专利名称：一种a、c群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法。
背景技术：
脑膜炎球菌感染是引起儿童细菌性脑膜炎的常见病因，病死率较高。由于脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的使用，有效地控制了发病率。但是，荚膜多糖属T细胞非依赖性抗原，再次免疫不能被加强，且不能诱导2岁以下儿童产生免疫应答，有一定的局限性。以化学方法将蛋白载体共价结合到荚膜多糖上，可以使之成为T细胞依赖型抗原，从而具有免疫记忆反应，因此对5岁以下婴幼儿提供免疫保护。
研究表明，A群脑膜炎球菌多糖一破伤风类毒素结合物、C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物在小鼠中具有很强的免疫原性，可刺激小鼠产生高水平的IgG，而单独的荚膜多糖不能刺激小鼠产生抗体或仅有低水平抗体产生。可见结合物中真正起作用的是与破伤风类毒素结合的多糖。多糖结合疫苗中的游离多糖含量超过规定的限度会对疫苗临床使用的效果产生不利的影响，因此多糖蛋白结合物中游离多糖含量测定是多糖结合疫苗质量控制中的关键指标之一，也是反映结合疫苗质量的优劣的主要指标之一。
因为不同细菌荚膜多糖以及不同多糖结合物性质差异较大，所以多糖结合疫苗中的游离多糖测定是一个技术难点，目前尚无多糖结合物中游离多糖含量测定的通用方法。国外文献报道采用高效液相色谱法进行细菌多糖结合物中游离多糖测定，一种采用高效凝胶过滤，一种采用高效阴离子交换色谱。高效凝胶过滤法基于分子大小差异来区分结合多糖与游离多糖，易受到分子大小相近杂质的影响，测定结果误差较大；高效阴离子交换色谱基于分子带电荷性质的差异来区分结合多糖与游离多糖，也易受到与多糖带电荷性质相似的杂质的影响。国内朱为、李凤祥在《A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立》(微生物学免疫学进展，2002年，30卷第4期)上介绍了一种利用乙醇沉淀法测定A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物游离多糖的方法，但该方法步骤繁多，一个样品需要5天才能获得结果。但目前尚无利用冷酚溶液萃取方法测定A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的报道。
发明内容
本发明的方法克服了现有方法测定游离多糖含量的不足，该方法可以准确测定A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖的含量，并且方法简便、快捷。
本发明的技术方案及步骤(1)取待检脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；(2)另取该脑膜炎球菌多糖结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中；向每离心管加入2～10ml冷酚溶液，振荡混匀10～30分钟，置冰浴5～20分钟，5000～10000rpm离心10～30分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4；(3)A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度；C群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度；样1、样2、样3、样4的多糖浓度分别为p1、p2、p3、p4；(4)根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率应在80～120％；(5)根据公式计算游离多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>式中P为回收率。
其中所述的冷酚溶液可以是按照每100g苯酚加40ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液溶解的比例配制，然后预冷至4℃制备而成。
本发明的有益效果是利用苯酚极强的致蛋白质变性的特点，在苯酚存在并经高速离心后，结合多糖因偶联的蛋白变性而不可逆沉降，游离多糖仍在上清液中，这样结合多糖与游离多糖分开，分别测定离心上清液与原液的多糖含量，即可计算出游离多糖含量。本发明提供了一种准确、快速测定A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的方法，建立了评价脑膜炎球菌多糖结合疫苗质量的方法。
具体实施例方式实施例1500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，用1mol/L盐酸调节pH为6.9～7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚一瓶，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有200ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，迅速混匀，置4℃冰箱保存过夜，即为冷酚溶液。
取待检A群脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该A群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3。另取该A群脑膜炎球菌结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检A群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中。向每离心管加入2ml冷酚溶液，振荡混匀10分钟，置冰浴5分钟，5000rpm离心10分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4。
测定样1、样2、样3、样4的磷含量，按照公式“A群多糖浓度＝磷含量/0.08”计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为p1＝140.0μg/ml，p2＝12.0μg/ml，p3＝88.9μg/ml，p4＝85.1μg/ml根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率为95.7％；根据公式计算游离多糖含量H
H=p2p1÷P×100%,]]>A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量为9.0％。
实施例2500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，用1mol/L盐酸调节pH为6.9～7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚一瓶，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有200ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，迅速混匀，置4℃冰箱保存过夜，即为冷酚溶液。
取待检A群脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该A群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；另取该A群脑膜炎球菌结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检A群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中；向每离心管加入10ml冷酚溶液，振荡混匀30分钟，置冰浴20分钟，10000rpm离心30分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4。
测定样1、样2、样3、样4的磷含量，按照公式“A群多糖浓度＝磷含量/0.08”计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为p1＝143.2μg/ml，p2＝14.1μg/ml，p3＝75.2μg/ml，p4＝72.4μg/ml根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率为96.3％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量为10.2％。
实施例3
500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，用1mol/L盐酸调节pH为6.9～7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚一瓶，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有200ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，迅速混匀，置4℃冰箱保存过夜，即为冷酚溶液。
取待检A群脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该A群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；另取该A群脑膜炎球菌结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检A群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中。向每离心管加入4ml冷酚溶液，振荡混匀20分钟，置冰浴15分钟，7000rpm离心20分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4。
测定样1、样2、样3、样4的磷含量，按照公式“A群多糖浓度＝磷含量/0.08”计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为p1＝94.7μg/ml，p2＝7.6μg/ml，p3＝114.9μg/ml，p4＝112.3μg/ml根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率为97.7％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量为8.2％。
实施例4500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，用1mol/L盐酸调节pH为6.9～7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚一瓶，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有200ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，迅速混匀，置4℃冰箱保存过夜，即为冷酚溶液。
取待检C群脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该C群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；另取该C群脑膜炎球菌结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检C群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中。向每离心管加入2ml冷酚溶液，振荡混匀10分钟，置冰浴5分钟，5000rpm离心10分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4。
测定样1、样2、样3、样4的唾液酸含量，按照公式“C群多糖浓度＝唾液酸含量/0.8”计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为p1＝68.5μg/ml，p2＝7.8μg/ml，p3＝57.2μg/ml，p4＝54.5μg/ml根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率为95.3％；根据公式计算游离多糖含量H=p2p1÷P×100%,]]>C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量为11.9％。
实施例5500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，用1mol/L盐酸调节pH为6.9～7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚一瓶，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有200ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，迅速混匀，置4℃冰箱保存过夜，即为冷酚溶液。
取待检C群脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该C群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；另取该C群脑膜炎球菌结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检C群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中。向每离心管加入10ml冷酚溶液，振荡混匀30分钟，置冰浴20分钟，10000rpm离心30分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4。
测定样1、样2、样3、样4的唾液酸含量，按照公式“C群多糖浓度＝唾液酸含量/0.8”计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为p1＝116.2μg/ml，p2＝6.6μg/ml，p3＝49.6μg/ml，p4＝47.2μg/ml根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率为95.2％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量为6.0％。
实施例6500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，用1mol/L盐酸调节pH为6.9～7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚一瓶，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有200ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，迅速混匀，置4℃冰箱保存过夜，即为冷酚溶液。
取待检C群脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该C群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；另取该C群脑膜炎球菌结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检C群脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中。向每离心管加入4ml冷酚溶液，振荡混匀20分钟，置冰浴15分钟，7000rpm离心20分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4。
测定样1、样2、样3、样4的唾液酸含量，按照公式“C群多糖浓度＝唾液酸含量/0.8”计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度，分别为p1＝50.2μg/ml，p2＝3.1μg/ml，p3＝50.5μg/ml，p4＝48.6μml根据公式计算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率为96.2％；根据公式计算游离多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量为6.4％。
权利要求
1.一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其步骤是(1)取待检脑膜炎球菌多糖结合物2ml作为样1，取该待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml作为样3；(2)另取该脑膜炎球菌多糖结合物2ml置于15ml离心管中，取该待检脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液2ml置于另一15ml离心管中；向每离心管加入2～10ml冷酚溶液，振荡混匀10～30分钟，置冰浴5～20分钟，5000～10000rpm离心10～30分钟，每离心管单独收集上清液，结合物上清液为样2，衍生物上清液为样4；(3)A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度；C群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，计算样1、样2、样3、样4的多糖浓度；样1、样2、样3、样4的多糖浓度分别为p1、p2、p3、p4；(4)根据公式计算回收率PP=p4p3×100%]]>，回收率应在80～120％；(5)根据公式计算游离多糖含量HH=p2p1÷P×100%]]>，式中P为回收率。
2.根据权利要求1所述的一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，其特征是所述冷酚溶液是按照每100g苯酚加40ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液溶解的比例配制，然后预冷至4℃制备而成。
全文摘要
本发明一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，属于生物技术领域，其步骤为取A、C群脑膜炎球菌多糖结合物作为样1；取A、C脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液为样3；取一定量A、C群脑膜炎球菌多糖结合物，加入冷酚溶液，充分振荡，离心收集上清液为样2；取一定量A、C脑膜炎球菌多糖结合物对应的衍生物溶液，加入冷酚溶液，充分振荡，离心收集上清液为样4。A群脑膜炎球菌多糖结合物测定磷含量、C群脑膜炎球菌多糖结合物测定唾液酸含量，计算出样1、样2、样3、样4的多糖浓度，并利用公式计算游离多糖含量。本发明能准确、快速、简便测定出结合物中游离多糖的含量，从而评价制品质量。
文档编号G06F19/00GK1971266SQ20061004887
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者黄镇, 吴凯 申请人:云南沃森生物技术有限公司