专利名称：细胞群的变化的测定的制作方法
细胞群的变化的测定 发明领域本发明涉及用于测定细胞群的变化的方法和系统，以及使用所述方法和 系统来评估胚胎的质量量度和选择供体外受精用的胚胎的方法。发明背景在世界范围内，有超过8千万人为不孕所累。估计有10。/。的夫妇遭受原 发或继发不孕(Vayena et al., 2001)。体外受精(IVF)是一种可以选择的医学治 疗方法，它可能为原本不能怀孕的的夫妻提供了怀孕的机会。它是这样一种 过程首先从女性卵巢中取出卵子(卵母细胞)，然后在实验室中用精子给 卵子受精。然后将此过程中产生的胚胎置入子宫，以实现可能的着床 (implantation)。为了避免多胎妊娠和多胎生产，只转移少数胚胎(通常少于 四个，理想的是只有一个(Bhattacharyaetal., 2004))。选择正确的转移用胚胎 是IVF治疗中的关键步骤。当前的选择规程大多完全基于胚胎在发育过程中 不同时间点的形态学评估，特别是转移时使用标准立体显微评估。然而，人 们广泛认为所述评估规程需要定性的和定量的改进。早多/勿^敏分袭。 一种有希望的新方法是利用到2细胞阶段为止的"早期 分裂，，(即授精/注射后前25-27小时)作为质量指标。在此方法中，在受精后 25-27小时目视检查胚胎，以确定第一次细胞分裂是否完成。数项研究证明 了胚胎个体的早期分裂与后续发育潜能之间存在强有力的关联性(Shoukir et al.， 1997; Sakkas et al., 1998， 2001; Bos-Mikich et al., 2001; Lundin et al., 2001; Petersen et al" 2001; Fenwick et al., 2002; Neuber et al.， 2003; Sal腿ets et al" 2003; Windtetal., 2004)。若干评论者指出更频繁的观察是必要的，然而，频 繁的目视观察及相关的从培养箱到倒置显微镜的转移会诱发物理应力，物理 应力可能妨碍或者甚至阻止胚胎发育。它还耗费时间，而且难以纳入IVF的 临床规程。数名研究人员进行了胚胎发育过程中的时移图像获取。这主要是通过将 研究显微镜置于培养箱中或者在具有自动化图像获取的显微镜载物台上建立"培养箱载台"来进行的。"培养箱"维持可接受的温度(37。C )、湿度(〉90%) 和气体组成(5%032，有些场合还有降低的氧浓度)。时移图像的人工评估 提供了关于细胞分裂的计时和持续时间的重要信息(Grisart et al., 1994; Holm et al., 1998; Maje- rus et al.， 2000; Holm et al" 2002; Holm et al., 2003; L叫丽e et al., 2003; Motosugi et al., 2005)。一种备选的实验设置包括将图像获取系统置于培养箱中以在发育过程 中观察胚胎，从而避免了将胚胎从培养箱内的优化条件移出而对胚胎施加压 力。IMT international制造和销售 一种商品化系统，EmbryoGuard (见文献列 表)。在这种设置中，有可能在培养箱中在线观察胚胎。谅VJ房谬力Vf。胚胎图像和胚胎发育的时移视频的形态学评分依赖于人 工分析，其中评阅人给照片评级，而计算机只追踪此评级，产生带注解的时 间线，显示何时发生重大变化。此类软件的例子有EmbryoGuard的时移图像 获取系统提供的注解软件。时移视频人工分析的例子见Grisart et al., 1994; Holm et al.， 1998; Maj画et al" 2000; Holm et al.， 2002; Holm et al,， 2003; L,equarre et al.， 2003; Motosugi et al" 2005。当前用于胚胎照片的定量图像分析的软件采用半自动的或计算机辅助 的算法。它是一种计算机辅助图像评分，其中使用者使用画图工具来描绘胚 胎结构，随后基于使用者描绘的胚胎结构轮廓对胚胎结构进行定量。可通过 商业途径获得数种用于进行胚胎照片半自动分析的程序(例如图像House的 「crtiMorph, Copenhagen, Denmark )。人们进行了若干建立完全自动化的胚胎 照片分析系统的尝试(例如Christina Hnida的博士论文)。然而，胚胎学和IVF 实验室中 一般使用的霍夫曼调制相衬(Hoffmann modulation contrast, HMC)图 像使得自动细胞检测难以进行。已经为其它应用开发了自动化图像分析，诸如检测细胞培养物中的有丝 分裂细胞(Eccles et al., 1986;幻evecz et al., 1988;美国专利US 4724543; Belienetal., 1997; Cud et al., 2004)。所有已报道的自动算法均采用经典方案 进行定量图像分析1. 获取图像；2. 增强图像；3. 通过设定阈值将图像分割成关注区(region of interest, ROI);并4. 对ROI计数和表征(大小(size)、密度等)。有关这些步骤及每个步骤的众多变量的一般性描述可见于有关图像分析的综述性论文和教科书(例如Oberholzer et al., 1996的组织学图像分析综述 或John Russ的The Image Processing Handbook,第4片反，2002 )。增强关注结构 的表现的最好方法依赖于现有图像(例如显微镜检术照片)和关注结构(例 如核)的表示，而且使用了许多不同变量。然而，增强程序总是用于帮助分 割照片，以鉴定和描绘关注区。 一旦找到并鉴定这些区，可以在面积(area)、 大小(size)、亮度、位置等方面进一步表征这些区。分割自身是通过将像素亮度(intensity)(或像素亮度衍生的函数)与给定 阈值进行比较来进行的。在阈值以上的区域属于关注区(ROI)，它通常是必 须测量的对象(例如核)。为这种分割使用了众多不同算法，但是它们总是 服务于同 一 目的，即图像的分割。Ecclcs et al., 1986的论文介绍了对时移显微镜检图像进行自动化分析以 检测细胞分裂。该论文描述了一种通过分析时移系列图像在同步化哺乳动物 细胞中自动化检测细胞分裂的方法。该论文中所描述的和所使用的图像分析 算法没有利用连续帧中的亮度差异。取而代之的是，它以如下方式分析每幅 图像首先提取高频率的照片组成部分，然后设定阈值，并探寻象征假定的 有丝分裂细胞的环形目标。此操作构成用于检测细胞轮廓及其相对位置的图 像分割。检查连续帧上的环形之间的空间和时间关系，以辨别有丝分裂的发 生。US23185450介绍了另一种方法，其使用自相似矩阵法来分析系列图像。 所述矩阵由归一化的成对相似性值组成。此方法用于分析各帧之间的长期和短期相似性。本申请通过提述并入所有引用的专利和非专利参考文献的全部内容。发明概述本发明涉及用于自动化测定细胞群(例如成群细胞群，如胚胎)的变化的 方法和系统。变化可以是细胞重排，诸如细胞运动(movement)或细胞运动性 (motility)。相关变化还包括细胞分裂和细胞死亡。变化的时间模式和程度/ 大小(magnitude)指示细胞群的质量。由此，本发明有助于在体外受精(IVF) 后选^^供植入用的最佳胚胎，或者，本发明还可用于测定每个时间单位里汇 合细胞培养物中发生的细胞分裂数。可以从观察到的透明带内细胞重排的空间-时间模式推知胚胎质量。可 以从顺序获取的图像之间的差异计算出给定时间点上细胞重排的量。许多不 同的非归一化参数可用于定量变化的量。如下所述， 一种最优选的方法是所得差异图像中的标准偏差(或方差(variance))。与现有技术相反，参数优选 是未归一化的，即它是"差异性，，而非相似性的量度。本发明的一个新颖方 面是胚胎内细胞重排的时间模式可指示胚胎质量。细胞重排对应于胚胎内至 少一个细胞、优选超过两个细胞、最优选所有细胞的运动。细胞重排可能与 细胞分裂有关，但是优势在于其检测迅捷和容易得多，因为不需要直接观察 发生分裂的特定细胞，而是可以通过邻近细胞的相关重排来间接测量。因为 是间接效应，所以我们不需要识别图像中的"关注区"作为分裂对象(事实 上，分裂细胞甚至可以不在图像中)。细胞分裂会引起细胞重排，因为胚胎 细胞由于被透明带所限制，在每次细胞分裂后，细胞彼此撞击，大部分(有 时是所有的)细胞改变位置。然而，其它机制可能不依赖细胞分裂就引起细 胞运动(和细胞重排)，或者可能导致运动(和细胞重排)在细胞质细胞分 裂完成后持续进行。具体而言，本发明涉及如下发现，即从差异图像直接导出的参数与成群细胞群的变化有关联，其中所述差异图像是通过比较成群细胞群的至少两幅 图像得到的。如此，本发明介绍了与现有技术的方法相比有所改进的方法。 在用于分析系列图像诸如时移图像的现有方法，包括增强中，在得到关于胚 胎或细胞的任何信息之前，计算各图像中每个像素在连续帧之间亮度的差 异，以其作为起点用于随后的常规增强和分割图像分析。相应的，在第一个方面，本发明涉及用于测定包含至少一个细胞的细胞 群的变化的方法，所述方法包括以下步骤a) 顺序获取细胞群的至少两幅图像；b) 比较所述至少两幅图像的至少一部分而得到至少一幅差异图像；c) 从所述至少一幅差异图像计算参数；并d) 基于所述计算出的参数确定是否发生了变化。此外，在第二个方面，本发明涉及用于测定包含至少一个细胞的细胞群 的变化的系统，所述系统包括a) 用于顺序获取细胞群的至少两幅图像的部件；b) 用于比较所述至少两幅图像的至少一部分而得到至少一幅差异图像的部件；c) 用于从所述至少一幅差异图像计算参数的部件；和d) 用于基于所述计算得出的参数确定是否发生了变化的部件。在第三个方面，本发明涉及用于选择适于移植、冷冻保存或淘汰的已受 精卯母细胞或胚胎的方法，所述方法包括a) 通过权利要求l-89任一项所限定的方法测定卵母细胞或胚胎的变化；并b) 选择适于移植、冷冻保存或淘汰的卵母细胞或胚胎。在第四个方面，本发明涉及用于确定包含至少一个细胞的细胞群的质量 的系统，所述系统包括a) 用于顺序获取细胞群的至少两幅图像的部件；b) 用于比较所述至少两幅图像的至少一部分而得到至少一幅差异图像的部件；c) 用于从所述至少一幅差异图像计算参数的计算机；和d) 用于基于所述计算得出的参数确定是否发生了变化的部件。在第五个方面，本发明涉及用于测定包含至少一个细胞的细胞群的质量 的方法，所述方法包括以下步骤a) 顺序获取至少两幅细胞群图像；b) 比较所述至少两幅图像的至少一部分而得到至少一幅差异图像；c) 从所述至少一幅差异图像计算参数；并d) 基于所述计算得出的参数确定细胞群的质量。此外，在一个优选的实施方案中，所述细胞群是胚胎或卵母细胞。附图筒述图l。受精后8-60小时、以20分钟为间隔的牛胚胎时移图像的分析。计 算连续帧之间的差异作为差异图像。图上显示了差异图像中所有像素的平均 绝对亮度(空心圓圈)、亮度的标准偏差(实心方形)、和最大观察亮度(实 心三角形)。后一种变量以右边的比例尺显示，其它变量以左边的比例尺显 示。28小时、38小时和48小时后观察细胞分裂。图2。牛胚胎发育的时移系列图像的分析。以20分钟为间隔得到的胚胎 发育过程中的一系列167幅图像的分析。结果堆(stack)显示了计算得出的差异 图像，对其分析而产生了下面显示的运动曲线。可以以表格划界的文本文件的形式输出所有分析参数，供后续加工用。图3，牛胚胎发育的图像。自受精后8小时开始、以20分钟为间隔得到的 167幅图像。图4。从图3所示的胚胎图像计算得出的差异图像。插入了以受精后小时 数表示的每幅图像的获取时间。图5。图4所示ImageJ宏的图形输出。灰线是标准偏差，黑线是平均绝对 差异亮度。图6。细月包(例如在一层饲养/支持细胞上生长的干细胞)汇合单层中细 胞分裂的检测。最上面的图以空心符号显示了全区域的直接分析。下面显示 了四个四分区(如照片所示)的每一个的分析。全区域图的判读是困难的， 但在下面显示的每个四分区中能清楚的观察到细胞分裂。所有数据在理论上 用于例示方法原理。图7。 2个代表性牛胚胎的卵裂球活动。"好的"发育成孵化中的胚泡， 但"差的"从未发育成胚泡。图8。 41个牛胚胎在受精后24-175小时的卵裂球活动。卵裂球活动展示 为假凝胶图像，其中运动性峰表示为暗带，而无活动为白色。每条道对应于 一个胚胎，每个像素对应于在30分钟内得到的差异。图9。
13个代表性牛胚胎的卵裂球活动。发育成孵化中的胚泡的"好" 胚胎以绿色曲线表示。从未发育成胚泡的"差"胚胎以红色显示。X轴是帧 数，Y轴是卵裂球活动。受精后24小时开始图像获取，以每小时2帧前进。绿 色曲线已经通过给卵裂球活动值加上30而沿Y轴移位。图IO。所有已得帧的平均卵裂球活动(亮区域=高卵裂球活动，暗区 域=低卵裂球活动)。图U。未发育成高质量胚泡的21个牛胚胎的卵裂球活动。指出了曲线中 用于将卯裂球活动模式归类的三个部分。
图12。未发育成高质量胚泡的18个牛胚胎的卵裂球活动。指出了曲线中 用于将卵裂球活动模式归类的三个部分。图13。基于下列A)和B)的选择标准的应用A)R1 =胚泡活动模式的部 分1与部分3的平均胚泡活动之间的比率；B)R2=胚泡活动模式的部分2与部 分3的胚泡活动标准偏差之间的比率。图14。对3个代表性胚胎人工检测与自动化检测出的细胞分裂之间的关联。这种算法没有检测出大约10。/。的细胞分裂，但是在其它方面对应关系是 优良的。图5。好胚胎和差胚胎的人工检测出的细胞分裂。发明详述定义细胞分裂期从第一次观察到细胞膜中的凹痕(表明细胞质分裂开始)细胞止的时期。分裂间期自前一个细胞分裂期结束起，至后一个细胞分裂期开始止的时期。分裂周期连续的细胞分裂起始之间的时间间隔，即自前一个细胞分裂 期开始至后一个细胞分裂期开始的时间间隔。细胞运动细胞中心和外部细胞膜的运动。细胞内的细胞器的内部运动 g细胞运动。外部细胞膜是一种动态结构，因而细胞边界会不断地稍微改 变位置。然而，这些轻微波动不视为细胞运动。细胞运动指细胞的重心及其 相对于其它细胞的位置发生改变，以及细胞分裂。细胞运动可以通过计算运动中的细胞的两幅连续的数字图像之间的差异来予以定量。细胞器运动胚胎中内部细胞器和细胞器膜的运动，可通过显微镜检见到。在本申请语境的中细胞器运动不是细胞运动。细月包重排群体中两个或多个细胞的位置的改变。细胞重排牵涉胚胎中两个、优选多个、最优选所有卵裂球的细胞运动。图像与空间分布对应的经过变换或未经过变换的数据集，其中所述空间分布被分成空间像素(2D)或体素(voxel) (3D),这些像素或体素从细胞群体记录得到。应理解，本发明说明书中的像素可以用体素替换，而不偏离本发明的范围。差异图像与空间分布对应的经过变换或未经过变换的数据集，其中所 述空间分布被分成空间像素(2D)或体素(3D),其中所述像素或体素是从两幅 图像的数据集通过逐像素计算而得的。用于测定细胞重排的方法和系统本发明涉及通过分析成群细胞群的时移图像来确定何时发生了细胞变 化以及细胞群的一般活动水平，用于测定细胞群、诸如成群细胞群、诸如发 育中的胚胎中的变化的方法和系统。在本发明的内容中，术语"成群细胞群，，(grouped cell population)指一个 或多个细胞的群体，特别是细胞群中的细胞分裂导致细胞群中一个或多个细 胞的相对位置发生三维变化的一个或多个细胞的群体。如此，成群细胞群优 选是成块(inalump)生长中的细胞群，而非只在一维或二维上生长的细胞群。 成群细胞群的例子有发育中的胚胎或在詞养层上生长的干细胞块或细胞个 体的边界难以辨别的汇合细胞层。胚胎胚胎近似球形，由一个或多个细胞(卵裂球)构成，周围被明胶样的壳， 即称为透明带的细胞基质所包围。透明带执行多种功能，直到胚胎孵化，而 且是良好的胚胎评估标志。该带呈球形、半透明，应当能与细胞碎片清楚地 区分开。胚胎在卵母细胞通过融合或注射精子细胞(精虫)而受精后形成。该术 语传统上还用在孵化(即透明带破裂)和随之发生的着床后。对于人类，已 受精的卵母细胞在前8周传统上称为胚胎。此后(即8周后和所有重要器官形 成后)它称为胎儿。然而，胚胎与胎儿之间的区别一般没有清楚限定。在胚胎发育过程中，卵裂球数目几何增加(l-2-4-8-16-等)。同步细胞分 裂一般维持至胚胎的16细胞阶段。此后细胞分裂变得不同步，最后细胞个体 具有它们各自的细胞周期。对于牛细胞，构成胚胎的细胞直到16细胞阶段为 止都应当能容易地作为球形细胞加以鉴定。在32细胞阶段(桑椹胚阶段)后， 胚胎发生紧密化(compaction)。结果使得此阶段以后胚胎中的细胞个体难以 评估。对于人类，胚胎紧密化发生稍早，而且卵裂球个体在16细胞阶段不易 计数。通常将不孕治疗中生成的人类胚胎在桑椹胚阶段前转移至接受者，而 其它哺乳动物胚胎则往往被实验培养至更进一步的发育阶段(扩大的胚泡) 后再转移至接受者或排出(discharge)。在有些情况下，也将人类胚胎在转移 前培养至胚泡阶段。这样做在下述情况下是优选的在可获得许多高质量的 胚胎时，或者在必须延长培养以等待植入前遗传诊断(PGD)结果时。相应地， 术语"胚胎，，常规地用于指以下各个阶段已受精印母细胞、合子、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚、胚泡、扩大的胚泡和已孵化的胚泡。汇合细胞层和本发明的其它应用例除了发育中的胚胎以外，本发明还可用于检测其它细胞培养物中的细胞分裂。特别关注的是下述场合细胞个体边界难以精确确定的，和涉及分割 和识别细胞对象的经典图像分析难以实施的。这些场合包括对培养块中的细 胞分裂、汇合细胞层(诸如双层或组织样品)之中或之上的细胞分裂的考察。 它还可包括在饲养细胞层之上培养的纟田胞(诸如干细胞)的细胞分裂，或在难 以实施传统分割的其它结构之上培养的细胞的细胞分裂。图像获取术语"图像"用于描述待检查区域的画像，即术语"图像"包括一维表 示(representation)、 二维表示、三维表示、及n维表示。如此，术语"图^象，， 包括该区域的体积(volume)、该区域的矩阵(matrix)、及该区域的信息数组 (array)。成群细胞群的图像可以由任何类型的图像构成，诸如照片、照相胶片 (photographic films)、以及在下述意义上的数字图像通过在CCD芯片、CMOS 芯片、视频摄像机、静像照相机、平板扫描仪、鼓式扫描仪、激光扫描仪、 光电倍增器、数字化仪阵列或任何其它类似图像获取部件上呈现而产生的图 像而言；优选将图像进行数字化以便于后续图像比较。具体而言，图像可以是相差照片、暗视野图像、亮视野图像(使用K6hler 光学)、霍夫曼调制相衬图像、干涉调制相衬(interference modulation contrast) 图像、偏振图像、荧光图像、红外图像、近红外图像、紫外图像、或其组合、 或显现细胞个体和/或细胞器(诸如核)的边界的任何其它类型的光学。通常， 8位图像(即256种不同灰度)是足够的，然而，也可以使用高分辨率(12或 16位)图像。彩色图像可以在分析前转换成灰度图像，但也可以在不同的色 空间或单独的颜色(如可能对合成荧光图像有用的)中加以分析。此外，像素 可以取正值及负值。然而，所讨论的图像是活细胞的图像，因而用于生成图像的部件应当优 选自身不会损害细胞。如此，术语"获取图像"既包括可以从照相机获取图像，又包括从数字存储介质、计算机CPU、硬盘、CDROM、书籍、打印输出、传统照片、扫 描图像、及其它来源获取图像。然而，在大多数情况下将通过数字照相机获取图像。通常，使用显微镜获取图像，诸如安装在显微镜或等效的透镜系统中的 数字照相机。放大倍数和图像分辨率一般不是至关重要的，只要胚胎优选地 覆盖图像中的至少25个像素，诸如图像中的至少100个像素。在一项典型应 用中，胚胎占据数千个像素。 一般而言，应当使用可能的最高对比度和放大 倍数，尽管随后在分析过程中可以缩小照片(见下文)。然而，在很高分辨 率的照片(〉>]兆像素)的情况下，可能必须缩小照片以缩小其尺寸(size)(见 下文)。优选的是，选择所述至少两幅图像的有效分辨率使得所述细胞群的最大 尺度占据l个像素到10兆(mega)像素，优选10个像素到l兆像素，优选50-1000 个像素，优选I00-1000个像素，优选200-1000个像素，优选500-1000个像素， 优选200-500个像素。在一个实施方案中，选择所述至少两幅图像的有效分辨率使得所述细胞 群的最大尺度基本上占据1-10个像素，或者10-50个像素，或者50-100个像素， 或者IOO-200个像素，或者200-500个像素，或者500-IOOO个像素，或者IOOO 个像素-l兆像素，或者1-10兆像素，或者超过10兆像素。优选的是，自细胞群获取一系列连续图像，得到了许多图像，诸如至少2幅图像，诸如至少3幅图像，诸如至少4幅图像，诸如至少5幅图像，诸如至 少6幅图像，诸如至少7幅图像，诸如至少8幅图像，诸如至少9幅图像，诸如 至少10幅图像，诸如至少25幅图像，诸如至少50幅图像，诸如至少100幅图 像，诸如至少200幅图像，诸如至少1000幅图像，诸如至少10000幅图像，诸 如至少100000幅图像，诸如至少l兆幅图像，诸如至少50兆幅图像。两次连续获取之间的时间优选至多对应于一次细胞分裂的时间段，另一 方面，优选获取最少的图像以便于加工。优选的是，两次连续获取之间的时间为至少1/100秒钟，优选至少1/50 秒钟，优选至少1/10秒钟，优选至少l秒钟，优选至少10秒钟，优选至少l分 钟，优选至少2分钟，优选至少10分钟，优选至少30分钟，诸如大约30分钟 或1小时。还有，两次连续获取之间的时间优选为至多2小时，诸如至多1.5小时，诸如至多l小时，诸如至多30分钟，诸如至多20分钟，诸如至多10分钟，诸 如至多5分钟，诸如至多2分钟，诸如至多I分钟。差异图像以前检测胚胎中细胞分裂的尝试试图分割图像来计算存在的卵裂球(= 细胞)的数目并确定该数目何时增加。此方法对基本上平坦的细胞培养物效 果较好，如Eccles所述检测哺乳动物细胞系中的细胞分裂(Eccles et al., 1986)。 然而，对于三维胚胎变得困难得多，此时必须分析并比较来自不同焦平面的 多幅图像，以了解哪些部分是同一卵裂球的一部分。这在实践中是不可能的， 因为图像分割最通常的是对霍夫曼调制相衬(HMC)图像进行的，这种图像易 于由人类目测系统判读，但是不太适于基于计算机的图像分析。本发明不依赖于图像分割来鉴定关注区，诸如卵裂球个体的轮廓。取而 代之的是，本发明评估图像序列中的细胞重排。这是通过来自成群细胞群的 至少两幅图像的至少一幅、优选一系列差异图像得到的。在有些实施方案中， 可以通过比较最近图像与在先图像的线性组合或其它功能相关性来获取差 异图像。评估所述差异图像的至少一项参数来确定成群细胞群中的变化。在 一个优选的实施方案中，差异图像得自细胞群的连续/后续图像。该方法涉及基于所获取的各图像帧来计算差异图像。可以依照本发明应 用任何合适的差异图像，诸如通过两幅图像的差减而得到的差异图像、或通 过建立两幅图像的比率而得到的差异图像。可以从两幅图像的原始图像如原 样地得到差异图像，或者自两幅图像的任何变换图像得到差异图像。后者的 例子有作为两幅原始图像中像素亮度比率的对数变换的差异图像(这等同于 经对数变换的图像之间的亮度差异图像)。在一个优选的实施方案中，差异 图像可以是亮度差异图像。通常，各图像中对应像素的值与获取图像时对应位置受到的光亮度相关 联。然而，其它值类型包括相值，诸如相差，或光谱特征，诸如两条谱带中 的能量比、光谙分布中的重心等等。相应地，在一个不同的优选实施方案中， 差异图像是相差异图像或光谱差异图像。其中，前一种可能适于将本发明的 方法应用于通过相差显微镜得到的图像，而后一种可能适于将本发明的方法 应用于彩色图像和/或更高级的空间分布光谱学。如此，在一个实施方案中，通过将两幅连续图像中对应像素的亮度值相D,，(i,j)表示时间n时位置i,j处的亮度差异，〖，(i，j)表示时间n时位置i,j处的亮度，/^(i,j)表示时间n-l时位置ij处的亮度。差异图像常常显示为图像。这需要适宜的缩放(scaling),因为计算得出 的差异可能是正的，也可能是负的。然而，为了本发明的目的，建立差异的 图像表示不是必要的，因为本发明不依赖于差异图像的分割，而是仅仅依赖 于差异图像中所有像素值的数值分析，D。(x,y)。描绘差异图像的图形表示不 是必需的。如果建立了图形表示，避免舍入(roimd-off)或缩放是有利的，因 为它们可能对算法不利或者甚至有害。在另一个实施方案中，作为各连续图像中像素图像亮度之间的亮度比率 得到差异图像。为了降低噪声、对原始图像和/或比率加以变换可能是有利的。 在一个实施方案中，作为亮度比的对数(自然对数或以10为底的对数)建立 差异图像，例如 比率,flog (/,'(ij)〃n.,(ij))以这种方式计算得出的比率对数图像将表现得与上文所述差异图像非 常相似，可以通过计算下文所述任何一般参数来加以分析，产生相似的有关 细胞分裂等的信息。在一个优选的实施方案中，从一个连续图像序列中在后的(subs叫uent) 两幅图像得到所述差异图像，并且从所述差异图像计算得出的参数集合形成 时间系列。更优选的是，此时间系列包括细胞重排的时间模式，可以将它与 峰、谷和/或基础水平的程度/大小(magnitude)结合进行判读，获知细胞群的 质量、状况和/或状态。在一个优选的实施方案中，使用由PCA分析、SVD、 GPCA、支持矢量 机器(S叩port Vector Machine)、 n元组归类模型、神经网络、前馈神经网络等 机器学习工具得到的模型来分析所述时间系列。以规则时间间隔得到的图像的优点是显而易见的。然而，应当注意，非 规则胶片图像的分析也是可能的。在这种情况中，可以应用加^L来补偿各帧 之间时间间隔的差异。将以短时间间隔得到的各图像之间的差异放大，而将以长时间间隔得到的各图像之间的差异缩小。甚至可能获取具有恒定差异的 图像，如此采用所得到的各图像之间的时间间隔作为细胞分裂的指标。一旦得到了差异图像，就通过计算参数，优选来从差异图像中几乎所有 像素的参数来描述从前一帧图像到后 一帧图像的变化。根据差异图像中所遭 遇的差异值的列表，优选根据所遇到的所有差异值，计算这些参数。参数任何合适的计算参数都可用作变化的指标，诸如从差异图像或其一部分计算得出的参数，其中所述部分是非适应性确定的，所述参数选自差异图 像中各像素绝对值的和；差异图像中各像素绝对值的均值；差异图像中各像 素绝对值的中值；差异图像中各像素的平方值的和;差异图像中各像素的平 方值的均值；差异图像中各像素的平方值数的中值；差异图像中各像素值的 方差；差异图像中各像素值的标准偏差；差异图像的直方图中不同百分位的 值；差异图像值最小和最大值；及差异图像直方图或自这些参数的一项或多 项导出的另一参数的范围或方差。在一个优选的实施方案中，计算参数时没有将系列中的每一帧适应性地 分割成关注区和非关注区。然而，可以非适应性地选择原始图像的一个子部 分(例如通过裁剪原始图像以集中在包含胚胎的那部分)。该子部分优选在 细胞群的同一时移系列的各图像之间是固定的。可以将所分析的子部分(例 如包含胚胎的)与该图像的其它参比区域进行比较以校准所导出的参数。例子有比较差异图像中包含胚胎的区域的标准偏差与差异图像中空白区域类似计算得出的标准偏差。在有些实施方案中，从差异图像的子集计算参数。在一个实施方案中，从差异图像计算得出的参数选自差异图像中各像 素绝对值的和；及差异图像中各像素值的方差。在有些实施方案中，可以将 其它函数应用于差异图像以计算参数。这些参数中每一项都是这样的一个数它会随着成群细胞群中的变化 (诸如细胞分裂)而变化，从而反映所研究的系列图像中细胞边界位置的变化 的。在一个优选的实施方案中，所述参数是基于完整差异图像，从所述至少 一幅差异图像计算的。如上所述，可以从差异图像中的所有像素值计算参数，诸如差异图像中所有像素绝对值的均值； 差异图像中所有像素绝对值的中值； 差异图像中所有像素值的方差； 差异图像中所有像素值的最大值。参数计算的例子有值差之平方的均值 ' 均值=(Tm Di/ ) / (m k) = (iTi— ZkH [ "i」)_ ;i(i，j) ]2) / (m k) 其中lc是图像的长度，m是图像的宽度。 .本发明依赖于如下观察结果，即细胞位置在各次细胞分裂间通常相对固 定，除了每次细胞分裂前后的一个较短时间间隔之外；在该间隔中，细胞一 分为二的分裂导致分裂中的细胞及周围的细胞发生程度可观的重排。此重排 反映在差异图像中，其中细胞边界(即细胞膜)的位置变化导致上述所有差 异图像导出参数的暂时升高，诸如绝对值均值或方差的升高。因此，可通过 差异图像中所有像素绝对值的均值或者任何上文所列其它导出参数的暂时 变化，即升高或降低，来检测细胞分裂。本发明依赖于导出参数中暂时变化的分析。特别关注参数值中显著的极 值——山奪或谷——的开始(onset)、大小(magnitude)和持续时间(duration)。这 些极值、峰或谷常常表示细胞分裂事件，而且可以用这些事件的时刻和持续 时间来表征的给定细胞群，诸如胚胎，及评估其发育潜能。每个峰的形状还 可提供额外信息，而峰的大小(size)—般亦可额外其它信息。峰还可以表示卵 裂球的突然破裂和并发的细胞死亡。然而，根据峰的形状和事件前后基础值 的变化，有可能将细胞分裂事件与细胞死亡事件分开。图l显示了每次细胞分裂以每项导出变量中的显著峰为标志。如此，细 胞分裂可通过多个导出变量中每一个的显著升高来检测，例如图l所示亮度 方差或标准偏差。在一个优选的实施方案中，所述参数表现了所比较图像之间的差异。在 第一个优选的实施方案中，该参数相对于另一个或多个参数保持未归一化， 其中所述另一个或多个参数是通过相同计算从其它获自同 一 细胞群的差异 图像导出的。这使得在自一个细胞群得到的参数值与自另一个细胞群得到的较成为可能。在第二个优选的实施方案中，所述参数 未计算成或调整成O-l之间的归一化值。在第三个优选的实施方案中，计算 得出的参数未与自相似矩阵中的值的计算相关联。如此，本发明提供了这样一种方法，利用该方法，有可能直接测定细胞 分裂，而且有可能测定第 一次细胞分裂的精确时刻。差异图像中变化的形状如上所述，本发明提供了用于确定细胞群变化的开始的方法。然而，在 一个实施方案中，本发明进一步提供了用于测定关于变化的质量和/或数量信 息的方法，因为峰形也被认为是重要的。高而尖的峰应该反映伴随最少碎裂(fragmentation)的快速细胞分裂。而较宽而不太突出的峰可反映较慢的分裂， 可能伴有较多的碎裂。就对应于随后的细胞分裂的峰而言，这一点是更为重 要的，因为第二个尖峰可指示从2个细胞变成4个细胞的同步细胞分裂，而较 宽或甚至双峰型的峰则可指示分裂是不同步的(即2个细胞变成3个细胞，然 后3个细胞变成4个细胞)。总而言之，对峰位置、高度、宽度和形状的详细 分析提供了关于某一特定分裂事件的重要信息。在此语境下，"同步，，理解 为所有的细胞分裂在5小时、更优选3小时、最优选l小时的时间跨度内发生。 在上文中，"高"视为大于计算得出的参数的标准偏差的2倍、优选大于 计算得出的参数的标准偏差的3倍、最优选大于计算得出的参数的标准偏差 的5倍。此外，"尖"视为持续时间短于3小时、更优选持续时间短于2小时、 最优选持续时间为l小时或更短的峰。反之，"宽"峰理解为持续时间长于3小 时、更优选长于5小时、最优选持续时间长于10小时。基础水平在鉴定了峰之后，有可能评估各峰之间的活动的基础水平。基础水平理 解为准稳定的或緩慢变化的值。此值常常定义为变化小于每小时10%、优选 小于每小时5。/。、最优选小于每小时3%的值。分裂与分裂之间每项参数的基 础水平也包含有用的信息。细胞代谢与细胞器的运动(例如线粒体在细胞质 中的循环)有关。这种运动反映上述数种参数的基础水平中。此背景水平给 出了关于细胞群中细胞器运动——这种在细胞死亡后将会停止——的程度 的重要信息。因此，观察到对应于基础水平变化的细胞器运动的部分降低，可暗示一个或多个细胞衰退等问题。通常，该变化表现为所述计算参数的基 线的突然变化，指示至少一个细胞的死亡。此外，所述变化的发生常常是这样的所述变化是基线均值显著升高，接着突然降低。在此语境中，"突然" 理解为在短于5小时、优选短于2小时、最优选短于l小时内的变化，"显著，， 升高理解为在优选短于1小时内超过5。/。、更优选在短于1小时内超过100/。、最 优选在短于卜J、时内超过30。/。的明显增加。最后，"降低"最常见的是轻微升 高接着显著降低至原始值的m/N,其中N表示细胞群中的细胞数，m是O到N-1 的一个整数。在一个实施方案中，使用平均绝对亮度作为总活动的量度，而且各峰之 间此参数的基础水平可视为胚胎发育和可能的发育潜能的指标。为了充分利用基础水平，可能必须将评估范围限制于细胞群的整体轮 廓，并且将此区域的导出值与胚胎以外的对照区域进行比较。如此，为了建 立基础水平，可能需要如文献中所述用标准图像分析规程选择胚胎的轮廓。 这样的例子包括比较胚胎内的细胞运动与胚胎外的运动(因布朗运动配准问 题等所致的)。这一点大多通过描绘胚胎轮廓并比较胚胎内的差异图像与胚 胎外类似区域的算得差异来实现。胚胎轮廓描绘可人工进行，或者自动进行， 后者通过为照片设定包含整个时移系列中所有绝对差异的和的阈值来实现。 可以简单地选择其余像素作为外部区域，或者(优选地)可以通过扩张胚胎 区域然后进行反向选择，省略围绕胚胎的边界像素，来选择外部区域。配准定位系统存在细微的不精确，使得时间系列中的各次图像获取之间载物 台的运动不精确，导致时间系列中的连续图像不是在精确相同的位置采集 的，可造成差异图像不尽完美。这些轻微的位置变化会影响差异图像，因为 所有清晰的结构都会对差异图像产生光圈和阴影效果(halo-and-shadow effect),即使没有发生真实的运动。在一个实施方案中，对时间系列中的连 续图像进行配准，例如使用已有的算法联合本发明来实现这一点，以改善导 出的参数。为配准照片而建立的数种算法已有记载(JohnRuss，2002)。 一种非 常简单的配准照片的方法是比较原始差异图像与将原始图像之一沿指定方 向移动一个像素后计算得出的差异图像。若易位后计算得出的差异图像的方 差小于原始差异图像的方差，则该易位产生了更好的配准。通过系统地尝试所有可能的易位方向和所有相关易位大小(magnitude),有可能得到配准后的 系列。具体地，对于胚胎，可以关于透明带一一即以降低区域对应于透明带 的方差为目标——-进卩亍配准。图像质量的改善和假像的消除在又一个实施方案中，优选改善图像质量并消除假像。假像可能与以下 各项有关获取图像的光学和/或电子途径，例如照相机镜头上的尘埃/斑点、 因照相机假像产生的斑点、因照相机或CCD误差产生的像素误差、由细胞群 产生的、导致亮区的反射。因此，假像指图像上不是图像情景的一部分的任何展示。从而，假像可 以是例如以下一项或多项投射到图像上的不想要的物体、光学系统的散射、 衍射和/或反射。为了补偿不精确移动而进行的易位通常会改变整个图像的位置，包括上 文所述的固定位置的假像。因而，后续的差异将包括来自固定位置假像的假 贡献。因此，在易位前清除固定位置的假像是重要的。可利用不同的标准技 术来清除固定假像(见John Russ, 2002)。 一种简单的型式是获得散焦的参比图 像，并从系列中的每幅照片减去此假像图像。减去不同胚胎的数个非相关帧 的平均照片可以得到类似的效果。数个散焦图像的均值是最佳的。此外，载物台移动中小于1个像素的轻微不精确难以通过易位进行连续 帧的整体配准来消除或补偿。但是，即使是轻微的(小于l个像素)的易位 亦可对差异图像产生显著贡献。高质量照片经常遇到到的另一个问题是细胞 器，诸如液泡和线粒体，它们可能是部分可见的，并且赋予细胞粒状的外观。 细胞群运动对差异图像的贡献可达到这样的程度，使得细胞分裂在细胞器运 动的噪声中变得模糊和不太可见。通过降低图像尺寸(size)(缩小图像)或轻 微地模糊/平滑图像，可以减轻或甚至消除上述两个问题。例如，降低时间系 列中所有图像的图像尺寸(size)使得每个胚胎的直径为100-200个像素是优选 的做法，因为它往往可减少配准的问题并正确地聚焦于细胞分裂而非细胞器 运动。最佳的缩放可能依赖于所获取的时间系列的整体质量。重要的是在消 除固定位置假像和易位补偿等之后再进行上述缩放。在一个优选的实施方案 中，所述缩放或分辨率降低是通过属于下组的方法进行的重采样 (resampling)、 耳又平均(averaging)、 平滑(smoothing)、 运4亍平均4直(runningaverage)、双三次插值(bicubic interpolation), b样条插值、和图像矩阵的简单 縮小(simple reduction),或本领域技术人员显而易见的其它方法。许多照相机系统采用在各帧之间动态缩放图像亮度的自动增益函数。优 选避免这种做法。优选还避免按下述方式计算差异照片使时间系列中的连 续图像相减，然后个别地缩放这些差异图像以使用完整亮度范围，使得差异 图像更易于通过人眼来评估一一这是图像分析程序中通常采用的计算方法。 在图像分析程序的优选设置中应当关闭此缩放。如果这样做不可能，那么定 量分析应当使用不太受此假像影响的方差和标准偏差。对以相同因数从时间 系列计算得出的所有差异图像进行概括的缩放是没有问题的，甚至推荐这样 做以更好地显现差异图像。在一些罕见的精况下，在时间系列中连续图像之 间照明不均匀，此时可能必须在计算亮度差异前对个别帧的图像亮度进行缩 放。在这些情况下，定量分析应当使用不太受亮度缩放假像影响的方差和标 准偏差。培养基在一个优选的实施方案中，图像获取是在细胞群的培养过程中进行的， 例如其中细胞群位于培养基中。用于培养细胞群的手段是本领域已知的。培 养胚胎的一个例子见PCT申请No. WO 2004/056265。胚胎的选择或鉴定本发明进一步提供了选择供移植、冷冻保存或淘汰的胚胎的方法。该方 法意味着已经采用如上所述的测定胚胎变化的方法对胚胎进行了监测，以确 定细胞分裂是在何时发生的，并任选地确定是否发生了细胞死亡，以及确定 细胞分裂的质量和胚胎的整体质量。优选的是选择细胞分裂基本上同步，从 而在差异图像中产生尖极值的胚胎，更优选的是选择没有细胞死亡的胚胎。选择或鉴定方法可以与下文所述其它测量法联合以评估胚胎质量。胚胎 形态学评估的重要标准有(1)胚胎的形状，包括卵裂球的数目和碎裂的程 度；(2)透明带的存在和质量；(3)尺寸(size); (4)颜色和紋理；(5)关于胚 胎的年龄(就其发育阶段而言)的所知情况；和(6)卵裂球膜的完整性。然后可通过本领域技术人员知道的任何合适方法进行移植、冷冻保存高 质量胚胎或清除低质量胚胎。质量的确定细胞边界(即细胞膜)的变化的位置导致差异图像的所有上述导出参数 暂时升高，诸如绝对亮度均值或方差的升高。如此，可通过差异图像中所有 像素的标准偏差或从差异图像计算得出的任何其它导出参数的暂时变化，即 升高或降低，来检测细胞分裂及其持续时间和相关细胞重排，诸如细胞运动 性。在将本发明应用于评估胚胎时，此类参数主要被认为反映了 "卵裂球活 动"。这依赖于如下观察结果，即细胞位置在各次细胞分裂之间通常是相对 固定的，除了每次细胞分裂前后的较短时间间隔之外——此时细胞一分为二 的分裂导致分裂中的细胞及周围的细胞发生短暂但程度可观的重排。相应地，本发明提供了胚胎质量量度，其基于对胚胎的一项或多项测定， 诸如测定至少一个细胞分裂期的长度和/或测定分裂间期的细胞运动和/或测 定分裂间期细胞运动的时间段长度。此量度可用于确定胚胎是否达到足以用 于移植或冷冻保存的质量，或者质量不够而加以淘汰。在一个优选的实施方 案中，选择用于移植或冷冻保存的卵母细胞或胚胎是具有最高胚胎质量量度 的卵母细胞或胚胎，并且/或者，选择加以淘汰的卵母细胞或胚胎是具有最低 胚胎质量量度的卵母细胞或胚胎。特别关注的是细胞分裂的开始、程度(magnitude)和持续时间，它们可以 定量为参数值的峰或谷。这些极值——峰或谷——往往表示细胞分裂事件， 这些事件的时刻和持续时间被用于表征给定细胞群，诸如胚胎，及评估其发 育潜能。每个峰的形状也提供额外的信息，峰的大小(size)—般也可以提供额 外信息。峰还可以表示卵裂球的突然破裂和并发的细胞死亡。然而，根据峰 的形状和事件前后基础值的变化，有可能将细胞分裂事件与细胞死亡事件区 分开。如此，胚胎质量的量度包括关于至少一次细胞分裂的细胞分裂时间、分 裂间期的时间、分裂间期中细胞运动的时间、和/或分裂间期中细胞运动的程 度的信息。在一个优选的实施方案中，胚胎质量的量度包括关于本文所述两 项或多项测定的信息。在一个更优选的实施方案中，胚胎质量的量度包括关 于本文所述的所有测定的信息。胚胎质量的量度基于以下观察结果 a)突然的细胞分裂——其中细胞质的实际分裂快速进行，随之快速发生其它卵裂球位置重排(如尖的卵裂球活动峰) 一一指示高质量的胚胎。长期的细 胞质分裂和此后其它卵裂球的广泛重排则指示低质量的胚胎(例如宽的卵裂球活动峰)(实施例3a);b) 各次细胞分裂之间的卵裂球位置重排很少指示高质量胚胎，而可见的细 胞分裂之间的运动则常常指示低质量胚胎(实施例3a);c) 各细胞分裂间延长的细胞位置重排(例如宽的卵裂球活动峰)常常与胚胎 质量低、细胞分裂不同步和广泛的碎裂相关联(实施例3a);d) 对大多数哺乳动物而言可观察到一个细胞运动很少的静止期，此时胚胎 基因组被激活，且蛋白质合成由母体转录物转向胚胎转录物。若此时期i) 开始早；ii)活动很低(=细胞运动少=静止的)；和iii)终止早，则强有力地指 示高质量胚胎。在低质量胚胎中，静止期常常延迟，且有时被细胞运动打断(实施例3b)。在本文语境中，"早"理解为优选在受精后30小时之前，更优 选在受精后27小时之前，最优选在受精后25小时之前。e) 在随后停止发育的低质量胚胎中，常常观察到独特的持续静止的区域，它 们持续存在且最终导致发育停滞。此类静止区域可能与广泛碎裂或卵裂球死 亡和溶解相关联。如果这些区域在给定的发育阶段大于给定的百分比，那么 胚胎存活的可能性极低。此百分比在一种情况下是至少15%,在另一种情况 下是至少35%,其中预计这些百分比是物种特异性的。在高质量胚胎中，在 每次细胞质分裂事件后不久继发的细胞运动性最初分布在整个胚胎表面上(即所有卵裂球均轻微运动)，只有在桑椹胚阶段中的紧密化之后才见到局 部化的运动(实施例3c);f) 不同时间间隔中细胞运动的量是胚胎质量的良好指示物，其中合适的时间 间隔预计是物种特异性的。可以从不同时间-分区中平均运动的比率和/或不 同时间-分区中标准偏差的比率计算得出质量相关参数。可以基于这些参数 的值来建立胚胎选择程序(实施例3d);g) 若第一次细胞分裂的极早开始，则指示高胚胎质量。若第一次(和后续) 细胞分裂很晚开始，则指示低质量胚胎。然而，对于大多数胚胎而言，确切 的第一次细胞分裂的开始并不能单独提供胚胎质量的清楚指示(实施例3d);h) 后续阶段中的同步化细胞分裂(例如2—4、 4—8)大多见于高质量胚胎， 而不同步的细胞分裂常常见于低质量胚胎(例如2—3—4—5—6—7—8 )(实 施例3a)。以下测定结果指向最高的胚胎质量量度 细胞分裂期短，其中"短"定义为少于l小时； 分裂间期中几乎没有细胞运动，其中"几乎没有"定义为在通常的剥夺(nuctuation)和细胞器运动(它们总是对差异图像有贡献)之外，细胞位置几乎 没有变化。"几乎没有细胞运动"暗示细胞重心是固定的(运动〈3^im),而 且细胞质膜是大体上静止的(<3pm)。,第一次细胞分裂期开始早，即在受精后25小时之前(对于人类胚胎)或在 受精后30小时之前(对于牛胚胎)。 分裂间期中的细胞运动期短，其中"短"定义为少于3小时； 在一段时间内胚胎内细胞运动分布均匀，即在胚胎中不存在较长一4殳时期 (即>24小时)没有观察到细胞运动的不活动区域/地带/体积。此类不活动地 带可能是由于死亡或濒死的卵裂球和碎片所致，它们可阻止进一步的发育。 可以使用神经网络或其它定量模式识别算法来评估上文所述复杂细胞 运动性模式。这样的网络可用于找出质量最好的胚胎供IVF治疗中的转移用。其它量度确定胚胎质量时的第一个分析步骤可以包括将所作的观察与对不同质 量和发育能力的胚胎所作的类似观察相比较，以及比较给定胚胎的参数值与 对同一胚胎所做的其它定量量度。这可以包括与卵裂球运动性、呼吸速率、 氨基酸摄取等在线量度的比较。卯裂球运动性分析、呼吸速率和其它定量参 数的联合数据集有可能改进胚胎选择，为胚胎学家选择最好的转移用胚胎提 供可靠的保证。如此，在一个实施方案中，本发明的方法可以与其它量度结合起来评估 所讨论的胚胎，而且可用于选择转移给接受者的合格胚胎。所述其它量度可选自呼吸速率、氨基酸摄取、运动性分析、卵裂球运 动性、形态学、卵裂球大小(size)、卵裂球成粒(granulation)、碎裂、卵裂球 颜色、极体取向、成核、纺锤体形成和完整性、及许多其它定性量度。呼吸 量度可以如PCT申请No. WO 2004/056265所述进行。数据载体本发明进一步涉及一种数据载体，其包含可直接加载于数字处理装置的存储器中的计算机程序，且包含构成用于如上所述执行本发明方法的手段的 计算机代码部分。数据载体可以是磁盘或光盘，或者是EEPROM或Flash类型的电子卡的形 状，而且设计成装栽到已有的数字处理部件中。实施例实施例l: ImageJ所实现的基础程序图像程序ImageJ使用此程序的宏语言实现了上文概述的基础算法. 1mageJ是由NIH (National Institute of Health, MD， USA)的Wayne Rasband开发 的公用域免费软件。它可以自站点http:〃rsb.info.nih.gov/ii/免费获得。图2是计算过程中该程序的图形输出的一个例子，即用于依照本发明的 算法分析这些图像的ImageJ宏源代码表。macro "1-Open image series" {// Check conditions requires ("l-33r11)// Open image and make selection run ( " Image Sequence , "),' makeRectangle(lOO, 100, 150, 150)//print experiment parameters to logprint ("---------------------")print(" Experiment parameters");print ('，---------------------")print (' )' print ( 'n工nvages : 1 +nlmages)print('nSlices: '+nSlices)zmacro "2 - Crop" {// Check conditions requires("1 33r")-if (nSlice8-=l)exit("Stack required")7 if (aelectioxiType =-l)exit(,'Malce selection first")doCo鹏and (， Crop1 )//-----.............—画macro "3-Difference stack" {// Check conditions requires (， 1 33r,1) saveSettings(〉 7 if (xiS:iiceB"l》exit("Stack required"),'//start settingsrun ("Conversions , " , ，， ")//make difference stackrun ("Duplicate,,,, " title=StacJc-copy duplicate") run ("Delete Slice") setSlice (nSlices) run("Add Slice") setSlice (1)run("Image Calculator. ","image1=Stack operation-Subtract image2=Stack-copy create stack");selectWindow("Stack-copy")run ("Close")//make oval selection selectWirxdow("Result"),' setTool (1)makeOval (30, 30, 90, 90)//clean up restoreSettirxgs ();〃---------...........—...........------.....-—.....macro "4-Measure movement and annotate" {// Check conditions requires("1 33r")/ saveSettings(); if (nSliceB"l)exit ("Stack required"),' if (selectionType---1)exit("Make selection first");//print experiment parameters to log starttime-getNumber ( "Start time(hrs) ，', 24) print ("")'-print('，Start time " + starttime + " hrs"); interval=getNumber ("Interval(hrs) " , 2) print (""),-print ("Interval " + interval + "hrs，') gray:getNumber ("Gray[Black-0, white-255] ",255)//start settingssetColor (gray, gray, gray)setFoiit ("SansSerif " , 12)run("Set Measurements, ", "mean standard modal min redirect None decimal-3 ")ruii("Clea:r Results") j//measurefor (i = l; i<=rxSlices7 i + + ) { setSlice (i) run ("Measure")integer-floor (starttime + (i-1) *int0rval + O 01)'-decimalss:round(10* (starttime + (i-1) *interval)) - integer* 10; setJustification("left") drawstring("Time ",10,20); setJustification(,'right")drawstring (integer + '，. " + decimal + ，， hr" , 90,20〉 } for (i豕O; i<=nSlices-1; i++) {setResult("Time",i,starttime + i*interval);} updateResults()-//Find variables to plot xValues-iiewAriray (nSlices) yValues-riewAarray (nSlices) zValueswiaewArray (nSlices); for (i=s0; i<nSlices; i + + ) {xValues[i〗 =getResult("Time",i); yValues [i] = getResult ("Mean" , i) zValues [i] = getResult ("StdDev" , i)}//Generate PlotPlot create("Movement", "Time", "Mean")/Plot. setliimits (starttime, xValues [nSlices-l] , 0, 25);Plot .setLineWidth"),'Plot,setColor("red")7Plot add("line", xValues, yValues),'Plot, add ("circles" , xValues, yValues)Plot, setColor (green")Plot,add《"line", xValues, zValues)Plot .add ("circles", xValues, zValues)Plot. show()//save resultsselectwindow("Results")run("Text….")；// File>Save As>Text//clean up restoreSettings (),'〃---------------.......匿_......一.....…-----------macro "- " {}// macro "Sample Tool - C0a0I 18f8L818f" { // getCursorliOc (x, y, z, flags)〖// print ("Sample: '，+x+" "+y)//..................................................macro "Annotate" {// Check conditions requires ("l,33r") BaveSettings (),' if (nSlices==l)exit ("Stack required")//print experiment pairameteirs to log sta:rttime getNuraber ("Start time(hrs) " , 24) print (， ") zprint("Start time " + startti鹏+ " hrs"); interval getNumber ("Interval(hrs) ，，, 2) print ("，') 7print ("Interval " + interval + "hrs"》gray=getNumber ("Gray[Black 0, white=255] ",255)//start annotation setColor (gray, gray, gray)'-setFont ("SaixsSerif " , 12);for 《i = l; i"nSlices; i + + ) {setSlice (i),'integex:af loor (starttime + i*interval + 0 . 01)'-decimals=rounci(10* (startti鹏+ i*interval))-integer*10; setJustification("left")-drawstring("Time ",10,20); 8瞎tJuatification("right"),'drawstring (iaateger + "." + decimal + " hr", 90, 20) 7 }//clean up restoreSettings() j才才津+和方法从来自屠宰场的卵巢吸出牛的未成熟丘-卵母细胞复合体(coc)，选择，并在4孔平皿(Nunc， Roskilde， Denmark)中成熟24小时。每个孔装有400fiL碳酸 氢盐緩冲的TCM-199培养基(Gibco BRL， Paisley, UK),添加15。/。牛血清(CS; Danish Veterinary Institute, Frederiksberg, Denmark) 、 10 IU/mL eCG和5 IU/mL hCG (Suigonan Vet; Intervet Scandinavia, Skovlunde, Denmark)。将胚月台在矿物 油下、于38.5。C、在5。/。C02中、在潮湿空气中成熟。在改良的Tyrode氏培养 基中使用冻融的、Percoll选择的精子进行受精。22小时后，通过旋涡震荡除 去丘细胞，并将假定的合子转移至40(HiL培养基，培养基组成为含氨基酸、 柠檬酸盐和肌醇的合成输卵管液培养基(SOFaaci),并补充了抗生素(硫酸庆 大霉素，10mg/ml)和5。/oCS，并于38.5。C在50/0 C02、 5%02、 90%&气氛中 以最大湿度温育。培养箱系统以前就有详细描述，而且已经证明适于体外胚胎培养(Holm etal., 1998)。简而言之，将4孔培养板放置在Nikon TMD倒置显微镜(Diaphot, DFA A/S, Copenhagen, Denmark)的显微镜载物台(MultiCon加l 2000 Scanning stage, Marzhauser, Germany)上。将受空气温度控制器(Air-ThermTw， WorldPrecision Instruments, Aston, UK)调节的黑色聚甲基丙烯酸曱酯有机玻璃 (plexiglas)培养盒(incubator box)安置在载物台周围。将开底的塑料盖子放置 在培养皿上，并将潮湿的混合空气在通过置于培养盒内的空气清洗瓶后通入 此半闭培养室。此培养盒先前已经证明了可用于体外胚胎培养(Holm et al., 1998, 2003),提供稳定的溫度和湿度条件。以实验期间我们每周例行的体外胚胎制备作为 基础培养系统的完整性对照。照相才几系统曰十移记录由图像分析软件(ImageProTM, Unit One, Birkerad, Denmark)管 理，该软件所控制的有扫描平台沿x、 y和z轴的移动，相连的高光敏视频 摄像机(WAT-902H， Watec, DFAA/S, Copenhagen, Denmark)的操作，及时移序 列在计算机硬盘上的记录和存储。在整个培养期间以20分钟为间隔在最小光 照下顺序记录每个胚胎的图像(总放大倍数x265 )。在各次记录之间将胚 胎移出光场。记录第一次出现以下分裂/胚胎阶段的时间对于焦点对准的、有可识别 的卵裂球的合子，记录2-和3-4细胞阶段；对于有可见的粘结细胞团的桑椹胚 和胚泡，记录最大紧密化桑椹胚、胚泡的第一次扩大、和胚泡的瓦解。图3-5显示了各图像的数据系列和活动曲线图(activity profile)形式的分析结果。实施例2:对饲养细胞单层上生长的干细胞中细胞分裂定量的理论例本发明还可用于检测和定量汇合细胞层中每单位时间单位面积(per area) 中的分裂次数(或在饲养细胞汇合层上生长的千细胞中的细胞分裂次数)。 在细胞边界轮廓不清楚，使得细胞个体的检测、划分和计数难以进行时，本 发明是特别有用的。然而，由于细胞分裂将伴随着运动，本发明的运动分析 很可能反映细胞分裂诱发的运动性，只要其它细胞是保持静止的。如此，在 不能辨别细胞个体的情况下，可通过本发明描绘的方法来实现对细胞分裂的 分析。若细胞分裂是罕见事件，因而很少同时发生于图像的不同部分，则该 方法将取得较好的效果。在这样的情况下，整个照片的导出参数的孤立峰 (isolatedpeak)将与细胞分裂相关联。然而，在许多情况下，细胞分裂发生得 更为频繁，在图像的不同部分总会发生某些运动。那么， 一种筒单的解决办法是将图像分割成较小部分(例如2x2、 3x3、或4x4等)，使得每个部分 中细胞分裂的发生相对较不频繁。使用本发明分别分析每个部分的时间系 列，将整个照片的结果相加。使用假设数据、例示原理的理论例见图6。在此^ii、例中，以60个小时 的时间，每20分钟获取汇合细胞培养物的图像。通过计算差异图像并计算每 幅差异图像的方差来分析时移图像系列。然而，因为研究区域中细胞分裂的 次数相对较多(即9),整个照片的方差(上图，空心符号)不易判读。然而， 如果将图像分成四个四分区并分别分析每个四分区，那么每个四分区在所分 析的时间跨度里具有l-3次细胞分裂，这在各个方差图中得到清楚的描绘(下 图，实心符号)。对每个四分区中清楚限定的峰计数，可得到整个区域的细 胞分裂总次数，即60小时里有9次分裂。此假设例例示了理想的情形，其中细胞分裂不是沿着两个分区的边界发 生的，而且没有单次分裂事件的重复计数。然而，如果两个相邻四分区中的 所得峰低于阈值，边界处的细胞分裂也可能被忽略。这样，边缘效应是否会 引起真实值的高估或低估，是否会清楚地呈现有用的近似，是不清楚的。实施例3:测定细胞群的质量胚胎质量评估已经发现有可能基于所观察到的细胞分裂和相关细胞运动的时刻、持续 时间和程度来确定供体外受精(IVF)后植入的最佳胚胎。相应地，第一个目标是通过执行如下方法来确定胚胎质量该方法包括 使用上文所述的测定细胞群变化的方法监测胚胎一段时期，所述时期的长度 足以包含至少一个细胞分裂期和分裂间期的至少一部分，并测定至少一次细 胞分裂期的长度和/或测定分裂间期中的细胞运动和/或测定分裂间期中细胞 运动时期的长度，由此获得胚胎质量量度。然后，可以将所得到的胚胎质量量度用于鉴定和选择适于移植到女性或 雌性子宫中的胚胎，从而实现怀孕和活产婴儿。如此，第二个目标是通过执行上文定义的方法，为在信息充分的条件下 选择为适于移植的胚胎提供可能；所述方法包括监测胚胎，获得胚胎质量量 度，并选择具有最高胚胎质量量度的胚胎。实施例3a:实验、观察结果、分析和讨论材4+和方法从来自屠宰场的卯巢吸出牛的未成熟丘-卵母细胞复合体(coc),选择，并在4孔板(Nunc, Roskilde, Denmark)中成熟24小时。每个孔装有40(VL碳酸氢 盐緩沖的TCM-199培养基(Gibco BRL1 Paisley, UK),添加15。/。牛血清(CS; Danish Veterinary Institute, Frederiksberg, Denmark) 、 10 IlJ/mL eCG和5 IU/mL hCG (Suigonan Vet; Intervet Scandinavia, Skovlunde, Denmark)。 ^寻胚月台在石广物 油下、于38.5。C、在5°/。(302中、在潮湿空气中成熟。在改良的Tyrode氏培养 基中使用冻融的、Percoll选择的精子进行受精。22小时后，通过旋涡震荡除 去丘细胞，并将假定的合子转移至400(iL培养基，培养基组成为含有氨基酸、 柠檬酸盐和肌醇的合成输卵管液培养基(SOFaaci)，补充抗生素(石克酸庆大霉 素，10mg/nil)和5% CS，并于38.5。C在5。/。 C02、 5% 02、 90。/。N2气氛中以最 大湿度溫育。培养箱系统以前就有详细描述，而且已经证明适于体外胚胎培养(Holm et al. 1998)。简而言之，将4孔培养板放置在Nikon TMD倒置显微镜(Diaphot, DFA A/S, Copenhagen, Denmark)的显孩14竟载物台(MultiControl 2000 Scanning stage: Marzhauser, Germany)上。将受空气温度控制器(Air-ThermTM, World Precision Instruments, Aston, UK)调节的黑色聚曱基丙烯酸曱酯有机玻璃培养盒安置 在载物台周围。将开底的塑料盖子放置在培养皿上，并将潮湿的混合空气在 通过置于培养盒内的空气清洗瓶后通入此半闭培养室。此培养箱体先前已经证明了可用于体外胚胎培养(Holm et al. 1998, 2003),提供稳定的温度和湿度条件。以实验期间我们每周例行的体外胚胎 制备作为基础培养系统的完整性对照。照相才几系统时移记录由图像分析软件(ImageProTM, Unit One, Birkerad， Denmark)管 理，该软件所控制的有扫描平台沿x、 y和z轴的移动，相连的高光敏视频 摄像机(WAT-902H, Watec, DFAA/S, Copenhagen, Denmark)的操作，及时移序 列在计算机硬盘上的记录和存储。在整个7天培养期间以30分钟为间隔在最 小光照下中顺序记录每个胚胎的时移图像(总放大倍数x265 )。在各次记 录之间将胚胎移出光场。时移系列图像的人工分析包括记录第 一 次出现以下分裂/胚胎阶段的时 间2细胞、4细胞、8细胞、16细胞，而且对于有可见的粘结细胞团的桑椹胚和胚泡，记录最大紧密化桑椹胚、胚泡的第一次扩大、胚泡的瓦解、和胚 泡的將化。自动化的基于计算机的分析包括计算作为两幅之间的差异计算得出的 差异图像的标准偏差。为了避免配准假像和其它问题，使用如下所述的详尽程序1) 图像获取(见上文描述)；2) 消除固定位置假像(照相机-尘埃)，通过从系列中的每幅照片减去假像的 散焦参比图像；3) 易位以补偿不精确的载物台移动。 一种非常简单的配准照片的方法是比 较原始差异图像与将原始图像之一沿指定方向移动一个像素后算出的差异 图像。若易位后计算得出的差异图像的方差小于原始差异图像的方差，则该 易位产生了更好的配准。通过系统地尝试所有可能的易位方向和所有相关的 易位大小/程度(magnitude),有可能得到配准的时间系列。然而，在本案中我们使用Thevenaz et al., 1998.开发的高级ImageJ宏进行图像配准。4) 鉴定关注区(ROI)和外部参比区域。比较胚胎内的细胞运动与胚胎外的"运动"(因布朗运动配准问题等所致)是有利的。这是通过描绘胚胎轮廓并比 较胚胎内的差异图像与胚胎外类似区域中计算得到的差异来实现的。描绘胚 胎轮廓是人工进行的。我们所选择的参比区域是图像是不含任何胚胎的区 域；5) 计算亮度差异；6) 计算每幅差异图像的导出参数。计算了数项差异参数，但被证明是最具 信息性的一项参数是差异图像中所有像素的亮度的标准偏差。此参数在下文 及后续实施例中称为"卯裂球活动"；7) 鉴定并确定卵裂球活动的峰的形状；见实施例3d。 实验设计将大约20枚牛胚胎在4孔Nunc皿的一个孔中一起温育7天，每30分钟获取 图像。此实验总共重复5次，得到了99枚牛胚胎的时移系列图像。 结果基于发育中的胚胎的时移图像系列的定性评估(主要是通过观看，播放录相多次，注意变化)，我们观察到高质量胚胎的指示现象之一是突然的 细胞分裂，其中细胞质快速地发生实际分裂，随之其它卵裂球位置发生快速 的重排，接着是一段细胞位置重排很少的"静止"期，直到突然发生下一次 细胞质分裂。低质量胚胎常常在细胞质分裂后和细胞质细胞分裂之间显示长 时间的卵裂球位置重排。为了定量和记录观察结果，我们根据时移系列图像 计算了卵裂球活动。图7分别显示了一个"好"胚胎和一个"差"胚胎的代表性卵裂球活动。 被视为"好"的胚胎发育成孵化中的胚泡，而被视为"差，，的胚胎从未发育 成胚泡。有些观察到的活动是由于不同步的细胞分裂(例如 2—3—4—5—6—7—8)和碎裂，而非对高质量胚胎观察到的同步细胞分裂(例如2—4、 4—8)所致。在图8中，以假凝胶图像的形式展示了41枚胚胎 的卵裂球活动，其中运动性峰以暗带表示，而无活动为白色，每条道对应于 一个胚胎。暗带图样或拖尾反映胚胎内的细胞运动期。正在发育成胚泡的"好"胚胎显示在未发育到胚泡阶段的"差"胚胎的上面。好胚胎显示更尖 的起始带(通常是三条)。实施例3b:实验、观察结果、分析和讨论才才津+和方法与实施例3a相同。结果哺乳动物胚胎中的初始蛋白质合成是利用来自卵母细胞的母体mRNA, 但经过少数几次细胞分裂后，胚胎基因组被激活、转录和翻译。由母体基因 组转向胚胎基因组是胚胎发育中的关键步骤。对于牛，该时期发生在8细胞 阶段，而且持续时间较长；对于人类胚胎，该转换发生得更早，在4至8细胞 阶段，而且持续时间较短。对于大多数哺乳动物，在胚胎基因组激活且蛋白质合成由母体基因转向 胚胎基因时，观察到一个细胞运动极少的静止期。若此时期i)开始早；ii)活 动很低(=细胞运动少=静止)；且iii)终止早，则强有力地指示高质量胚胎。 在低质量胚胎中，静止期常常被延迟，有时被细胞运动打断。图9显示了一个这样的例子，其中13枚不同胚胎显示实施例3a定义的卵裂球活动。暗带图 样或拖尾反映胚胎内的细胞运动期。正在发育成胚泡的"好"胚胎显示在未 发育到胚泡阶段的"差"胚胎的上面。好胚胎显示更尖的起始带(通常是三条)。实施例3c:实验、观察结果、分析和讨论材料和方法与实施例3a相同。结果在随后停止发育的低质量胚胎中,常常观察到独特且持续静止的区域， 它们持续存在且最终导致发育停滞。此类静止区域可能与广泛碎裂或卵裂球 死亡和溶解相关联。如果这些区域在给定的发育阶段大于给定的百分比，那 么胚胎存活的可能性极低。。在高质量胚胎中，在每次细胞质分裂事件后不 久继发的细胞运动性最初分布在整个胚胎表面上(即所有卵裂球均轻樣史运 动)，只有在桑椹胚阶段中的紧密化后才见到局部化的运动。发育成胚泡的胚胎，如图10的左图，具有均匀的卵裂球活动分布(实施 例3a限定的)。卵裂球活动分布不均匀的胚胎，如图10的右图，从未发育成 胚泡。实施例3d:实验、观察结果、分析和讨论才才津+和方法与实施例3a相同。结果不同时间间隔中细胞运动的量是胚胎质量的良好指示物。可以从不同时 间-分区中平均运动的比率和/或不同时间-分区中标准偏差的比率计算得出 质量相关参数。可以基于这些参数的值来建立胚胎选择程序。不同分区(= 部分)的例子见图11和图12。在本案中，第l部分是受精后32-60小时，第二 部分是受精后60-75小时，第3部分是受精后75-96小时的时间区段。基于不同部分中的平均卵裂球活动和/或卵裂球活动的标准偏差(实施例 3a定义的)，有可能将胚胎归类。在本案中，我们使用了基于以下各项的选择标准 Rl =给定胚胎的胚泡活动模式的第1部分中的平均胚泡活动与第3部分中 平均胚泡活动之间的比率 R2 =给定胚胎的胚泡活动模式的第2部分与第3部分的胚泡活动的标准偏 差之间的比率计算见图13。若R1 < 1.15且R2〈0.50，则它是"好的"胚胎，否则，它是"差的"胚 胎。根据后续发育情况，39枚胚胎中有36枚使用这些标准得到了正确的归类。实施例3e:实验、观察结果、分析和讨论材并+和方法与实施例3a相同。结果图14显示了对细胞分裂起始的自动确定与人工确定之间优良的相应性。 第一次细胞分裂的很早开始指示高胚胎质量。第一次(和后续)细胞分 裂很晚开始指示低质量胚胎。然而，对于大多数胚胎，然而，对于大多数胚 胎而言，确切的第 一 次细胞分裂的开始并不能单独提供胚胎质量的清楚指 示，见图15。尽管差胚胎细胞分裂的平均开始延迟，但巨大的固有标准偏差使得绝对 值作为选择标准是较差的，除了极值情况下之外。例如第一次分裂在30小时 内指示好胚胎，第一次分裂在35小时后指示差胚胎，但是所研究的绝大多数 牛胚胎的分裂时间处于中间，不易判读。Bdien JAM, Baak JPA, Van Diest PJ and Van Ginkd AHM (1997) Counting mitoses by image processing in fei)lgen stained breast cancer sections: The influence of resolu- tion. 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权利要求
1.用于测定包含至少一个细胞的细胞群中的变化的方法，所述方法包括以下步骤a)顺序获取细胞群的至少两幅图像；b)比较所述至少两幅图像的至少一部分而得到至少一幅差异图像；c)从所述至少一幅差异图像计算参数；和d)基于所述计算得出的参数确定是否发生了变化。
2. 权利要求l的方法，其中所述参数是从所述至少一幅差异图像基于完 整差异图像计算得出的。
3. 权利要求l或2的方法，其中所述参数相对于其它一个或多个参lt是维 持未归一化的，所述其它一个或多个参数是从获自同一细胞群的其它差异图 像通过相同的计算导出的。
4. 前述权利要求任一项的方法，其中所述参数未计算成或调整成O-l之 间的归一化<直。
5. 前述权利要求任一项的方法，其中所述参数表现所比较图像之间的差
6. 前述权利要求任一项的方法，其中所述参数未与自相似矩阵中的值的 计算相关联。
7. 前述权利要求任一项的方法，其中所述参数是在没有将图像适应性分 割成关注区和非关注区的条件下计算的。
8. 前述权利要求任一项的方法，其中所述细胞群是胚胎。
9. 前述权利要求任一项的方法，其中所述细胞群的变化是细胞重排，诸 如细月包运动。
10.前迷权利要求任一项的方法，其中所述细胞群的变化是细胞重排， 其中超过两个细胞发生运动，诸如其中大多数细胞发生运动，诸如其中所有 细月包发生运动。
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述细胞群的变化是细胞分裂。
12. 前述权利要求任一项的方法，其中所述细胞群的变化是至少一个细月包的死亡。
13. 前述权利要求任一项的方法，其中所述差异图像是通过将所述至少两幅图像中相应像素的值相减得到的。
14. 前述权利要求任一项的方法，其中所述差异图像是通过将所述至少 两幅图像中相应像素的经变换的值相减，诸如将所述至少两幅图像中相应像 素的值的对数相减而得到的。
15. 前述权利要求任一项的方法，其中所述差异图像是通过计算所述至少两幅图像中相应像素的值的比率得到的。
16. 前述权利要求任一项的方法，其中从差异图像计算得出的所述参数 选自差异图像中像素绝对值的和；差异图像中像素绝对值的均值；差异图 像中像素绝对值的中值；平方值的和；差异图像中像素的平方值的均值；差 异图像中像素的平方值的中值；差异图像中像素值的方差；差异图像中像素 值的标准偏差；图像的直方图中不同百分位的值；差异图像的最小值和最大 值；及直方图的范围或方差或从这些参数的 一项或多项的组合导出的另 一参 数。
17. 前述权利要求任一项的方法，其中从差异图像计算得出的所述参数 选自差异图像中像素绝对值的和；差异图像中像素值的标准偏差；及差异 图像中像素值的方差。
18. 前述权利要求任一项的方法，其中所述差异图像是亮度差异图像。
19. 前述权利要求任一项的方法，其中对应于差异图像中的像素的值是 亮度的差异。
20. 权利要求1-17任一项的方法，其中所述对应于差异图像中的像素的 值是相的差异，诸如相衬的差异。
21. 权利要求1-17任一项的方法，其中所述对应于差异图像中的像素的 值是光谱特征的差异。
22. 前述权利要求任一项的方法，其中在进行所述比较以得到至少一幅 差异图像之前，对所述至少两幅图像进行配准。
23. 前述权利要求任一项的方法，其中在进行所述比较以得到至少一幅 差异图像之前，消除所述至少两幅图像中的图像假像。
24. 前述权利要求任一项的方法，其中在进行所述比较以得到至少一幅 差异图像之前，对所述至少两幅图像进行相同的缩放。
25. 权利要求24的方法，其中所述缩放是分辨率的降低。
26. 权利要求24和25的方法，其中所述分辨率的降低是通过属于下组的方法进行的重采样、取平均、平滑、运行平均值、双三次插值、b样条插 值、和图像矩阵的简单缩小。
27. 前述权利要求任一项的方法，其中所述至少两幅图像是至少三幅图像，且这些图像是以规则的时间间隔得到的。
28. 前述权利要求任一项的方法，其中所述至少两幅图像是至少三幅图 像，且这些图像是以不规则的时间间隔得到的。
29. 前述权利要求任一项的方法，其中从连续图像序列得到多幅差异图 像，且所述计算得出的参数的变化指示细胞群的变化。
30. 权利要求29的方法，其中每一幅所述差异图像均是从在后的两幅图 像得到的，且从所述差异图像计算得出的参数集合形成时间系列。
31. 权利要求29或30的方法，其中所述计算得出的参数的极值指示细胞 重排，诸如细胞运动性。
32. 权利要求29-31任一项的方法，其中所述计算得出的参数的极值指示 细胞分裂。
33. 权利要求29-32任一项的方法，其中所述极值是峰。
34. 权利要求33的方法，其中所述峰的形状指示细胞群中所发生的变化 的性质。
35. 权利要求33至34的方法，其中高而尖的峰指示快速的细胞分裂，且 碎裂最少。
36. 权利要求35的方法，其中所述高而尖的峰指示细胞群中基本上同步 化的细胞分裂。
37. 权利要求33或34的方法，其中宽的和/或双峰型的峰指示较慢的细胞 分裂，且可能有较多碎裂。
38. 权利要求37的方法，其中所述宽的和/或双峰型的峰指示不同步的细 胞分裂。
39. 前述权利要求29-38任一项的方法，其中所述计算得出的参数的基础 水平的突然变化指示至少 一个细胞的死亡。
40. 权利要求39的方法，其中所述变化是基础水平平均值显著升高，继 而突然降低。
41. 前述权利要求任一项的方法，其中将成群细胞群的变化的测定结果 与成群细胞群的其它量度进行比较。
42. 权利要求41的方法，其中所述其它量度选自呼吸速率、氨基酸摄 取、运动性分析、形态学、卵裂球大小、卵裂球粒化、碎裂、卵裂球颜色。
43. 前述权利要求任一项的方法，其中所述成群细胞群在获取所述至少 两幅图像的过程中位于培养基中。
44. 用于确定包含至少一个细胞的细胞群的质量的方法，所述方法包括 以下步骤a) 顺序获取细胞群的至少两幅图像；b) 比较所述至少两幅图像的至少一部分以得到至少一幅差异图像；c) 从所述至少一幅差异图像计算参数；d) 基于所述计算得出的参数确定细胞群的质量。
45. 权利要求44的方法，其中所述参数相对于其它一个或多个参数是维 持未归一化的，所述其它一个或多个参数是从获自同一细胞群的其它差异图 像通过相同的计算导出的。
46. 权利要求44或45的方法，其中所述参数未计算成或调整成O-l之间的归一化值。
47. 权利要求44或46的方法，其中所述参数表现所比较图像之间的差异。
48. 权利要求44-47任一项的方法，进一步包括权利要求l-"的任何特征。
49. 用于确定胚胎质量的权利要求44-48任一项的方法，包括监测胚胎一 段时期，所述时期的长度足以包含至少一个细胞分裂期和分裂间期的至少一 部分，并测定至少一个细胞分裂期的长度和/或测定分裂间期中的细胞运动和 /或测定分裂间期中细胞运动期的长度，由此获得胚胎质量量度。
50. 权利要求49的方法，其中监测胚胎一段时期，所述时期包含至少两 个细胞分裂期。
51. 权利要求49的方法，其中监测胚胎一段时期，所述时期包含至少三 个细胞分裂期。
52. 用于确定胚胎质量的权利要求44-48任一项的方法，包括监测胚胎一 段时期，所述时期的长度足以包含至少一个细胞重排时期和一个没有实质性 细胞重排的时期，并使用权利要求l-43任一项所述的方法来测定细胞重排的 时间分布，从而得到胚胎质量量度。
53. 权利要求52的方法，其中监测胚胎一段时期，所述时期包含至少两个细胞分裂期。
54. 权利要求52的方法，其中监测胚胎一段时期，所述时期包含至少三 个细胞分裂期。
55. 权利要求44-54任一项的方法，其中测定各个重排期和/或细胞分裂 期的时间长度。
56. 权利要求44-55任一项的方法，其中测定各个重排期和/或细胞分裂 期之间的时间长度。
57. 权利要求44-56任一项的方法，其中测定至少两个分裂间期中的细胞 运动期。
58. 权利要求44-57任一项的方法，其中测定至少两个分裂间期中的细胞 运动程度。
59. 权利要求44-58任一项的方法，其中所述至少两个分裂间期是在后的分裂间期。
60. 权利要求44-59任一项的方法，其中进行至少一个细胞分裂期的长度 的测定和分裂间期中细胞运动的测定。
61. 权利要求44-60任一项的方法，其中进行至少一个细胞分裂期的长度 的测定和分裂间期中细胞运动的时期的测定。
62. 权利要求44-61任一项的方法，其中进行至少一个细胞分裂期的长度 的测定和分裂间期中细胞运动的测定和分裂间期中细胞运动的时期的测定。
63. 权利要求44-62任一项的方法，其中突然的细胞分裂是高质量胚胎的 指示。
64. 权利要求44-63任一项的方法，其中细胞分裂后细胞重排的持续时间 短是高质量胚胎的指示。
65. 权利要求64的方法，其中所述细胞重排的持续时间是通过权利要求 1 -43 4壬 一 项所述的方法测定的。
66. 权利要求44-65任一项的方法，其中通过权利要求l-43任一项所述方 法测定的高而尖的参数峰是高质量胚胎的指示。
67. 权利要求63的方法，其中所述突然的细胞分裂表现为卵裂球活动中 的尖峰。
68. 权利要求63的方法，其中所述突然的细胞分裂表现为通过权利要求 1 -43任一项所述方法测定的高而尖的参数峰。
69. 权利要求44-68任一项的方法，其中长期的细胞质分裂和随后其它卯裂球广泛的和/或长期的重排是低质量胚胎的指示。
70. 权利要求69的方法，其中所述其它卵裂球广泛的和/或长期的重排表 现为卵裂球活动中的宽峰。
71. 权利要求69的方法，其中所述长期的细胞质分裂和随后其它卵裂球 广泛的和/或长期的重排表现为通过权利要求l-43任一项所述方法测定的宽 的参数峰。
72. 权利要求44-71任一项的方法，其中在细胞分裂之间卵裂球位置重排 几乎没有持续时间和/或持续时间短是高质量胚胎的指示，而在细胞分裂之间 广泛和/或长期的运动则是低质量胚胎的指示。
73. 权利要求72的方法，其中所述运动是通过权利要求l-43任一项所述方法表现的。
74. 权利要求44-73任一项的方法，其中在细胞分裂之间长期的细胞位置 重排常常与低胚胎质量、不同步细胞分裂和广泛碎裂相关联。
75. 权利要求74的方法，其中所述长期的重排表现为卵裂球活动中的宽峰。
76. 权利要求74的方法，其中所述长期的细胞位置重排表现为通过权利 要求l-43任一项所述方法测定的宽参数峰。
77. 权利要求44-76任一项的方法，其中胚胎中广泛而持续静止的区域指示低质量胚胎。
78. 权利要求77的方法，其中"广泛"是指所观察的横截面总面积的至 少30%。
79. 权利要求77的方法，其中"广泛"是指所观察的横截面总面积的至 少15%。
80. 权利要求44-80任一项的方法，其中在桑椹胚阶段中的紧密化发生之 前不存在无运动的静止区是高质量胚胎的指示。
81. 权利要求44-80任一项的方法，其中合适的时间-分区中平均运动的 比率和/或不同时间-分区中差异图像的标准偏差的比率是质量参数。
82. 权利要求81的方法，其中所述时间-分区对于牛胚胎而言基本上是受 精后32-60小时和/或受精后60-75小时和/或受精后75-90小时。
83. 权利要求81至82的方法，其中所述合适的时间-分区是物种特异性的。
84. 权利要求44-83任一项的方法，其中第一次细胞分裂的早开始至少是 高胚胎质量的共同指示。
85. 权利要求44-84任一项的方法，其中在后来的阶段中的同步细胞分裂 是高质量胚胎的指示，而不同步细胞分裂是低质量胚胎的指示。
86. 权利要求44-85任一项的方法，其中若细胞分裂期显著短于l小时， 则胚胎质量量度提高。
87. 权利要求44-86任一项的方法，其中若分裂间期几乎没有细胞运动， 则胚胎质量量度提高。
88. 权利要求44-87任一项的方法，其中若第一次细胞分裂开始早，即对 于人类胚胎而言在受精后25小时前，则胚胎质量量度提高。
89. 权利要求44-88任一项的方法，其中若细胞重排诸如细胞运动在胚胎 中经时均匀分布，则胚胎质量量度提高。
90. 用于选择适于移植、冷冻保存或淘汰的受精卵母细胞或胚胎的方法， 所述方法包括a) 通过权利要求l-89任一项所述方法测定卵母细胞或胚胎的变化；并b) 选择适于移植、冷冻保存或淘汰的卵母细胞或胚胎。
91. 权利要求90的方法，其中所选择的卵母细胞或胚胎是具有最高胚胎 质量量度的卵母细胞或胚胎。
92. 权利要求卯的方法，其中所选择的卵母细胞或胚胎是具有最低胚胎 质量量度的卵母细胞或胚胎。
93. 权利要求90的方法，其中所选择的卵母细胞或胚胎是这样的卵母细 胞或胚胎，其在通过权利要求l-44任一项所述的方法所测定的一个参数上具 有独特的属性，诸如独特的时间模式。
94. 用于测定包含至少一个细胞的细胞群的变化的系统，所述系统包括a) 用于顺序获取细胞群的至少两幅图像的部件；b) 用于比较所述至少两幅图像的至少一部分以得到至少一幅差异图像的部件；c) 用于从所述至少一幅差异图像计算参数的计算机；和d) 用于基于所述计算得出的参数确定是否发生了变化的部件。
95. 权利要求94的系统，其中所述计算机使得所述参数相对于其它一个或多个参数维持未归一化，所述其它一个或多个参数是从获自同一细胞群的 其它差异图像通过相同的计算导出的。
96. 权利要求94或95的方法，其中所述计算机不将所述参数计算成或调 整成O-1之间的归 一化值。
97. 权利要求94-96的方法，其中由所述计算机计算得出的所述参数表现 所比较图像之间的差异。
98. 权利要求94-97的系统，其包括权利要求l-43任一项的一个或多个特征。
99. 用于确定胚胎质量的系统，其包括用于监测胚胎一段时期的部件， 所述时期的长度足以包含至少一个细胞分裂期和分裂间期的至少一部分，所 述系统进一步包括用于测定所述至少一个细胞分裂期的长度和/或测定分裂 间期中的细胞运动和/或测定分裂间期中细胞运动时间段的长度的部件，并且 包括用于基于对一个或多个细胞分裂期和一个或多个分裂间期的测定来测 定胚胎质量量度的部件。
100. 权利要求99的系统，其包括用于测定权利要求44-89任一项所限定 的一个或多个特征的部件。
101. 权利要求99或100的系统，其包括权利要求l-43任一项的一个或多 个特征。
102. 用于测定包含至少一个细胞的细胞群的质量的系统，所述系统包括a. 用于顺序获取细胞群的至少两幅图像的部件；b. 用于比较所述至少两幅图像的至少一部分以得到至少一幅差异图像的部件；c. 用于从所述至少一幅差异图像计算参数的计算机；和d. 用于基于所述计算得出的参数确定是否发生了变化的部件。
103. 权利要求102的系统，其包括用于测定权利要求44-89任一项所限定 的一个或多个特征的部件。
104. 权利要求102或103的系统，其包括权利要求l-43任一项的一个或多 个特征。
全文摘要
本发明涉及用于测定细胞群中的变化的方法和系统，以及使用所述方法和系统来评估胚胎的质量量度和选择供体外受精用的胚胎的方法，所述方法包括以下步骤顺序获取至少两幅细胞群图像，比较所述至少两幅图像的至少一部分而得到至少一幅差异图像，从所述至少一幅差异图像计算参数，基于所述计算得出的参数而确定是否发生了变化。
文档编号G06T7/00GK101331500SQ200680047484
公开日2008年12月24日 申请日期2006年10月16日 优先权日2005年10月14日
发明者于尔根·伯恩特森, 尼尔斯·B·拉姆辛 申请人:尤尼森斯繁殖技术公司