一种以Keap1为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法

专利名称：一种以Keap1为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选方法，尤其涉及以keapl为靶点、利用分子对接的药物虚拟 筛选方法进行的新型防癌抗癌药物的筛选方法。
背景技术：
癌症是人类的大敌，尤其肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌等发 病及死亡率近年仍居高不下。为了战胜癌症，几乎每个国家都花费了大量资金和人力。根 据世界卫生组织报告，2000年全球新发癌症病人1010万人，死亡620万人，现患癌症病例 2240万。全球癌症仍呈上升趋势，据世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球总人口将 达80亿，癌症新发病例将达2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为新世纪人类的第一杀 手。经医学界普遍认同，癌症并非死亡之神。自20世纪90年代开始，美国、加拿大、澳大利 亚等西方发达国家常见癌症开始下降，日本癌症死亡已趋平稳不再升高。这种变化，令人振 奋和鼓舞。而发展中国家增长加快，癌症病人中60%发生在发展中国家。我国2000年癌症 发病人数为200万，死亡150万。据统计，1991年-2000年我国城市居民中癌症死亡率上升 了 18. 1%，农村居民中癌症死亡率上升了 11. 03%，平均每死亡5人就有一人死于癌症。我 国正处于由发展中国家向发达国家癌谱过渡的时期。在各种致癌因子作用下，正常细胞发展成肿瘤细胞是一个长期和隐蔽过程。有充 足证据表明癌基因的持续活化或/和抑癌基因的失活是由于致癌物质对DNA不断损伤造成 的。癌变过程是由多因素引起，经历多个阶段并涉及到多条信号传递通路的异常。近数10 年研究表明癌变过程是可被放慢、阻止和逆转的。因此，阻止癌变过程是预防癌症的最有效 策略。尽管紫外线、病毒等能引起癌变，但化学致癌剂是癌变的首要因素。一般来说，化 学致癌物质进入机体后首先会被人体的解毒系统代谢。人体中肝脏的解毒机制有二道程 序分别称为Phase I与Phase II解毒系统。Phase I是第一道解毒程序，此系统主要由 Cytochrome P450酶组成，在解毒过程扮演着一个氧化与分解毒素的角色，但经Phase I活 化后的毒素有可能比原来的分子更具毒性，因此需藉由第二道的Phase II酶系统来去除 毒性；Phase II酶系统的功用即是发挥解毒作用、使这些分子失去活性，中和毒素分子对细 胞、DNA的伤害。生物体的保护系统在收到刺激后通过迅速增加II相酶的数量起到保护 作用。这种酶可以有效地抵消毒素损伤DNA并且引发癌症的能力。Phase II酶系统包括 Glutathione transferase, Quinone reductase等，都具有超强的防癌抗癌及预防细胞突 变的功能。例如其中的Quinone reductase (QR，苯醌还原酶)是研究得最为广泛的Phase II酶之一。目前认为phase II酶水平的增加可以提供对抗癌症的一个相当有效的途径。 而通过筛选具有phase II酶诱导作用的化合物可以看作是化学防癌新药研发的一个非常 有效的方法。传统的药物筛选无论是动物水平筛选还是高通量细胞平台筛选，都存在着天然 药物及食物成分复杂，从确认提取物有潜在防癌功效到确定有效成分，到最终分离出单体成分需要花费大量的人力，时间和精力，筛选化合物的速度和效率极低，周期长，阳性率低 (0.01% 0. 1%)0因此，近年来虚拟筛选方法的发展和在新药研究中的应用受到了广泛 的重视。于是建立一套高效、有效、速效的中药化学防癌药物筛选体系成为当务之急。

发明内容
本发明的目的是建立一种新颖，快速，高效的以keapl为靶点的药物虚拟筛选方 法，以弥补现有方法的不足。本发明的机理是研究表明，与Phase II酶的调节关系最为密切的是Keapl/Nrf2/ARE通路，这是一 个与氧化剂和亲电试剂致癌作用密切相关的信号调节系统。生理状态下，Nrf2与Keapl偶 联并与肌动蛋白结合而被锚定在胞浆中。Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1) 是一种泛素连接酶，与另一种连接泛素的蛋白⑶L3组成复合体与靶蛋白如转录因子Nrf2 相连。研究还发现某些具有α，β-不饱和结构单元的天然药物(迈克尔反应受体分子， 含有α，β-不饱和结构单元的化学小分子配体，其共轭结构产生的吸电子基团能与亲核 试剂发生迈克尔加成反应)，通过与Keapl半胱氨酸残基的巯基发生迈克尔加成反应，以共 价键修饰其半胱氨酸残基，促进Keapl泛素化并降解，从而使与之结合的Nrf2游离出来并 进入细胞核，与其他转录因子结合后，再结合在II相酶基因5’上游的调节抗氧化反应元件 ARE区(antioxidantresponse element, ARE)，启动第II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因 的转录，提高细胞抗氧化损伤的能力从而预防癌症(见图1)。因此，活化Keapl/Nrf2/ARE 通路是预防肿瘤最有前景的策略。人Keapl蛋白含有27个半胱氨酸残基位点，到底是哪些半胱氨酸残基在迈克尔受 体分子发挥II相酶诱导活性过程中发挥活性作用，一直是近十几年来化学防癌机制研究 领域的热点。Keapl研究者采用与诱导物结合的探针和酶学、放射标记、UV、色谱的检测方法 确定了 Keapl插入区的四个高活性半胱氨酸巯基位点(Cys257，CyS273，CyS288和Cys297) 是识别II相酶诱导物并与之反应的重要细胞“传感器”。而其中又以Cys273及Cys288最 为重要。体内外研究均证明Cys273及Cys288两个位点的变异或者Sulforaphane或GSSG 对野生型Keapl的加成，均可以直接导致Nrf2的解离及其II相酶及抗氧化应激靶基因表 达的增加。另外，Cysl51位点也能通过被迈克尔受体分子化合物的加成修饰，在氧化应激 诱导剂及Sulforaphane添加诱导的Keapl与Nrf2的解离中发挥重要作用。因此，能够与 keapl的Cys273与Cys288及Cysl51的活性半胱氨酸残基发生迈克尔加成反应的化合物成 为化学防癌的潜在药物。已知含有α，β _不饱和结构单元的小分子配体(称作迈克尔加成反应受体分子) 和Keapl上Cys273与Cys288及Cysl51等半胱氨酸残基的巯基发生迈克尔加成反应能有 效的上调苯醌还原酶的表达，从而起到防癌作用。但事实上并非所有的迈克尔反应受体小 分子配体都能和该活性残基发生加成反应，除了小分子配体本身应具有发生迈克尔反应的 药效基团(α，不饱和结构单元)外，其与Keapl蛋白质大分子活性口袋附近的其他氨 基酸残基之间也有相互作用，而这种相互作用，能够促使配体分子和活性半胱氨酸残基的 巯基更容易发生加成反应。基于上述机理本发明的构思是首先，利用同源模建软件预测出keapl活性位点所在功能域(IVR)的PDB数据；然后以此为依据，分别以keapl蛋白的活性半胱氨酸残基位 点Cysl51、Cys273及Cys288等为受体大分子的活性位点构建活性口袋，利用分子对接软 件，对预先构建的小分子配体数据库，尤其是从天然产物数据库中进行虚拟筛选，确定出能 够与该活性口袋相匹配的迈克尔反应受体小分子配体，作为具有化学防癌以及抗癌作用的 新型先导药物，再以细胞平台的高通量筛选进行进一步验证。本发明提供的一种以Keapl为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法，包括以 下步骤1)确定Keapl蛋白结构的PDB结构数据；2)采用分子对接软件，依据keapl的活性半胱氨酸残基位点确定活性中心，设定 活性口袋；3)对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选、和药效团含有情况 筛选；4)建立对接用小分子配体数据库；5)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小 分子配体与活性口袋一一做对接；6)根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。上述的虚拟筛选方法步骤3)可以置于步骤1)至步骤6)任何一个步骤之前。即 可以对尚未进行分子对接或者已经对接后的小分子数据库中的小分子配体进行毒性、类药 性和药效团含有情况进行筛选，而不受排序限制。为了进一步提高筛选的速度、效率和准确性，上述的虚拟筛选方法步骤6)可以 为根据对接结果的排序，小分子配体药效团含有情况以及小分子配体与活性中心的相互 作用方式，进行综合评价，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。本发明的有益效果是本发明通过药物的虚拟筛选，可以在短时间内获得活性化 合物的线索，将研究目标从几百万个化合物集中到几百个化合物，而且，虚拟筛选的阳性率 (5% 30%)远远高于高通量实验筛选(0.01% 0. )。然后再从虚拟筛选后的先导 化合物中，利用动物水平筛选或者高通量细胞平台，筛选具有防癌抗癌药物，因此大大提高 了筛选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期。


图III相酶诱导剂防癌作用的分子机制。图2hKeapl的蛋白质一级结构序列。图3hkeapl的活性功能域的蛋白质三级结构模式图。图4hkeapl预测三级结构的评估。图5小分子配体对接程序中使用的SHELL脚本。图6化合物DEM与keapl的Cysl51活性中心的相互作用图。图7A阳性对照分子DEM与keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。图7B阳性对 照分子DEM与keapl的Cysl51活性中心的相互作用图。图8A阳性对照分子isoliquiritigenin与keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。 图8B阳性对照分子isoliquiritigenin与keapl的Cysl51活性中心的相互作用图。
图9A阳性对照分子xanthohumol与keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。图9B 阳性对照分子xanthohumol与keapl的Cysl51活性中心的相互作用图。图IOA大豆异黄酮与keapl的Cysl51活性中心的相互作用图。图IOB大豆异黄 酮与keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。图11高通量细胞平台筛选化学防癌抗癌药物方法的流程图。图12大豆异黄酮在细胞水平诱导苯醌还原酶表达的结果分析。图13A阳性对照分子15D-PGJ2与Keapl的Cys273活性中心的相互作用图。图 13B阳性对照分子15D-PGJ2与Keapl的Cys288活性中心的相互作用图。图14A藁本内酯与Keapl的Cys273活性中心的相互作用图。图14B藁本内酯与 Keapl的Cys288活性中心的相互作用图。图15是藁本内酯在细胞水平诱导苯醌还原酶表达的结果分析。
具体实施例方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式 限制本发明。实施例1 一种以keapl蛋白的半胱氨酸残基Cysl51为活性位点，进行化学防癌抗 癌药物的虚拟筛选。(一 )虚拟筛选步骤如下1、利用同源模建软件确定Keapl蛋白结构活性功能域的PDB的结构数据利用Swiss Model在线服务，提取human Keapl的氨基酸序列(FASTA格式，图2)， 提交Swiss Model的模板搜索功能，以与keapl的BTB功能域高度保守的KLHLll的蛋白质 三级结构(3i3nb)为模板，同源建模，确定keapl的活性功能域的蛋白质三级结构(1_314) 如图3所示。通过同源建模方法得到的模型往往会有一些不合理的结构，因此，采用在线模型 分析工具 Molprobity (http://molprobity. biochem. duke, edu/index, php)进行评估。评 估标准为红色表示较为严重的过近接触(atom clashes)；绿色表示不合理的二面角；紫 色表示不合理的Cb ；橘黄色表示不合理的rotamer。由图4的评估结果可以很明显地看出， 以keapl的活性半胱氨酸残基位点Cysl51为活性中心的口袋范围几乎不存在不合理结构 或过近接触。summary statistics显示此模型基本合理。因此，图3所示的keapl的活性 功能域的蛋白质三级结构的模型可以不采取进一步优化而直接用于后续操作。2、采用Autodock分子对接软件，依据keapl的活性半胱氨酸残基位点Cysl51确 定活性中心，设定活性口袋；本步骤中，首先利用已知的可与keapl的活性半胱氨酸残基位点Cysl51发生加 成反应的分子做阳性对照分子，依据其在以活性位点Cysl51为中心构建的活性口袋中与 口袋相互作用的结合能以及是否有利于发生迈克尔加成反应为标准，确定keapl蛋白中以 Cysl51为中心的活性口袋的大小。2. 1利用Autodock分子对接软件进行分子对接计算的程序设置。主要步骤如下1)、将步骤1中，同源建模确定的keapl活性功能区域的蛋白质三级结构在
6MGLTooIs中进行处理。主要包括去除水分子，加非极性氢，加上Gasteiger电荷。最后保存 为 hKeaplforMD. pdbqt。2)、计算格点能量(AutoGrid)，在 Grid > Set Map Types > Directly 中把要进行 格点能量计算的原子类型输入进去。运行AutoGrid，完成之后会生成一系列文件，主要为每 个原子的map文件。3)、为每个小分子配体准备对接所需的文件夹，这个过程要使用SHELL脚本实现 (图5)。先制作一个小分子配体的列表文件ligands. list，然后按照图5所示的SHELL脚 本的命令依次输入命令运行脚本a. csh ；完成上面的操作后就会为每个小分子配体生成一 个文件夹，该文件夹包含对接所需的所有文件配体、受体、AutoGrid产生的map文件、dpf 文件等。下一步即可以对接。4)、循环运行AutoDock 循环运行AutoDock，对接每一个小分子配体，并提取结合 能等对接结果并对对接结果排序。这个脚本可以同时运行多个，互不干扰，因此可以完全利 用计算机资源。5)、提取对接结果最后得到summary, sort 虚拟筛选至此做完。2. 2以keapl的活性半胱氨酸残基位点Cysl51为活性中心，设定活性口袋；利用Pocket-Finder搜寻在Cys 151附近可能的活性结合口袋(网址:http:// www. modelling, leeds. ac. uk/pocketfinder/)，结果发现 Cysl51 附近没有明显的结合口 袋。考虑到Cysl51是亲水性氨基酸残基，推测Cysl51附近可能会存在亲水性的结合口袋。 分子对接采用Autodock4. 2程序以及相应的图形化分析软件MGLTools-1. 5. 4。在MGLTools 中调整显示方式，显示keapl表面特征，结果见图6。图6中黄色部分表示Cysl51的位置， 由图6可看到Cysl51附近有明显围起的凹槽，图6中右边为已知可与keapl的Cysl51位 置发生结合的阳性参照分子DEM6。很明显，图6中的那个凹槽溶剂可及面较大，为活性口袋 设置区域。由于考虑到口袋受水影响比较大，因此用Autodocki 2对小分子配体在这个口 袋中的适合度进行考察，进一步优化口袋的设置。对接时活性口袋的设置首先打开keapl的坐标文件，找到Cysl51各个原子 的坐标，分别在χ、y、ζ三个方向求平均值，得出Cysl51的中心坐标，并记下数值(即χ 为-10. 094、y为-6. 533、ζ为-32. 398)。设置活性口袋时，活性口袋中心处对应的x、y、ζ 先分别填上上述数值。网格大小的默认值为40X40X40，步长(spacing)为0. 375nm，然 后通过反复调整网格大小的数值，进一步确定活性口袋的位置和大小，使其刚好能包住凹 槽。以keapl的活性半胱氨酸残基位点Cysl51为活性中心的活性口袋为中心坐标为χ 为-10. 094,y为"6. 533,ζ为-32. 398，活性口袋的大小根据下面2. 3步骤中的阳性对照分 子的分子对接结果和相互作用方式来决定。2. 3调整和验证活性口袋对接采用计算机广泛应用的Lamarckian遗传算法(LGA)，每个配体产生50个对接 构象，ga_p0p_SiZe设为300ga_num_evalS设为250000，其余参数采用程序默认值。对接时 小分子配体可以自由转动，蛋白质分子则被固定。计算结束后以RMSD值作为聚类分析的依 据。利用已知的可与keapl的活性半胱氨酸残基位点Cysl51发生加成反应的分子(1) xanthohumol ； (2) isoliquiritigenin ； (3)DEM(结构式如下)做阳性对照分子，依据它们
在活性口袋中与口袋相互作用的结合能以及是否有利于发生迈克尔加成反应为标准，验证 keapl蛋白中以Cysl51为活性中心的活性口袋。根据反复验证，我们最终确定了活性口袋的设置条件。具体如下为以keapl 的活性半胱氨酸残基位点Cysl51为活性中心的活性口袋中心坐标为χ为-10. 094、y 为-6. 533、ζ 为-32. 398，网格大小值为 30 X 34 X 34，步长(spacing)为 0. 375nm。下面是在确定的这一活性口袋下，三个阳性对照分子在活性口袋中与活性中心及 周围基团相互作用的分析。(l)xanthohumol 结构式(2) isoliquiritigenin 结构式(3)DEM 结构式作用图截取簇中构象数大且结合能也较高的进行分析，结果分别如图7至图9。通 过观察这三个参照分子的对接结果可得出如下结论结合能均不高，处于_3到-6之间。小 分子配体在和活性口袋周围氨基酸残基作用时，这种非键作用(结合能)既不能太大也不 能太小太小的话，一方面特异性差，另一方面配体还来不及稳定在Cys 151附近就可能受 其它干扰因素的影响而离开口袋；太大的话又限制了配体的空间取向，不能使配体中的不 饱和单元采取最有利的空间取向和Cysl51的巯基发生加成反应。仔细观察氢键的形成发 现Vall32、Argl35、Lysl3U Lysl50这四个残基在促进配体与受体发生迈克尔加成反应起 了关键作用。在DEM与Keapl的作用中可以看到大部分的构象中Lysl31与Vall32残基 中肽键单元中的N-H分别与DEM的醚氧和羰基氧形成氢键，同时Lysl50残基上ε -氨基中 的氢与另外一个羰基氧形成氢键，这种空间结合恰好使Cysl51的巯基与DEM上的碳碳双键 相对，促进了 DEM发生迈克尔加成反应。在isoliquiritigenin与Keapl的作用中可以看 到大部分的构象中Argl35残基胍基中的N-H与一侧的酚羟基氧形成氢键，一部分构象中 Lysl31和Vall32残基中肽键单元的N-H与羰基氧形成氢键，一部分构象中Lysl50残基上
ε -氨基中的氢与一侧的酚羟基氧形成氢键。这种空间结合也同样促进配体与Cysl51残基 的巯基发生加成反应。xanthohumol的结构与isoliquiritigenin比较相似，氢键形成方式 与xanthohumol几乎类同。通过xanthohumol，isoliquiritigenin, DEM 做阳性对照，确定了上述以 keapl 蛋 白中Cysl51为活性中心的活性中心及活性口袋设置的合理性，可以进行下一步的小分子 配体筛选。3、对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选、和药效团含有情况 筛选在正式对接前对小分子配体数据库中的小分子配体进行筛选。筛选项目为毒性筛 选、类药性筛选、以及药效团含有情况筛选(三种筛选排序不分先后)。小分子配体数据库选定免费的国际天然产物数据库(httpV/bioinformatics. charite. de/supernatural/)，该数据库中含有45917种目前国际上已经报道过的并且是容易从公司购买得到的天然有机化合物的结构数据。当然，除此之外，还可以根据中药药 理的最新研究成果，根据科学研究和文献报道，搜集一批含有α，β-不饱和结构单元(药 效基团)的小分子化合物及其结构信息，与国际天然产物数据库合并构建小分子配体数据库。3. 1毒性筛选运用化合物毒性预测软件Osiris对小分子配体数据库中的小分子 配体进行毒性预测，淘汰毒性预测结果显示阳性的分子。3. 2类药性筛选运用ADME (药代动力学)预测软件或相关软件的ADME预测功能 计算小分子配体数据库中各个小分子配体的类药性指数，指标包括多项，比如分子量、氢 键受体、氢键给体、可旋转键数、脂水分配系数、水溶性指数、分子极性表面积、分子体积、基 于经验的药物类似性指数、化学焓变指数(分子稳定性指数)。依据各指数反映的分子类药 性优劣，再给予各指数以优劣评分，指数最优者为1，指数最劣者为0。将每个分子的10项 指数优劣性评分加和，得出总类药性评分。3. 3药效团含有情况筛选根据本筛选目的确定药效基团为α，β -不饱和结构单 元，因此我们采用结构式搜索的方式，将数据库中含有α，β-不饱和结构单元小分子配体 搜索出来。4、建立对接用小分子配体数据库综合步骤3中的毒性筛选结果，类药性评估结果和含有药效团的小分子配体的搜 索结果，建立适用于本筛选目的对接用小分子配体数据库。5、根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小 分子配体与活性口袋一一做对接；根据上述步骤确定的活性口袋及对接用小分子配体数据库，运行2. 1中设置的分 子对接程序。将小分子配体与活性口袋一一做对接，确定先导药物。分为大批量筛选与精 确筛选两个步骤。大批量筛选设置Autodock 中的参数 ga_num_evals = 2500000 及 ga_run = 10， 运行2. 1中设置的分子对接程序，进行一一对接。当然也可依据构建的或选定的其它小分子配体数据库的大小进行ga_num_evalS 及ga_run的设置。精确筛选将Autodock软件中的ga_num_evalS和ga_run参数设置到最高，即ga_ num_evals = 250000, ga_run = 50，运行2. 1中设置的分子对接程序，进行精确筛选。6、根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。经过第5步的精确筛选，获得对接后小分子配体数据库，根据对接结果的排序，初 步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。当然，为了进一步缩小先导药物的个数还可以采用综合评价对接结果的排序，小 分子配体药效团含有情况以及小分子配体与活性中心的相互作用方式，来确定具有化学防 癌或抗癌效果的先导药物。( 二)利用细胞高通量筛选平台筛选具有防癌抗癌药物通过上述的虚拟筛选，从免费的天然产物数据中筛选出一批与以Cysl51为中心 构建的活性口袋相互作用较好的候选化合物。然后按照图11所示的流程图，利用细胞高通 量筛选平台in vitro QR activity assay系统，进一步筛选候选化合物，确定II相酶诱导剂药物，从而确定具有防癌抗癌药物。1、我们从虚拟筛选后的候选化合物中，随意选择一个化合物大豆异黄酮， Genistein,分子结构如下所示， 按照图11所示的流程图，进行细胞高通量实验。苯醌还原酶(NAD(P)H:quinone reductase，QR)，是一种典型的药物代谢Phase II 酶，能够催化醌类物质的两电子还原生成氢醌，阻断了半醌自由基的产生，防止了大量氧自 由基的形成，因此在肿瘤生成的初始阶段发挥重要的肿瘤预防作用。由于利用鼠肝癌细胞 株H印a lclc7细胞可以容易方便地测定QR的诱导，具有稳定性和高通量的优点。细胞经 Genisteind,5,10,50,100M)及对照组(溶剂组)处理后，加入QR反应底物(甲萘醌)及 相应的反应液，反应后测定595nm处吸光度用以测定QR活性，并通过比较给药组及对照组 单位蛋白浓度的吸光度值的变化来判定药物的QR诱导活性。大豆异黄酮的统计学结果如图12所示，不同剂量组(1，10，50，100M)的大豆异黄 酮诱导QR表达，达到对照组的约1. 82,3. 05,3. 85以及4. 42倍，且这些QR表达的增加与对 照组相比均有差异或者显著性差异(*，P < 0. 05 ；**，p < 0. 01)。结论确定大豆异黄酮为 II相酶诱导剂药物，从而确定其为具有防癌抗癌的药物。分析大豆异黄酮，Genistein,分子中含有典型的α，β -不饱和结构单元(药效 基团)，其分子对接结果如图IOA和图IOB所示，LYS150参与了几乎所有构象与keapl活性 口袋的相互作用，作用方式与DEM类似。因此大豆异黄酮是通过与Keapl的Cysl51的巯基 位点发生迈克尔加成反应，从而改变了 keapl的构型，导致Nrf2的解离并诱导了 II相酶的 表达，从而发挥其防癌作用。2、通过虚拟筛选后其它候选化合物，都可以按照大豆异黄酮的方法，继续进行细 胞高通量实验，从而确定其是否为II相酶诱导剂药物，最终确定其是否为具有防癌抗癌的 药物。实施例二一种以keapl蛋白的半胱氨酸残基Cys273以及Cys288为活性位点，进 行化学防癌抗癌药物的虚拟筛选。Keapl蛋白的Cys273以及Cys288同时发生迈克尔加成反应时，方能改变Keapl的 构型，并相应地解离Nrf2转录因子，促使其进入核内发挥增加II相酶表达的作用。根据此 基本理论，确定以Cys273以及Cys288两个半胱氨酸残基同时做为活性中心。1、利用同源模建软件确定Keapl蛋白结构活性功能域的PDB的结构数据同实施例12、采用Autodock分子对接软件，依据keap 1的活性半胱氨酸残基位点CYS151确 定活性中心，设定活性口袋；同实施例1，不同是
2. 2以keapl的活性半胱氨酸残基位点Cys273以及Cys288为活性中心，设定活性 口袋；对接时活性口袋的设置首先打开keapl的坐标文件，找到Cys273以及Cys288各 个原子的坐标，分别在x、y、ζ三个方向求平均值，得出Cys273以及Cys288的中心坐标，并 记下数值(即χ为-17. 717,y为-4. 149,ζ为-78. 05)。设置活性口袋时，活性口袋中心处 对应的x、y、z先分别填上上述数值。网格大小的默认值为40X40X40，步长(spacing)为 0. 375nm，然后通过反复调整网格大小的数值，进一步确定活性口袋的位置和大小，使其刚 好能包住凹槽。以keapl的活性半胱氨酸残基位点Cys273以及Cys288为活性中心的活性 口袋活性中心坐标为x为-17. 717、y为-4. 149、ζ为-78. 05，活性口袋的大小根据下面 2. 3步骤中的阳性对照分子的分子对接结果和相互作用方式来决定。2. 3调整和验证活性口袋利用已知的可与Cys273以及Cys288均发生迈克尔加成反应的15-脱氧前列腺素 J2 (15-Deoxy-12,14-Prostaglandin J2，15D-PGJ2,结构式如下)做阳性对照分子，依据它 们在活性口袋中与口袋相互作用的结合能以及是否有利于发生迈克尔加成反应为标准，验 证并确立keapl蛋白中以Cys273以及Cys288为活性中心的活性口袋，并进行下一步对接。根据反复验证，我们最终确定了活性口袋的设置条件。具体如下为以keapl的活 性半胱氨酸残基位点Cys273和Cys288为活性中心的活性口袋中心坐标为χ为-17. 717、 y 为-4. 149、ζ 为-78. 050，网格大小值为 60 X 62 X 62，步长(spacing)为 0. 375nm。下面是在确定的这一活性口袋下，阳性对照分子在活性口袋中与活性中心及周围 基团相互作用的分析。 15D-PGJ2与Cys73及Cys288活性中心相互作用的结果如图13A和图13B所示。 阳性对照分子15D-PGJ2与Cys273活性中心之间具有良好的相互作用，结合能达到-4. 6， 且呈现出15D-PGJ2的药效基团(α，β -不饱和基团)从空间取向上正对着Cys273半胱 氨酸残基(黄色部分)的位置，此种作用方式使迈克尔加成反应更容易进行。15D-PGJ2与 Cys288的作用方式与此类似，也是从空间上更有助于迈克尔加成反应的发生。通过阳性对照，进一步确定并验证了所获得的上述以keapl蛋白中Cys273以及 Cys288为活性中心的活性口袋的合理性，可以进行下一步的小分子配体筛选。3、对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选、和药效团含有情况 筛选同实施例1。4、建立对接用小分子配体数据库同实施例1。
5、根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小 分子配体与活性口袋一一做对接；同实施例1。6、根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。同实施例1。( 二)利用细胞高通量筛选平台筛选具有防癌抗癌药物通过上述的虚拟筛选，从免费的天然产物数据中筛选出一批与以Cys273以及 Cys288为中心构建的活性口袋相互作用较好的候选化合物。然后按照图11所示的流程图， 利用细胞高通量筛选平台in vitro QRactivity assay系统，进一步筛选候选化合物，确定 II相酶诱导剂药物，从而确定具有防癌抗癌药物。1、我们从虚拟筛选后的候选化合物中，随意选择一个化合物藁本内酯 ligustilide, Ligustilide是著名中药当归中的有效成分，占当归挥发油成分的45%左
右。其分子结构如下所示， 按照图11所示的流程图，进行细胞高通量实验。由于鼠肝癌细胞株Ifepa lclc7细胞经Ligustilide(l，5，10，50，100M)及对照 组(溶剂组)处理后，加入QR反应底物(甲萘醌)及相应的反应液，反应后测定595nm 处吸光度用以测定QR活性，并通过比较给药组及对照组单位蛋白浓度的吸光度值的变化 来判定药物的QR诱导活性。其统计学结果如图15所示，不同剂量组(1，10，50，100M)的 Ligustilide诱导QR表达分别达到对照组的约2. 6,3. 4,4. 7以及42. 6倍，且这些QR表达 的增加与对照组相比均有差异或者显著性差异(*，P < 0. 05 ；**，p < 0. 01)。结论确定藁 本内酯为II相酶诱导剂药物，从而确定其为具有防癌抗癌的药物。分析藁本内酯结构中含有典型的α，β-不饱和结构单元，其Autodock分子对接 结果如图14Α和图14Β所示。与15D-PGJ2的对接结果类似，Ligustilide的α，β -不饱 和基团也都分别从空间上处于与Cys273(图14A)以及Cys288 (图14B)相对的位置上，并 且其结合能均达到_5左右，充分保证了此种作用方式的稳定性，从而使Ligustilide成为 进一步进行细胞平台验证的最佳药物。2、通过虚拟筛选后其它候选化合物，都可以按照藁本内酯的方法，继续进行细胞 高通量实验，从而确定其是否为II相酶诱导剂药物，最终确定其是否为具有防癌抗癌的药 物。实施例三一种以keapl蛋白的半胱氨酸残基Cys257为活性位点，进行化学防癌抗
12癌药物的虚拟筛选。方法与实施例1相同，不同点在于设置活性口袋时以Cys257的中心坐标为活 性口袋的中心。实施例四一种以keapl蛋白的半胱氨酸残基Cys297为活性位点，进行化学防癌抗 癌药物的虚拟筛选。方法与实施例1相同，不同点在于设置活性口袋时以Cys297的中心坐标为活 性口袋的中心。
权利要求
一种以Keap1为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法，其特征在于包括以下步骤1)确定Keap1蛋白结构的PDB结构数据；2)采用分子对接软件，依据keap1的活性半胱氨酸残基位点确定活性中心，设定活性口袋；3)对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选以及药效团含有情况筛选；4)建立对接用小分子配体数据库；5)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋一一做对接；6)根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。
2.按照权利要求1所述的一种以Keapl为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法， 其特征在于步骤3)可以置于步骤1)至步骤6)任何一个步骤之前。
3.按照权利要求1所述的一种以Keapl为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法， 其特征在于步骤6)为根据对接结果的排序，小分子配体药效团含有情况以及小分子配 体与活性中心的相互作用方式，综合评价，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。
全文摘要
本发明涉及一种以Keap1为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法。包括以下步骤1)确定Keap1蛋白结构的PDB结构数据；2)采用分子对接软件，依据keap1的活性半胱氨酸残基位点确定活性中心，设定活性口袋；3)对小分子配体进行筛选；4)建立对接用小分子配体数据库；5)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋一一做对接；6)根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。采用本发明可在短时间内获得活性化合物的线索，然后再利用动物水平筛选或者高通量细胞平台筛选具有防癌抗癌药物，大大提高了速度和效率，缩短新药研究周期。
文档编号G06F19/00GK101916330SQ201010246449
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者刘剑利, 张勇, 曹向宇, 李芳瞳, 芦秀丽, 陈树超, 高兵 申请人:辽宁大学