中寡核苷酸和/或mRNA或cDNA被标记。
22.如权利要求17-21的任何一项中要求保护的方法，其中所述探针如权利要求3中所定义，而所述疾病为阿尔茨海默病。
23.如权利要求17-21的任何一项中要求保护的方法，其中所述探针如权利要求2中所定义，而所述疾病为乳腺癌。
24.如权利要求17-23的任何一项中要求保护的方法，其中如权利要求1-5、7-10或13-15的任何一项定义的所述寡核苷酸组用一组随机选择的寡核苷酸替换，优选从cDNA文库中选择。
25.一种制备标准基因转录模式的方法，该模式是生物体的疾病或病症或其阶段特征性的，该方法至少包括步骤a)从一种或多种患有疾病或病症或其阶段的生物体的样本中释放目标多肽；b)将所述目标多肽与一种或多种结合配偶体接触，其中各个结合配偶体特异于表1的寡核苷酸(来源于表1描述的序列)结合的基因所编码的标志物多肽(或其片段)，使得所述结合配偶体结合到所述目标多肽上，其中所述标志物多肽特异于生物体及其样本中的所述疾病或其病症，该生物体及其样本对应于被研究的生物体及其样本；和c)评价结合到所述结合配偶体上的目标多肽，生成反映在具有疾病、病症或其阶段的样本中，表达所述标志物多肽的基因的基因表达水平的特征性模式。
26.一种制备检测基因转录模式的方法，至少包括步骤a)从所述检测生物体的样本中释放目标多肽；b)将所述目标多肽与一种或多种结合配偶体接触，其中各个结合配偶体特异于表1的寡核苷酸(来源于表1描述的序列)结合的基因所编码的标志物多肽(或其片段)，使得所述结合配偶体结合到所述目标多肽上，其中所述标志物多肽特异于生物体及其样本中的所述疾病或其病症，该生物体及其样本对应于被研究的生物体及其样本；和c)评价结合到所述结合配偶体上的目标多肽，生成反映在检测样本中，表达所述标志物多肽的基因的基因表达水平的特征性模式。
27.诊断或鉴定或监控生物体中的疾病或病症或其阶段的方法，包括步骤a)从所述生物体的样本中释放目标多肽；b)将所述目标多肽与一种或多种结合配偶体接触，其中各个结合配偶体特异于表1的寡核苷酸(来源于表1描述的序列)结合的基因所编码的标志物多肽(或其片段)，使得所述结合配偶体结合到所述目标多肽上，其中所述标志物多肽特异于生物体及其样本中的所述疾病或其病症，该生物体及其样本对应于被研究的生物体及其样本；和c)评价结合到所述结合配偶体上的目标多肽，生成反映在所述样本中，表达所述标志物多肽的基因的基因表达水平的特征性模式；和d)将所述模式与标准诊断模式比较，以确定指示在所研究的生物体中存在所述疾病或病症或其阶段相关程度，该标准诊断模式如权利要求25中描述，用来自对应于被研究的生物体及其样本的生物体的样本制备。
28.权利要求17-27的任何一项中要求保护的方法，所述模式被表示为与各种探针相关的表达水平的数值的阵列。
29.权利要求17-28的任何一项中要求保护的方法，其中所述生物体是真核生物体，优选为哺乳动物。
30.权利要求29要求保护的方法，其中所述生物体是人。
31.权利要求17-30的任何一项中要求保护的方法，其中组成所述模式的数据用数学方法映射到分类模型上。
32.权利要求17-31的任何一项中要求保护的方法，其中所述疾病是癌症或退行性大脑异常。
33.权利要求17-32的任何一项中要求保护的方法，其中所述样本是组织、体液或机体废物。
34.权利要求17-33的任何一项中要求保护的方法，其中所述样本是外周血。
35.权利要求17-34的任何一项中要求保护的方法，其中样本中的细胞不是疾病细胞，未与疾病细胞接触过以及不是来源于疾病或病症的部位。
36.权利要求19-35的任何一项中要求保护的方法，用于诊断、鉴定或监控生物体中的两种或多种疾病、病症或其阶段，其中在步骤c)中生成的所述模式与至少两种在权利要求17或25中描述的标准诊断模式比较，其中各个标准诊断模式是从不同疾病或病症或其阶段生成的模式。
37.一种用于鉴定探针的方法，该探针用于诊断或鉴定或监控生物体的疾病或病症或其阶段，该方法包括步骤a)将一组寡核苷酸探针，优选如先前描述的，固定在固体支持物上；b)从正常生物体(正常样本)中分离mRNA，可选择地将mRNA反转录为cDNA；c)从来自生物体的样本中分离mRNA，所述样本和生物体对应于步骤(b)的样本和生物体，所述生物体已知患有所述疾病或病症或其阶段(疾病样本)，可选择地将mRNA反转录为cDNA；d)将步骤(b)和(c)的mRNA或cDNA杂交到步骤(a)所述的被固定的寡核苷酸探针组上；和e)评价结合到各种所述寡核苷酸探针上的mRNA或cDNA的量，以确定在所述正常的和疾病的样本中，所述寡核苷酸探针结合的基因的基因表达水平，生成各种样本的基因表达数据集；f)规格化和标准化步骤(e)的所述数据集；g)构建用于分类的校准模型，优选采用统计学方法偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和线性判别分析(LDA)；h)进行JackKnife分析，鉴定那些将所述疾病样本和正常样本划分到各自组中所需的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及用于评定细胞中的基因转录水平的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针可被用于分析方法特别是诊断方法中，本发明还涉及含有该探针的试剂盒。
文档编号G06F19/20GK1742101SQ200380109059
公开日2006年3月1日 申请日期2003年11月21日 优先权日2002年11月21日
发明者普拉维恩·沙马, 纳林德·S·萨尼, 安德斯·朗尼伯格 申请人:迪亚吉尼克公司