用于扩增反应的分析工具的制作方法

专利名称：用于扩增反应的分析工具的制作方法
技术领域：
本发明涉及借助于聚合酶链式反应(PCR)的核酸定量的领域。
背景技术：
核酸的定量在从分子生物学和遗传研究到诊断和病原体检测的许多领域中是重要的。当存在足够量的核酸吋，可以应用斑点(blot)技术用于定量。然而，这些技术的有限灵敏度妨碍了它们在许多情况中的使用。不久前发展起来的定量PCR方法提供了在要求高得多的灵敏度情况下用于分析的工具。这些技术是基于以下事实在PCR扩增期间产物的量以指数方式增长，并且因此， 可以通过常规手段(例如，荧光检測)来检测在少量循环之后所获得的产物的量。另外，原则上，如果已知扩增循环的数目，则可以从扩增结束时获得的产物的量来确定初始(即，在扩增开始吋)存在的产物的量。在扩增反应进程上形成的PCR产物的典型曲线图揭露了扩增过程的四个不同阶段(见图1):(1)基底阶段(GP)，其中荧光信号由背景荧光和噪声主导；( 指数阶段(EP)， 其中来自PCR产物的信号上升超过基底水平并以指数形式増加；(3)对数线性阶段(LP)，其中由于由诸如PCR试剂消耗和检测探针退化之类的因素引起的减小的扩增效率，信号以小于指数速率増加；(4)由于扩增反应的渐增的放缓和最终的停止而具有该信号的余量上升的平稳阶段(PP)。然而目前没有可用的物理模型以逼真的形式描述在PCR过程期间被检测到的信号的发展。因此，当前的用于核酸定量的方法要求执行校准步骤，该校准步骤涉及对具有已知浓度的标准/或比较的核酸序列的參照样品执行同样的PCR反应。很多时候，用作标准的核酸序列是公知的看家基因(housekeeping gene) 0简要地概述，在实践中，靶核酸序列以及标准和/或比较的样品在确定的反应条件下进行PCR，并且也称为扩增子的PCR产物的形成在扩增过程的进程上受到监控。例如，借助于荧光标记的杂交探针或借助于检测双链 PCR产物的DNA插入荧光染料来实现PCR产物的检测。确定了为获得特定荧光阈值水平所需的扩增循环的数目，其被指定为Ct值，并将靶的Ct值与具有已知浓度稀释系列的核酸标准的样品的Ct值比较(绝对定量)。为确定靶的绝对量，根据标准样品的Ct值构建标准曲线并将该标准曲线用于确定靶的初始浓度。可替换地，将靶的Ct值与关心的单个比较核酸的 Ct值比较0 对定量)。在该情况下，靶和比较样品的Ct值的比值被确定并用于评估靶和比较核酸序列的初始量的比值。总体而言，核酸定量新方法的发展面临许多挑战，其中的某些挑战源于将在以下更详细地讨论的若干应用要求完全自动化的事实，并且其中的某些挑战与校准过程相关。采用Ct值确定的用于核酸定量方法所要求的校准过程引入了许多潜在的限制。首先，标准样品的检查要求另外的实验努力和资源。其次，这些方法是基于标准和靶样品内的扩增效率相同的假设。重要的是，该假设通常是不正确的并因此提供了不准确的来源。定量的PCR领域中的另外挑战与在短时间间隔内分析大量样品的增长的需求相关。由于定量PCR的日益增长的应用范围要求以高通量方式分析数量非常大的样品，例如在临床实践中，就需要发展能够完全自动化且需要非常少或无需人机交互的定量的PCR方法。这在某些情况下是至关重要的，因为如果要求人机交互，高通量应用(例如在临床实践中)就不能简单地在所要求的短时间段内进行。使用这种自动化方法能够实现的另外的优点将是目前使用迥异的定量PCR实验室协议的不同实验室之间的分析数据改进的可比性。考虑到越来越多的实验室使用定量 PCR技术用于基础研究，该问题具有至高的重要性。建立自动化方法作为定量实验的客观參照将通过增强实验室间的一致性而使这些研究努力极大地受益。两种使用Ct值确定的方法目前可用于核酸定量，这两种方法原则上似乎适于完全自动化ニ阶导数最大值方法和S形曲线(sigmoidal curve)拟合方法。对于ニ阶导数最大值方法，扩增曲线的ニ阶导数的最大值被数值地确定。相应的循环被假设为表示指数增长阶段的结束，在此反应开始放缓至线性增长。该循环数目与Ct类似地被用于确定靶的量。对于S形曲线拟合方法，在扩增曲线上对S形函数建摸。对应于曲线拐点的循环数目可以从模型获得，并与Ct类似地被用于确定靶的量。然而，已经发现ニ阶导数最大值方法和 S形曲线拟合方法对于要求高灵敏度的应用具有有限的用途(JD Durtschi m, Analytical Biochemistry, 361 (2007)，第55-64页)。此外，这两种方法均要求校准步骤。另外，在使用S形曲线拟合方法的过程中在扩增曲线上建模的S形函数极为理想化，并且决不能被视为描述在PCR过程期间检测到的信号的发展的物理模型。

发明内容
因此，本发明的目的是提供适于要求高灵敏度的靶核酸序列的完全自动化定量的方法。另外，本发明的目的是提供不需要比较靶和标准样品的方法，即，不要求校准步骤的方法。此外，本发明的目的是提供ー种物理模型，其允许在扩增过程期间非常详细地分析检测到的信号。


图1示出了在扩增反应的进程上获得的典型扩增曲线，其揭露了扩增过程的不同阶段=GP=基底阶段，EP=指数阶段，LP=对数线性阶段，PP=平稳阶段。C表示循环的数目且 Ie表示实验者使用的图像分析软件所记录的信号強度。许多这些软件程序是本领域人员公知的。图2示出了用于为扩增曲线确定模型函数IF(n)拟合的方法的示意性表达。图3示出了相对于根据本发明确定的结果㈧绘制的一系列样品中的靶DNA的绝对初始量(B)。分析的结果与最初呈现的靶DNA初始量相对应。图4示出了对于一系列样品的相对于彼此绘制的根据本发明确定的參数も⑶和 α (A)0圆形表示包含靶DNA的规则样品而正方形表示不包含靶DNA的样品。包括规则样品的数据点的不同簇的存在表明も和α可以用于识别并可能地排除具有不正常扩增反应的样品，否则其可能导致错误判断。图5示出了对于一系列样品的相对于彼此绘制的根据本发明确定的參数も和ε。 菱形表示包含靶DNA的规则样品而正方形表示不包含靶DNA的样品。包括每个样品类型的数据点的不同簇的存在表明も和ε可以用于识别并可能地排除具有不正常扩增反应的样品，否则其可能导致错误判断。图6Α和6Β示出了在使用两个PCR样品(ー个添加有49%的渣滓(feces)且另ー 个没有添加渣滓)执行的PCR反应循环的进程上获得的扩增曲线(C)、模型函数的最佳拟合 (A)以及扩增效率(B)的曲线图。如实例4中所描述的，对于没有渣滓的样品(图6A)和具有渣滓的样品(图6B)所确定的扩增效率的曲线图比较示出了渣滓的存在对于扩增反应的效率具有显著且不利的影响图6A中的扩增效率在1. 0处开始，而图6B中的扩增效率在 0.51处开始。
具体实施例方式遵从本发明的核酸包括DNA、RNA以及具有改性的主链和/或基础结构的核酸。通常通过各种方法并且借助于本领域技术人员可获得的仪器由聚合酶链式反应(PCR)执行扩增。然而，为了本发明的目的，无法直接由PCR扩增的核酸可能必须借助于本领域技术人员已知的方法转录成DNA。例如，RNA可能必须在扩增前使用逆转录酶转录成DNA。为了允许重构原始量的相应核酸，这种转录过程必须在使能进行理由充分的假设的条件下执行， 该假设涉及被转录成DNA的核酸与在转录进程中产生的DNA的量的比率。该类型的反应条件在本领域中是公知的。实践本发明的进程中扩增的每个核酸序列通常以有选择性的方式来扩增。在PCR 期间获得选择性扩增的ー种方式是使用特定序列引物。这种引物的设计和使用对于本领域技术人员来说是公知的。为了本发明的目的，通过PCR的核酸扩增，即通过扩增反应的核酸的产生，又称为扩增子，是通过记录与所述核酸序列的扩增相关的信号来检测。这通常借助于荧光指示探针(此处也指定为荧光指示体或指示探针)来实现。这种荧光指示探针在本领域中是共知的。在本发明的一个实施例中，荧光指示探针包括寡核苷酸，该寡核苷酸在杂交条件下特异地结合至靶核酸序列，并在其序列的一端上携帯有荧光基团且在其序列的另一端上携帯有相应的猝灭基团。在该状态下的荧光基团和猝灭基团的紧邻防止了荧光的发射。然而，当荧光指示探针的中央寡核苷酸在下一个扩增循环的进程中被打破吋，荧光团和猝灭剂的接近不复存在，导致荧光发射。扩增产物量即扩增子的増加因此产生了荧光的成比例増加。在本发明另一个实施例中，荧光指示探针是FRET(荧光能量转移)探针。在本发明ー个实施例(TaqMan)中，荧光指示探针是PCR引物之一。在本发明优选实施例中，借助于荧光指示探针检测核酸扩增。根据本发明，在扩增反应的进程上记录与核酸序列的扩增相关联的信号。在扩增反应循环的进程上记录的信号的表达被表示为扩增曲线。通常这种信号是荧光发射；然而， 本发明也包括本领域中使用的其它信号。可以由荧光染料释放荧光发射，若干所述荧光染料在本领域中是已知的。某些荧光染料具有足够分开的吸收和发射光谱以允许在同一样品中的并行检测。在扩增反应进程上的信号记录可能被腔室中不同颜色通道之间的光学串扰干扰，该光学串扰是低于理想的光学过滤器和荧光团的結果。此外实验装置的外部组件的自动荧光能够干扰信号的记录，例如，用于反应的塑料容器可能响应于激发波长并发射荧光。在本发明的优选实施例中，通过本领域公知的方法减少由光学串扰和自动荧光所导致的干扰。在本发明的优选实施例中，在减少由光学串扰和自动荧光所导致的干扰之后的扩增反应循环进程上所记录信号的表达被表示为扩增曲线。减少由自动荧光导致的干扰的简单方法是在存在容器但不存在用于扩增反应的试剂的情况下确定实验装置的信号偏移。然后，针对该偏移校正扩增反应期间记录的信号。减少由光学串扰导致的干扰的简单方法是通过测量未猝灭荧光团的已知浓度来确定描述不同颜色通道之间串扰的串扰矩阵。该串扰矩阵可以用于校正在扩增反应期间记录的信号。在执行本发明的方法的进程中，定义了模型，该模型描述了扩增曲线并包括与对所记录的信号有影响的物理量相关的至少ー个參数。该模型可以包括ー个或若干模型函数。在优选实施例中模型包括若干模型函数。对记录的信号有影响的物理量可以是与扩增反应本身相关的量或是与测量装置有关的量。在优选的实施例中，物理量是与扩增过程期间信号噪声的产生相关的。在另ー 个优选的实施例中，物理量是与扩增过程的抑制相关的。在另ー个优选的实施例中，物理量是与扩增过程期间荧光团的自发未猝灭相关的。在另ー个优选的实施例中，物理量从下述选择(i)靶核酸序列的绝对初始量，(ii)靶核酸序列的初始扩增效率，(iii)扩增反应的抑制程度，(iv)用于扩增过程的反应容器的信号吸收程度。在执行本发明方法的进程中，包括至少ー个模型函数的模型被拟合到扩增曲线。 用于确定这种模型的最佳拟合的方法在本领域是已知的并依照所用的模型来选择。在优选的实施例中，这种模型的最佳拟合以如下方式来确定首先定义成本函数，例如，拟合误差平方。该成本函数可以被加权从而强调曲线的特定部分，例如Ct周围的数据点。然后使用迭代的Newton Raphson极小化、变步长方法来最小化该成本函数。在执行本发明方法的进程中，在模型的最佳拟合中确认參数值。相应的值包含这些參数关联到的物理量的信息。在本发明优选的实施例中，例如，在使用TaqMan荧光指示探针的环境中，定义了描述扩增曲线的以下模型函数IF(η)；选择与对所记录的信号有影响的物理量相关的參数作为靶核酸序列的绝对初始量为Ntl，以及參数ら、α、ε和γ :
其中
权利要求
1.从靶核酸序列的扩增曲线获得信息的方法，包括步骤(a)定义至少ー个模型函数，该模型函数描述该扩增曲线并包含与对记录的信号有影响的物理量相关的至少ー个參数，(b)将所述模型函数拟合到该扩增曲线，(c)通过确认导致该模型函数的最佳拟合的所述參数的值，获得关于所述物理量的信
2.根据权利要求1的方法，其中该物理量是选自以下的物理量在扩增过程期间与信号噪声的产生相关的物理量、与扩增过程的抑制相关的物理量、在扩增过程期间与荧光团的自发未猝灭相关的物理量。
3.根据权利要求1的方法，其中该物理量选自以下 靶核酸序列的绝对初始量，靶核酸序列的初始扩增效率， 扩增反应的抑制程度，用于扩增过程的反应容器对信号吸收的程度。
4.根据权利要求1的方法，其中參数是靶核酸序列的绝对初始量Ntl，以及參数も、α、 ε和Y，并且其中模型函数定义为IF (η)， 其中
5.根据权利要求1至4的方法，进ー步包括步骤(d)，其中所获得的信息是该扩增曲线的Ct值，其中(d)使用所述模型函数的最佳拟合来确定所述扩增曲线的Ct值。
6.根据权利要求1至5的方法，其中同时分析样品中的ー个靶核酸序列。
7.根据权利要求1至5的方法，其中同时分析样品中的多于ー个靶核酸序列。
8.根据权利要求1至7的方法，其中在减小由光学串扰和自动荧光导致的干扰之后，在扩增反应的循环进程上记录的信号的表达被用作扩增曲线。
9.根据权利要求1至8的方法，其中所有步骤以完全自动化的方式执行，S卩，在PCR过程期间没有任何人机交互。
10.一种机器可读介质，其上存储有用于实施根据权利要求1至9的方法的指令。
11.一种用于核酸样品分析的设备，其包括机器可读存储器装置，该机器可读存储器装置包含用于实施根据权利要求1至9的方法的信息。
全文摘要
本发明涉及一种方法和装置，该方法和装置用于通过定义描述扩增曲线并包含与影响所记录的信号的物理量相关的至少一个参数的至少一个模型函数，将所述模型函数拟合至该扩增曲线，并通过确认导致模型函数的最佳拟合的所述参数的值而获得关于所述物理量的信息，从而从一个或多个靶核酸序列的扩增曲线获得信息。
文档编号G06F19/24GK102576389SQ201080047305
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月14日 优先权日2009年10月21日
发明者B.尹, J.A.H.M.卡尔曼, T.M.E.尼森 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司