因子d和抗因子d抗体的共晶结构的制作方法

专利名称：因子d和抗因子d抗体的共晶结构的制作方法
技术领域：
本发明涉及因子D与抗因子D抗体或其抗原结合片段的共晶结构。
背景技术：
因子D是高度特异的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其是补体旁路途径的激活中的限速酶。因子D的底物是另ー种旁路途径丝氨酸蛋白酶，因子B。在被因子D切割后，因子B转化为有蛋白水解活性的因子Bb并且启动补体旁路途径。已经在玻璃疣中发现了增加的对补体旁路途径的激活。玻璃疣是出现在Bruch氏膜上的含有细胞毒补体的沉积物，其与年龄相关性黄斑变性(AMD)的发展相关。旁路途径补体激活在AMD中的作用已经进一步得到遗传分析的支持，所述遗传分析显示因子H(补体旁路途径激活的负调节物)的突变 与增加的发展AMD的风险高度相关。抗因子D抗体公开在于2008年5月22日公布的美国专利公开号20080118506 ;于2009年7月16日公布的美国专利公开号20090181017 ;以及于2009年10月29日公布的美国专利公开号20090269338中。抗因子D抗体可以用于预防和治疗与过度或不受控的补体激活相关的疾病和病症，并且对于疾病的诊断、预防和治疗是有用的。发明概述本公开提出了人和食蟹猴因子D与抗因子D抗体片段的复合物的晶体结构。本发明还提供关于在人和食蟹猴因子D上与抗因子D抗体Fab区的轻链和重链相互作用的残基的信息。在一方面中，本发明涉及由天然序列因子D多肽或其功能片段或保守氨基酸置換变体形成的晶体。在一个实施方案中，天然序列因子D多肽是人或食蟹猴因子D。在另ー个实施方案中，天然序列因子D多肽是SEQ ID NO: I的人因子D。在又一个实施方案中，人因子D的晶体被表征为具有约等于以下的单位晶胞參数晶胞大小 a = 132. 048 ；b = 132. 048 ；c = 180. 288 ;空间群 Ρ432,2,晶体常数2.4人，并且 R/Rfree = 21. 2% /27. 2。在进ー步的实施方案中，天然序列因子D多肽是SEQ ID NO :2的食蟹猴因子D。在又进ー步的实施方案中，食蟹猴因子D的晶体晶体被表征为具有约等于以下的单位晶胞參数a = 182. 205 ；b = 80. 673 ；c = 142. 575，空间群C2，晶体常数:2.lA;并且R/Rfree = 21. 1% /26. 9。在另一方面，本发明涉及具有显示在附录IA和IB中的结构坐标的因子D晶体。在又一方面，本发明涉及包含上述晶体中任一的组合物。在不同的方面中，本发明涉及可结晶组合物，所述组合物包含与抗因子D抗体或所述抗体的抗原结合片段复合的因子D多肽。在一个实施方案中，在可结晶组合物中，抗因子D抗体是单克隆抗体。在另ー个实施方案中，所述片段是Fab片段。在又一个实施方案中，在所述可结晶组合物中，因子D多肽是SEQ ID N0:1的人因子D。在进ー步的实施方案中，在所述可结晶组合物中，因子D多肽是SEQ ID N0:2的食蟹猴因子D。在又进ー步的实施方案中，因子D多肽包含催化三联体。在进ー步的方面中，本发明涉及包含与抗因子D抗体或其抗原结合片段复合的因子D多肽的晶体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另ー个实施方案中，所述片段是Fab片段。在又一个实施方案中，因子D多肽是SEQ ID NO :I的人因子D。 在进ー步的实施方案中，因子D多肽是SEQ ID NO :2的食蟹猴因子D。在又进ー步的实施方案中，因子D多肽包含催化三联体。在另ー个实施方案中，在SEQ ID NO :I的人因子D多肽或其抗原结合片段中，以下氨基酸残基中的ー个或多个參与与抗因子D抗体的复合D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222 和 K223。在又一个实施方案中，在SEQ ID NO :I的人因子D多肽或其抗原结合片段中，所有的氨基酸残基 D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222和K223都參与与抗因子D抗体的复合。在不同的实施方案中，在SEQ ID NO :I的人因子D多肽或其抗原结合片段中，氨基酸残基R172与抗因子D抗体或其抗原结合片段的重链和轻链形成氢键。在不同的方面，本发明涉及用于产生分子复合物的三维表征的计算机，所述分子复合物包含由SEQ ID NO :1的人因子D的氨基酸残基D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、I179、E181、R222 和 K223 的结构坐标定义的结合位点，其中所述计算机包括(i)机器可读数据存储介质，所述介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包括SEQ ID N0:1的人因子D的氨基酸残基D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、I179、E181、R222 和 K223的结构坐标；以及(ii)用于将机器可读数据处理成所述三维表征的指令。在一个实施方案中，所述计算机还包括用于显示所述结构坐标的显示器。在另一方面，本发明涉及用于评价化学实体与分子复合物缔合的潜能的方法，所述分子复合物包含由SEQ ID NO :1的人因子D的氨基酸残基D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222 和 K223 的结构坐标定义的结合位点，所述方法包括以下步骤(i)采用计算方式来进行化学实体与分子复合物的这种结合位点之间的拟合操作；以及(ii)分析所述拟合操作的结果以定量化学实体与所述结合位点之间的缔合。在一个实施方案中，所述化学实体是抗体或其抗原结合片段，或所述抗体或抗体片段的肽模拟物(mimetic)或小分子模拟物。在另ー个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与所列残基中的ー个或多个形成氢键。在又一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO :I的人因子D的氨基酸残基R172形成氢键。
在进ー步的方面中，本发明涉及可以通过所要求的方法鉴定的或通过所要求的方法鉴定的化学实体，诸如抗体、抗体片段、肽和小分子模拟物。在又进ー步的方面中，本发明涉及用于确定至少部分的结构坐标的计算机，所述至少部分的结构坐标对应于分子复合物的X射线衍射图案，其中所述计算机包括a)机器可读数据存储介质，所述介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包括根据图6和7或附录IA或IB的至少部分的结构坐标；b)机器可读数据存储介质，所述介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包括所述分子复合物的X射线衍射图案；c)用于存储处理所述a)和b)的机器可读数据的指令的工作存储器；d)与所述工作存储器和所述a)和b)的机器可读数据偶联在一起的中央处理单元，其用于执行对 所述(a)的机器可读数据的傅里叶变换以及用于将所述(b)的机器可读数据处理成结构坐标；以及e)与所述中央处理单元偶联的显示器，其用于显示所述分子复合物的所述结构坐标。附图简述图I.与抗因子D Fab片段(橙色重链，黄色轻链)形成复合物的人和食蟹猴因子D(都是绿色)的晶体结构。图2.与抗因子D抗体Fab片段(橙色重链，黄色轻链)形成复合物的人和食蟹猴因子D(緑色)的晶体结构。重叠基于fD (来自每个不对称単元的两个相应的分子)。这图示了两个食蟹猴复合物彼此的相似程度以及两个人的复合物彼此的相似程度。图3.所有四种因子D :Fab复合物的叠加(两次食蟹猴(蓝色)和两次人(緑色)。所有结构除了ー个区域以外都非常相似。右图标记中的圆圈是食蟹猴和人因子D结构的轻微的差异。图4. (a) 4个因子D :Fab复合物的叠加(两次食蟹猴(蓝色)和两次人(绿色)。所有结构的结合界面是相同的。形成部分活性位点(右图中的圆圈)的组氨酸处于不同的构象(人典型的，食蟹猴无活性的)。图5.与抗因子D抗体分子上的残基相互作用的因子D (人)上的残基的候选名単。图6A和B.与抗因子D Fab的轻链和重链相互作用的因子D上的残基。以红色表示的是与人因子D上的关键残基ARG-172形成多个氢键的Fab重链(H)和轻链(L)上的残基。3个星("林*")表示OH形成氢键。所述图显示到Fab (标记为链L和链H以表示轻链和重链)的任何原子短于4.5A的因子D(标记为链A)的每ー个原子的距离。例如Asp 131A 0D2 …TYR54HCE1 …3. 34…TYR 54H CZ …3. 49…TYR 54H OH …2. 78***是指因子D中的Asp 131的0D2原子靠近Fab片段的3个原子。这三个原子是重链中的Tyr 54的CEl原子(距离3· 34)Tyr 54 的 CZ 原子，以及所述酪氨酸的羟基，其与因子D的Asp 131形成氢键。图7A.人因子D上的关键残基ARG-172可以潜在地与抗体上的重链和轻链残基形成6个或更多个氢''I-键。
图7B.抗因子D Fab在远离催化三联体处结合。图8.人因子D的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO : I和3)。图9.食蟹猴因子D的氨基酸和核苷酸序列(SEQ ID NO 2和4)。

图10描绘了每个人源化抗体克隆#56、#111、#250和#416的可变重链和可变轻链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO :5、6、7和8)。图11显示人源化抗因子D Fab 238的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO 9)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238的轻链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图11 (SEQ ID NO 10)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图12显示人源化抗因子D Fab 238的轻链的氨基酸序列(SEQ ID N0:10)。该氨基酸序列缺少由显示在图11中的SEQ ID NO :9编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CLl是下划线的。框 架(FR)区和HVR区被显示。图13显示人源化抗因子D Fab 238的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO 18)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238的重链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图14(SEQ ID NO :19)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图14显示人源化抗因子D Fab 238的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)。该氨基酸序列缺少由显示在图13中的SEQ ID NO: 18编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CHl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示。图15显示人源化抗因子D Fab 238-1的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO :28)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238-1的轻链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图16(SEQ ID NO :29)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图16显示人源化抗因子D Fab 238-1的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO 29)。该氨基酸序列缺少由显示在图15中的SEQ ID NO 28编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CLl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示。图17显示人源化抗因子D Fab 238-1的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO :30)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238-1的重链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图18(SEQ ID NO :31)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图18显示人源化抗因子D Fab 238-1的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO :31)。该氨基酸序列缺少由显示在图18中的SEQ ID NO 30编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CHl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示。图19显示抗因子D Fab 238-2的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO 40)。图20显示抗因子D Fab 238-2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO 41)。图21.因子B切割被抗因子D抗体阻断但不被8E2阻断(流动相測定)。图22、23.因子D(S208A)以772nM的亲和カ结合C3bB转化酶原(Biacore分析)。图24、25·抗因子D抗体阻断因子D结合。图26、27·抗因子D抗体不影响催化切割。
图28.假设的模型，该模型描绘了抗因子D抗体如何抑制因子B激活。发明详述I.定义术语“因子D”和“补体因子D”可交換使用，并且指天然序列和变异的因子D多肽。“天然序列”因子D是具有与来源于自然的因子D多肽相同氨基酸序列的多肽，而不考虑其制备方式。因此，天然序列因子D可以从自然分离或者可以通过重组和/或合成方式制备。除了成熟因子D蛋白，诸如SEQ ID NO :1的人因子D蛋白，或SEQ ID NO :2的食蟹猴因子D蛋白，术语“天然序列因子D”，具体地包括天然存在的因子D的前体形式(例如，无活性的前蛋白(preprotein),其被蛋白水解切割以产生活性形式)、天然存在的变体形式(例如，备选地剪接形式)和天然存在的因子D的等位变体，以及具有与来源于自然的因子D多肽相同氨基酸序列的因子D分子的结构构象变体。具体地，非人动物(包括高等 灵长类动物和非人哺乳动物)的因子D多肽包括在此定义内，包括但不限于SEQ ID NO 2的食蟹猴因子D多肽。“因子D变体”或“补体因子D变体”是指如下定义的与天然序列因子D多肽，诸如SEQ ID NO : I的天然序列人因子D多肽或SEQ ID NO 2的天然序列食蟹猴因子D多肽具有至少大约80%氨基酸序列同一性的活性因子D多肽。通常，因子D变体将与SEQ ID NO 1的成熟人氨基酸序列或SEQ ID NO 2的成熟食蟹猴因子D多肽具有至少大约80%的氨基酸序列同一性，或至少大约85%的氨基酸序列同一性，或至少大约90%的氨基酸序列同一性，或至少大约95%的氨基酸序列同一性，或至少大约98%的氨基酸序列同一性，或至少大约99%的氨基酸序列同一性。优选地，最高程度的序列同一性发生在因子D的活性位点内。因子D的“活性位点”由人因子D序列中的His-57、Asp-102和Ser_195(胰凝乳蛋白酶原编号)定义。因子D在初级特异性ロ袋的底部具有Aspl89(胰凝乳蛋白酶编号)并且切割Arg肽键。催化三联体由His-57、Asp-102和Ser-195组成。与其他丝氨酸蛋白酶相比，Asp-102和His57显示非典型构象(Narayana等，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)235 (1994)，695-708)。在SI ロ袋的底部的Aspl89和Arg218之间观察到唯一的盐桥，其使环(loop)214-218升高并且产生深且窄的SI ロ袋(Jing等，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)282(1998) 1061-1081)。突变分析显示此环和活性位点附近的若干其他残基是因子D酯水解活性的关键的结构决定因素(Kim 等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)270 (1995) 24399-24405)。基于这些结果，提出在与结合有C3b的因子B结合时，因子D可能发生构象变化，导致蛋白水解活性的表达(Volanakis和Narayana, Protein Sci.(蛋白质科学)5 (1996) 553-564)。当在本文中使用吋，“溶剂可接近位置”是指基于结构(抗体或抗原结合片段的全部结构和/或建模结构的)被确定为潜在地可允许溶剂接近和/或与分子诸如抗体特异性抗原接触的源抗体或抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基的位置。典型地，这些位置发现于CDR中以及蛋白的外部上。可以使用本领域中已知的众多算法中的任何来确定如本文中所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可接近位置。优选地，使用来自抗体的3维模型的坐标并且优选地使用计算机程序诸如InsightII程序(Accelrys,San Diego, CA)来确定溶剂可接近位置。也可以使用本领域中已知的算法来确定溶剂可接近位置(例如，Lee和Richards (1971) J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)55，379以及Connolly (1983) J. Appl. Cryst.(应用晶体学杂志)16，548)。可以使用适于蛋白建模和获得自抗体的3维结构信息来进行对溶剂可接近位置的确定。可以用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module 软件(Tripos Associates)。通常且优选地，当算法(程序)需要使用者输入尺寸參数时，用于计算的探针的“尺寸”被设置成半径在大约I. 4埃以下。此夕卜,Pacios (1994) Comput. Chem.(计算化学)18 (4) :377-386已经描述了使用个人计算机用软件来确定溶剂可接近区域和范围的方法。术语“结合口袋”是指因其形状而顺利地与另ー个化学实体相结合的分子或分子复合物的区域。术语“ ロ袋”包括但不限于裂缝、通道或位点。结合口袋的形状可以在结合化学实体前大体上预形成，可以在与化学实体结合的同时形成，或者可以通过另ー个化学实体与该分子的不同的结合口袋结合而形成，这又导致该结合口袋形状的改变。术语“产生三维结构”或“产生三维表征”是指将结构坐标的列表转变为结构模型或三维空间中的图形表征。这可以通过市售或公用软件获得。因此，可以在计算机屏幕上通过被给予结构坐标并且包含正确软件的计算机来构建分子或分子复合物的三维结构的模型。三维结构可以得到显示或被用于执行计算机建模或拟合操作。此外，可以将结构坐标自身(不与被显示的模型一起)用于进行基于计算机的建模和拟合操作。术语“结晶溶液”是指促进结晶的溶液，其包含至少ー种试剂，所述试剂包括缓冲齐U、一种或多种盐、沉淀剂、ー种或多种去垢剂、糖或有机化合物、镧系离子、聚离子化合物和/或稳定剂。“百分比)氨基酸序列同一性”，定义为在进行序列比对(并在必要时导入空隙)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与參比因子D序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行比对以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定測量比对的适宜參数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然后相对较长的序列来计算序列同一性，即即使较短的序列显示与较长序列的部分具有100%的序列同一性，总体序列同一性将低于100%。“百分比)核酸序列同一性”，定义为在进行序列比对(并在必要时导入空隙)以获取最大百分比序列同一性之后，候选序列中的核苷酸与參比因子D编码序列中的核苷酸相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行比对以便測定核酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定測量比对的适宜參数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然后相对较长的序列来计算序列同一性，即，即使较短的序列显示与较长序列的部分具有100%的序列同一性，总体序列同一性将低于100%。“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，其从至少ー种在核酸的天然源中通常与其 缔合的污染物核酸分子中鉴定和分离。分离的核酸分子不处于其在自然中被发现的形式或环境。因此，分离的核酸分子不同于当其存在于天然细胞中时的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括在通常表达所编码的多肽的细胞中含有的核酸分子，例如其中核酸分子位于不同于天然细胞的染色体位置。
“分离的”编码因子D多肽的核酸分子是这样的核酸分子，其从至少ー种在编码因子D的核酸的天然源中通常与其缔合的污染物核酸分子中鉴定和分离。分离的编码因子D多肽的核酸分子不处于其在自然中被发现的形式或环境。因此，分离的编码因子D多肽的核酸分子不同于当其存在于天然细胞中时的编码核酸分子。然而，分离的编码因子D的核酸分子包括在通常表达因子D的细胞中含有的编码因子D的核酸分子，例如其中所述核酸分子位于不同于天然细胞的染色体位置。术语“拮抗剂”以最广义使用，并且包括能够中和、阻断、部分或完全抑制、废除、降低或干扰因子D生物学活性的任何分子。因子D拮抗剂包括但不限于抗因子D抗体及其抗原结合片段，与因子D结合并且能够中和、阻断、部分或完全抑制、废除、降低或干扰因子D活性的其他结合多肽、肽和非肽小分子，所述活性诸如因子D參与补体相关的眼疾的病理学的能力。本文中，“小分子”被定义为具有低于大约600、优选地低于大约1000道尔顿的分
子量。 在本发明的因子D拮抗剂的语境中，“有活性的”或“活性”或“生物学活性”是对抗(部分或完全抑制)因子D的生物学活性的能力。因子D拮抗剂的优选的生物学活性是实现可测量的因子D相关疾病或病症的状态(例如病理学)的改善的能力,所述因子D相关疾病或病症诸如例如补体相关的眼疾。可以在体外或体内测试(包括结合測定)中使用相关动物模型或人临床试验来确定活性。术语“补体相关的眼疾”以最广义使用，并且包括其病理学涉及补体(包括经典途径和旁路途径，并且尤其包括补体的旁路途径)的所有眼疾。补体相关的眼疾包括但不限于黄斑变性疾病(macular degenerative diseases),诸如包括干和湿(非渗出性和渗出性)形式(dry and wet (non-exudative and exudative) forms)的所有阶段的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration (AMD))、脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization (CNV))、葡萄膜炎(uveitis)、糖尿病性和其他贫血相关视网膜病(diabetic and other ischemia-related retinopathies)以及其他眼内新生血管疾病(intraocular neovascular diseases),诸如糖尿病性黄斑水肿(,diabetic macular edema)、柄; 里性近视(pathological myopia) > von Hippel-Lindau病(von Hippel-Lindau disease)、眼的组织胞衆菌病(histoplasmosis)、视网膜中央静脉阻塞(Central Retinal Vein Occlusion (CRVO))、角膜新生血管形成(cornealneovascularization)和视网膜新生血管形成(retinal neovascularization)。补体相关眼疾(complement-associated eye conditions)的优选组包括包括非渗出性(湿)和渗出性(干或萎縮)AMD (non-exudative (wet) and exudative (dry or atrophic) AMD)的年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization (CNV))、糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy (DR))和眼内炎(endophthalmitis)。“治疗”是以防止疾病的发展或改变疾病的病理学为目的进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性的或预防的方法。那些需要治疗者包括已经患有疾病者以及要防止其患有疾病者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗性药剂可以直接改变免疫响应的组分的响应的程度，或者通过其他治疗性药剂例如抗生素、抗真菌剂、消炎剤、化疗剂等使疾病对治疗更敏感。
疾病诸如补体相关的眼疾的“病理学”包括危及患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不可控细胞生长(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)、抗体产生、自身抗体产生、补体产生、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌性产物、抑制或加重任何炎症或免疫反应、炎症细胞(嗜中性细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)渗入到细胞空间中等。当在本文中使用时，术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、高等灵长类、家养和农场动物，以及动物园动物、竞技动物或宠物，如马、猪、牛、狗、猫和雪貂等。在本发明优选的实施方案中，哺乳动物是人。“结合”ー种或多种此外的治疗性药剂给药包括同时(并行)和以任何次序的连续给药。
“治疗有效量”是实现可测量的目标疾病或病症的状态(例如病理学)的改善所需要的“因子D拮抗剂”的量，所述疾病或病症诸如例如补体相关的眼疾。术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。当核酸与另ー核酸序列处于功能性关系中时，该核酸是“可操作连接”的。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA表达成參与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接"指相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况中指相邻且处于阅读框中。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果没有此类位点，那么可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。杂交反应的“严格性”可以容易地由本领域普通技术人员确定，而且通常凭经验根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度来计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。因此可以认为，较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，參见Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，Wiley Interscience Publishers,(1995)。本文中所定义的“严格条件”或“高严格性条件”可如下确定(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸钠/0. I %十二烷基硫酸钠，50°C ；
(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50% (v/v)甲酰胺及0.1%牛血清白蛋白质/0. 1% Ficoll/0. I %聚こ烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5，其含750mM氯化钠、75mM 柠檬酸钠，42 °C;或(3)采用 50 % 甲酰胺、5 X SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6. 8)、0. 1%焦磷酸钠、5XDenhardt氏溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50 μ g/ml)、0. 1% SDS和10%硫酸右旋糖苷，42°C，并在42°C于0. 2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在55 °C于50%甲酰胺洗涤，继之以高严格性的洗涤(其由在55 °C的含EDTA的0. I X SSC 组成)。
“中等严格条件"可以如 Sambrook 等，Molecular Cloning A LaboratoryManual (分子克隆实验室指南)，纽约冷泉港出版社，1989所述来鉴定，并且包括使用比上文所述那些较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％ SDS)。中等严格条件的ー个例子是于37°C在含20%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7. 6), 5 X Denhardt氏溶液、10%硫酸右旋糖苷、和20mg/mL变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中孵育过夜，接着在IXSSC中于约37-50°C洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。术语“带表位标签的”在用于本文时指包括与“标签多肽”融合的本发明的多肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够的残基以提供针对其可制备抗体的表位，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得该抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到50个氨基酸残基之间(优选在约10个到20个氨基酸残基之间)。术语“抗体”以最广义使用并且具体地覆盖，不限干，单ー抗因子D单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)以及具有多表位特异性的抗因子D抗体组合物。当在本文 中使用吋，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外，构成群体的各个抗体是相同的。当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，指向単一抗原位点。此外，与典型的包含指向不同决定簇(表位)的常规(多克隆)抗体制备不同，每个单克隆抗体指向抗原上単一的决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等(1975) Nature (自然)256 :495描述的杂交瘤方法制得，或者可以通过重组DNA方法(參见，例如，美国专利号4,816, 567)制得。还可以例如使用在 Clackson 等(1991) Nature (自然)352 =624-628 以及Marks等(1991) J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)222 :581-597中所述的技术来从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剰余部分与衍生自另一物种或属于另ー抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4，816，567 ;和 Morrison 等，(1984)美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 81 6851-6855)。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高可变区的残基用具有期望特异性、亲和カ和能力的来源于非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高可变区的残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进ー步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少ー个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节參见Jones等(1986) Nature (自然)321 :522-525 ;Riechmann等(1988) Nature (自然)332 :323-329 ;及 Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol.(结构生物学新见)2 :593-596。“物种依赖性抗体”是这样的抗体，其对于来自第一哺乳动物物种的抗原比其对于来自第二哺乳动物物种的该抗原的同源物具有更强的结合亲和力。正常地，该物种依赖性抗体“特异性地结合”至人抗原(即具有不起过大约1x10_7M，优选不超过大约1x10_8M且最优选不超过大约IxlO-9M的结合亲和力(Kd)值)，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同源物具有的结合亲和力比其对该人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍，或至少大
约500倍，或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文定义的多种抗体类型的任何一种，但是优选地是人源化的或人抗体。当在本文中使用吋，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中所述物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基已被修饰。这些突变体必须与所述物种依赖性抗体具有小于100 %的序列同一性或相似性。在优选实施方案中，所述抗体突变体与所述物种依赖性抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域任一个的氨基酸序列具有至少75%的氨基酸序列同一'丨生或相似性,更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、且最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于这一序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列且在需要时引入缺ロ以获得最大百分比的序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即，相同残基)或相似(即，基于共有侧链特性，来自于同一组的氨基酸残基，见下)的氨基酸残基的百分比。在可变结构域外抗体序列中的N端、C端、或内部延伸、缺失或插入不应该被解释为影响序列的同一性或相似性。“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶，激素，及其它蛋白质或非蛋白质的溶质。优选的实施方案中，将抗体纯化，(I)以产生用劳里方法(Lowrymethod)測定的超过95% (重量)的抗体，最优选超过99 % (重量)的抗体，(2)到通过使用转杯式序列分析仪(spinning cup sequenator)足够获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件使用考马斯蓝，或优选银染色，通过SDS-PAGE达到同质性(homogeneity)。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中的至少ー个组分将不存在。但是通常，分离的抗体将通过至少ー步纯化步骤来制备。当在本文中使用吋，“抗体可变结构域”指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(⑶Rs :即⑶R1、⑶R2和⑶R3)和构架区(FRs)的氨基酸序列。Vh指重链的可变结构域。ん指轻链的可变结构域。根据本发明所用方法，指定给CDRs和FRs的氨基酸位点可以根据Kabat来定义(免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),国立健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, Md. 1987 和1991)。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也是根据Kabat编号。当在本文中使用时，术语“互补决定区”(⑶Rs BP⑶R1，⑶R2和⑶R3)是指抗体可
变结构域的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有鉴定为⑶R1XDR2和⑶R3的三个⑶R区。每个互补决定区可包含来自Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约为轻链可变结构域中的残基24-34 (LI)，50-56 (L2)和89-97 (L3)以及重链可变结构域中的31-35 (Hl)，50-65 (H2)和95-102 (H3) ;Kabat等，免疫目的蛋白/(予列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),弟 5 版· Public HealthService,国家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991))和/或来自“高变环(hypervariable loop) ”的那些残基(即大致为轻链可变结构域中的残基 26-32 (LI) ,50-52 (L2)和 91-96 (L3)，及重链可变结构域中的 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和96-101 (H3) ;Chothia 和 Lesk (1987) J. Mol. Biol.(分子生物学)196 :901-917)。有些情况下，互补决定区能包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。例如，抗体4D5的重链的CDRHl包括氨基酸26-35。“构架区”(后文是FR)是⑶R残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1，FR2，FR3和FR4的四个FRs。如果所述CDRs根据Kabat来定义，则轻链 FR 残基大致位于残基 1-23 (LCFRl)，35-49 (LCFR2)，57-88 (LCFR3)，和 98-107 (LCFR4)，并且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-30 (HCFRl)，36-49 (HCFR2)，66-94 (HCFR3)， 和103-113 (HCFR4)。如果所述⑶Rs包含来自高变环的氨基酸残基，则轻链FR残基大致位于轻链中的残基 1-25 (LCFRl)，33-49 (LCFR2)，53-90 (LCFR3)，和 97-107 (LCFR4)，且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-25 (HCFRl)，33-52 (HCFR2)，56-95 (HCFR3)，和102-113 (HCFR4)。有些情况下，当⑶R包含来自根据Kabat定义的⑶R和高变环的那些氨基酸吋，FR残基会相应调节。例如，当⑶RHl包括氨基酸H26-H35吋，重链FRl残基在位点1-25且FR2残基在位点36-49。当在本文中使用吋，“密码子组”是指用于编码所需变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列的组。可以通过例如固相合成来合成ー组寡核苷酸，包括表示由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能的组合并且将编码所需的氨基酸组的序列。密码子指定的标准形式是IUB代码的形式，其在本领域中是已知的并且在本文中得到描述。密码子组通常由3个斜体的大写字母表示，例如NNK、NNS, XYZ、DVK等。因此当在本文中使用吋，“非随机密码子组”是指编码部分(优选完全地)满足本文中所述的氨基酸选择标准的选定的氨基酸的密码子组。在本领域中，在特定位置具有选定的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是熟知的，例如TR頂方法(Knappek等(1999) J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)296 :57-86)；Garrard & Henner (1993) Gene (基因)128 :103)。可以使用商品核酸合成仪(例如可从Applied Biosystems, Foster City, CA获得)来合成或者在商业上获得(例如从LifeTechnologies,Rockville,MD)这样ー组具有特定密码子组的寡核苷酸。因此，合成的具有特定密码子组的ー组寡核苷酸组通常将包括具有不同序列的多个寡核苷酸，所述不同由整个序列内的密码子组产生。如根据本发明使用的寡核苷酸具有这样的序列，其允许与可变结构域核酸模板的杂交并且还可以但未必包括可用于例如克隆目的的限制性酶位点。术语“抗体片段”在本文中以最广义使用并且包括但不限于Fab、Fab'、F{ah' )2、scFv、(scFv)2、dAb和互补决定区(CTR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微抗体(minibody)、双抗体(diabody)和自抗体片段形成的多特异性抗体。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。例如在scFv中，此区由ー个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以本质是共价的紧密缔合的ニ聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用从而定义在VH-\ ニ聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个CDR或其亚组将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力通常低于完整结合位点。“Fab”片段包括轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CHI)。F(ab' )2抗体片段包含ー对Fab片段，其通常在它们的羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸来共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般而言，Fv多肽在Vh和ん结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成期望的抗原结合结构。关于scFv的综述參见Pluckthun于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies (单克隆抗体药理学)，vol. 113, Rosenburg 和 Moore 编辑，Springer-Verlag, New York,pp.269-315(1994)。、术语“双抗体(diabodies) ”是指带有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在相同多肽链(Vh和^中连接到轻链可变结构域(\)的重链可变结构域(Vh)。通过使用太短以致同一条链上的两个结构域之间不能配对的接头，迫使结构域与另ー个链上的互补的结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;和Hollinger 等(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)，90 :6444-6448 中有更充分的描述。“线性抗体”的表述是指Zapata等(1995 Protein Eng.(蛋白质工程)，8 (10)1057-1062)描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段(Vh-ChI-Vh-ChI)，其与互补的轻链多肽一起形成ー对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。当在本文中使用吋，“库”是指多个抗体或抗体片段序列(例如，本发明的多肽)，或编码这些序列的核酸，所述序列的不同之处在于根据本发明的方法被引入到这些序列中的变体氨基酸的组合。“噬菌体展示”是将变体多肽作为融合蛋白显示到噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的至少部分的外壳蛋白的技木。噬菌体展示的效用在于可以快速且有效地根据以高的亲和カ(affinity)与目标抗原结合的那些序列来给大的随机蛋白变体库分类。肽和蛋白库在噬菌体上的展示已经被用于筛选上百万的多肽以找到具有特异结合性质的多肽。多价噬菌体展示方法已经被用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII的融合展示小的随机肽和小的蛋白质。Wells和Lowman(1992)Curr. Opin. Struct. Biol.(结构生物学新见)3 :355-362，以及其中引用的參考文献。在单价噬菌体展示中，蛋白质或肽库被融合到基因III或基因III的部分，并且在野生型基因III蛋白的存在下以低的水平表达以致噬菌体颗粒展示融合蛋白的一份拷贝或不显示融合蛋白。亲合力(avidity)效果相对多价噬菌体被减弱以致分类是基于内部配体亲和力，并且使用噬菌粒载体，这简化了 DNA操作。Lowman 和 Wells (1991)Methods :A companion to Methods in Enzymology (万法酶学万法指南)3 :205-0216。“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如ColEl)和噬菌体的基因间区域的拷贝的的质粒载体。可以在任何已知噬菌体(包括丝状噬菌体和λ噬菌体)上使用噬菌粒。质粒通常还将包含抗生素抗性的选择性标记。被克隆到这些载体中的DNA区段可以随质粒増殖。当向含有这些载体的细胞提供产生噬菌体颗粒所需的所有基因时，质粒的复制模式变为滚环式复制从而产生含质粒DNA和包装噬菌体颗粒的一条链的多个拷贝。噬菌粒可以形成传染性的或非传染性的噬菌体颗粒。此术语包括这样的噬菌粒，所述噬菌粒包含作为基因融合的与异源多肽基因相连的噬菌体外壳蛋白基因或其片段以使该异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。 术语“噬菌体载体”是指双链复制形式的噬菌体，其包含异源基因并且能够复制。噬菌体载体具有噬菌体复制起点，其允许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成。噬菌体优选丝状噬菌体诸如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或λ噬菌体诸如λ、21、phi80、phi81、82、424、434等或其衍生物。术语“肽模拟物(peptide mimetic) ”和“肽模拟物(peptidomimetic) ”可互换使用，并且指在构象上被清楚定义的肽分子，其模拟本文中的抗因子D抗体的因子D识别区(表位)的结构和结合性质。本文中的晶体结构使得能够鉴定和制备这些肽模拟物。详述晶体结构和分子建模申请人:使用高分辨率X射线晶体学已经解出了因子D/抗因子D抗体复合物的三维结构。此工作第一次提供了关于因子D与抗因子D抗体的结合位点的信息，以及參与与因子D的结合的抗因子D抗体重链和轻链的残基的信息。在一方面中，本发明涉及可结晶组合物，所述可结晶组合物包含与抗因子D抗体或这种抗体的抗原结合片段复合的因子D多肽。本发明提供的可结晶组合物可经由X射线晶体学检验。因此，本发明还包括所述可结晶组合物的晶体。本发明还提供高分辨率的因子D/抗因子D抗体复合物的三维结构(例如2.1 A或2.4 A分辨率，见图I)。X射线晶体学技术在本领域中是已知的。因子D/抗因子D抗体复合物的三维结构由在附录IA和IB中所示的结构坐标组定义。术语"结构坐标"是指笛卡尔原子坐标，所述笛卡尔原子坐标来源于与图案相关的数学等式，所述图案通过用晶体形式的因子D/抗因子D抗体复合物的胞外结构域的原子使単色束X射线衍射而获得。如在图5、6A和6B中所示，已经确定SEQ ID NO :1的人因子D的氨基酸残基D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222和K223參与与抗因子B抗体Fab片段的结合。还发现，在人因子D氨基酸序列中对结合关键的残基是R172，其可以潜在地与抗因子D抗体重链和轻链形成六个或更多个氢键。图6A和6B还显示了与人因子D分子紧邻并且可以与人因子D分子相互作用(例如通过形成氢键)的抗因子D抗体重链和轻链中的残基。本领域技术人员将理解多肽复合物的结构坐标组是定义三维形状的相关的ー组点。因此，可能的是不同的ー组坐标定义相似或相同的形状。此外，个体坐标的轻微差异将对整体形状几乎没有影响。根据本发明，包含因子D和抗因子D抗体或其抗原结合片段(例如抗因子D单克隆抗体的Fab片段)的复合物的结构坐标可以存储在机器可读存储介质中，其中所述机器可以是计算机。产生的数据可以用于不同用途，诸如，例如，药物发现，具有改善的性质(诸如改善的对因子D的特异性结合)的抗因子D抗体变体的发现，以及对其他蛋白晶体的X射线晶体学分析。为了使用产生的因子D/抗因子抗体复合物的结构坐标，有必要将结构坐标转化为三维形状。这可以通过使用能够从结构坐标组产生分子复合物或其部分的三维图形表征的市售软件来容易地实现。这种三维表征也在本发明的范围内。因此，本发明包括用于产生以下分子复合物的三维表征的计算机，所述分子复合物包含由 SEQ ID NO 1 的人因子 D 的氨基酸残基 D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、I179、E181、R222 和 K223 的结构坐标定义的结合位点，其中所述计算机包括(i)机器可读数据存储介质，所述存储介质包含用机器可读数据编码的数据存储材料，其中这种数据包括SEQ ID N0:1的人因子D的氨基酸残基D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、I179、E181、R222 和 K223的结构坐标，以及(ii)用于将机器可读数据处理成所述三维表征的指令。在某些实施方案中，所述计算机包括用于显示所述结构坐标的显示器。在另一方面，本发明涉及用于评价化学实体与分子复合物结合的潜能的方法，所 述分子复合物包含由SEQ ID NO :1的人因子D的氨基酸残基D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222 和 K223 的结构坐标定义的结合位点，所述方法包括以下步骤(i)采用计算方式来进行化学实体与分子复合物的所述结合位点之间的拟合操作；以及(ii)分析拟合操作的结果以定量化学实体与所述结合位点之间的结合。化学实体可以例如是因子D的激动剂或拮抗剂，其包括激动剂和拮抗剂抗体以及用于确定本文中与抗因子D抗体复合的因子D的晶体结构和三维构象的抗因子D抗体的变体，或这种抗体的抗原结合片段。化学实体也可以是激动剂或拮抗剂因子D抗体或抗体片段的肽模拟物。可以合成潜在的激动剂或拮抗剂，并使其与因子D接触以确定其与因子D相互作用(例如结合)的能力。还可能确定潜在的拮抗剂是否妨碍因子D/抗因子D抗体相互作用。可能的是，在实际检测潜在的拮抗剂与因子D的结合前，使用本发明提供的分子坐标和三维模型通过计算机建模技术来分析这种化合物的结构。如果计算机建模指示强的相互作用或结合，然后，则可以制备该化合物(例如通过合成和/或重组方法)并测试其与因子D结合的能力。抗因子D抗体使用来源于哺乳动物物种的因子D抗原来选择抗因子D抗体。优选地抗原是人因子D。然而，也可以将来自其他物种的因子D诸如食蟹猴后或鼠因子D用作目标抗原。可以从天然源中分离来自不同哺乳动物物种的因子D抗原。在其他实施方案中，通过重组方法制备抗原或者使用本领域中已知的其他合成方法来生产抗原。遵循本发明的方法选择的抗体通常将具有足够强的对因子D抗原的结合亲和力。例如，所述抗体可以以不超过大约5nM，优选地不超过大约2nM，并且更优选地不超过大约500pM的Kd值结合人因子D。可以通过例如以下方法确定抗体亲和カ基于表面等离子共振的測定(诸如如在实施例中所述的BIAcore測定)；酶联免疫吸附测定(ELISA);以及竞争性测定(例如RIA的)。同样，可以对抗体进行其他生物活性測定，例如，为了评价其作为治疗剂的有效性。这些測定在本领域中是已知的并且取决于该抗体的目标抗原和有意的用途。实例包括HUVEC抑制測定；肿瘤细胞生长抑制測定(如例如在WO 89/06692中所述的)；抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定(美国专利5，500，362);以及下述用于鉴定因子D拮抗剂的体外和体内測定。为筛选与目的抗原上特定表位结合的抗体，可以进行常规交叉阻断測定，诸如在 Antibodies, A Laboratory Manual (抗体，实验手册' )，Cold Spring HarborLaboratory (冷泉港实验室)，Ed Harlow和David Lane (1988)中所述的。备选地，可以进行表位定位，例如如在Champe等(1995) J. Biol. Chem.(生物化学杂志)270 =1388-1394中所述的，以确定抗体是否结合目的表位。在优选实施方案中，使用唯一噬菌体展示方法来选择抗因子D抗体。该方法涉及基于单ー框架模板产生合成的抗体噬菌体库，在可变结构域内设计足够的多祥性，展示具有多祥化可变结构域的多肽，选择对目标因子D抗原具有高亲和カ的侯选抗体，以及分离所选择的抗体。
可以在例如W090/05144 ；W090/14424 ；W090/14430, W092/01047, W093/11236 ；W091/05058 ；W003/102157 ；W091/05058 ；US 6，291，158 ；US 6，291，159，US 6，291，160，US6，291，161 ；US 5，969，108，US 5，885，793 ;和 US 5，643，768 中找到噬菌体展示方法的细节。因子D 抗体在美国专利公布号 20020081293、20080118506、20090181017 和20090269338中得到公开，所述专利的全部公开内容通过引用清楚地结合于此。优选的抗体包括抗体克隆#56、#111、#250和#416，所述克隆的可变重链和可变轻链氨基酸序列显示在图10 (SEQ ID NOs :5、6、7和8，分別)中。进ー步优选的抗因子D抗体是抗因子D Fab 238。人源化抗因子D Fab238的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO 9)显示在图11 (SEQ ID NO 9)中。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238的轻链，起始和终止密码子以粗体和下划线显示。对应于图11 (SEQ ID NO:10)中第一个氨基酸的密码子是粗体并被斜体化。图12显示人源化抗因子D Fab 238的轻链的氨基酸序列(SEQ ID N0:10)。该氨基酸序列缺少由显示在图11中的SEQ ID NO 9编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CLl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示。图13显示人源化抗因子D Fab 238的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO : 18)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238的重链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图14(SEQ ID NO :19)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图14显示人源化抗因子D Fab 238的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)。该氨基酸序列缺少由显示在图13中的SEQ ID NO 18编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CHl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示。又进ー步优选的抗因子D抗体是抗因子D Fab 238_1。图15显示人源化抗因子DFab 238-1的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO :28)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab238-1的轻链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图16(SEQ ID NO :29)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图16显示人源化抗因子D Fab 238-1的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO 29)。该氨基酸序列缺少由显示在图15中的SEQ ID N0:28编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CLl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示。图17显示人源化抗因子D Fab 238-1的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO :30)。该核苷酸序列编码人源化抗因子DFab238-1的重链，起始和终止密码子用粗体和下划线显示。对应于图18 (SEQ ID NO 31)中的第一个氨基酸的密码子是粗体的并被斜体化。图18显示人源化抗因子D Fab 238-1的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO 31)。该氨基酸序列缺少由显示在图18中的SEQ ID NO 30编码的多肽的N末端信号序列。HVR序列是粗体的并被斜体化。可变区是没有下划线的区域，而第一恒定结构域CHl是下划线的。框架(FR)区和HVR区被显示另ー个优选的抗因子D抗体是抗因子D Fab 238_2，其具有显示在图19 (SEQ IDNO 40)中的轻链氨基酸序列和显示在图20 (SEQ ID NO 41)中的重链氨基酸序列。优选的模拟物，例如肽模拟物，模仿本文中的优选抗体或抗体片段的结合和/或生物学性质。因子D抗体和其他因子D拮抗剂的用途本文中的本发明提供因子D拮抗剂，其包括对于预防和治疗补体相关病症有用的抗因子D抗体和它们的变体以及它们的片段(例如抗原-结合片段)，所述补体相关病症包括眼睛病症(其病理学涉及补体(包括经典途径和旁路途径，并且尤其包括补体的旁路途径)的所有眼睛病症和疾病)，诸如，例如，黄斑变性疾病，诸如包括干和湿(非渗出性和滲出性)形式的所有阶段的年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其他贫血相关视网膜病、眼内炎以及其他眼内新生血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成和视网膜新生血管形成。补体相关眼睛病症的优选组包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，其包括非渗出性(例如中间干AMD或地图状萎縮(GA))和渗出性(例如湿AMD (脉络膜新生血管形成(CNV)) AMD ;糖尿病性视网膜病(DR);眼内炎和葡萄膜炎。在一个实例中，补体相关的眼疾是中间干AMD。在一个实例中，补体相关的眼疾是地图状萎縮。在一个实例中，补体相关的眼疾是湿AMD(脉络膜新生血管形成(CNV))。AMD是年龄相关的黄斑变性，其是年龄超过60岁的个体不可逆的视觉功能障碍的主要原因。有两种AMD，非滲出性(干)和滲出性(湿)AMD。干或非滲出性形式涉及视网膜中央(黄斑)下的视网膜色素上皮(RPE)的萎缩和增生性变化以及在RPE上的沉积物(玻璃疣)。患有非渗出性AMD的患者可能进展到湿或渗出性形式的AMD，其中被称为脉络膜新生血管膜(CNVMs)的异常血管在视网膜下发展，漏出液体和血液，并最终导致视网膜中或视网膜下的致盲盘状瘢痕。作为渗出性AMD前身的非渗出性AMD是更常见的。非渗出性AMD的表现不同可以出现硬玻璃疣、软玻璃疣、RPE地图状萎縮和色素聚集。补体组分在AMD的早期沉积在RPE上并且是玻璃疣的主要成分。可以在多种基于细胞的測定和补体相关疾病或病症的动物模型中评价因子D拮抗剂。因此，例如，可以通过使用产生转基因动物的标准技术将目的基因的编码部分引入到目的动物的基因组中来改造重组(转基因)动物模型。可以充当转基因操作目标的动物包括但不限干小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类动物，例如狒狒、黒猩猩和其他猴。本领域中已知的用于将转基因引入到这些动物中的技术包括前核微注射(Hoppe和Wanger，美国专利号4，873，191);逆转录病毒介导的到种系中的基因转入(例如，Vander Putten 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院学报)82，6148-615 [1985]);胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等，Cell (细胞)56，313-321 [1989]);胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cell. Biol.(分子细胞生物学)3，1803-1814[1983]);精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell (细胞)57，717-73 [1989])。综述见例如美国专利号4，736，866。对于本发明来说，转基因动物包括仅在其部分的细胞中携带转基因的那些(“嵌合动物”)。转基因可以作为单个基因或以多联体的形式被整合，例如，头对头或头对尾串联。通过以下的例如 Lasko 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院学报)89，623-636 (1992)的技术，将转基因选择性的引入到特定细胞类型中也是可能的。可以通过标准技术来监测转基因在转基因动物中的表达。例如，可以将Southern印迹分析或PCR扩增用于验证转基因的整合。然后可以使用技术诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学来分析mRNA表达水平。
可以例如通过组织学检查确定免疫细胞渗入到特定组织中来进ー步检查动物的免疫疾病病理学病症。还可以进行阻断实验，其中用候选因子D拮抗剂来处理转基因动物以确定对补体和补体激活(包括经典途径和旁路途径)或T细胞増殖的作用的程度。在这些实验中，将与本发明的多肽结合的阻断抗体给药于动物并且监测感兴趣的生物学作用。备选地，可以构建“敲除”动物，作为将内源的编码因子D多肽的基因和被改变的编码相同多肽的基因组DNA之间的同源重组引入到动物的胚胎细胞中的结果，所述“敲除”动物具有缺陷的或被改变的编码因子D的基因。例如，可以根据现有技术将编码因子D的cDNA用于克隆编码因子D的基因组DNA。编码因子D的基因组DNA的部分可以缺失或被另ー个基因代替，所述另ー个基因诸如编码可以用于监测整合的选择性标记的基因。通常，数千碱基的未改变的侧翼DNA(在5'和3'端都有)包含在载体中[见例如，Thomas和Capecchi，Cell (细胞)，51 =503(1987)对于同源重组载体的描迷]。将所述载体引入到胚胎干细胞系中(例如，通过电穿孔)并且选择其中引入的DNA已经与内源DNA同源重组的细胞[见例如，Li等，Cell (细胞)，69 :915 (1992)]。然后将所选择的细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集的嵌合体[见例如，Bradley于Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells A Practical Approach(畸胎瘤和胚胎干细胞实用方法)，E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]。然后可以将嵌合体胚胎植入到合适的假孕雌性养育动物中并且将胚胎培养到分娩期以产生“敲除”动物。在其生殖细胞中带有同源重组DNA的后代可以通过标准技术来鉴定并且可以被用于培育这样的动物，其中该动物的所有细胞都包含同源重组DNA。敲除动物可以例如以它们抵抗特定病理病症的能カ以及它们由于缺少因子D多肽所致的病理病症的发展来表征。因此，可以在鼠因子D敲除小鼠中进ー步研究潜在因子D拮抗剂的生物学活性。年龄相关性黄斑变性(AMD)的动物模型由具有在Ccl-2或Ccr_2基因中的无效突变的小鼠组成。这些小鼠发展出AMD的基本特征，包括脂褐质在视网膜色素上皮(RPE)中的累积和玻璃疣在RPE下的累积，光感受器萎縮和脉络膜新生血管形成(CNV)。这些特征在超过6周龄时发展。可以对于玻璃疣形成、光感受器萎缩以及脉络膜新生血管形成来测试候选因子D拮抗剂。药物组合物可以通过将具有所需纯度的多肽与通常在本领域中使用的任选的“药用”载体、赋形剂或稳定剂(所有这些都被称为"赋形剂")混合来制备多肽或抗体或其抗体片段(例如抗原-结合片段)或其抗体变体的治疗制剂以作为冻干制剂或水溶液存储。例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剤、等渗剂、非离子去垢剂、抗氧化剂和其他混合添加剤。(见Remington ' s Pharmaceutical Sciences (Remington 药物科学)，16 版，A. Osol 编辑(1980))。这些添加剂在所用的剂量和浓度对于受体必须是无毒性的。缓冲剂有助于将pH維持在接近生理条件的范围内。它们优选地以范围为大约2mM至大约50mM的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸ニ钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化 钠混合物、琥珀酸-琥珀酸ニ钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸单钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸ニ钠混合物、富马酸单钠-富马酸ニ钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及こ酸缓冲剂(例如，こ酸-こ酸钠混合物、こ酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以提及的有磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐诸如Tris。可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且其可以以范围为0.2^-1% (w/v)的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酷、对羟基苯甲酸丙酷、十八烷基ニ甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、六甲氯铵、烷基对羟基苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酷、儿茶酚、间苯ニ酚、环己醇和3-戊醇。可以添加等渗剂(有时也被称为“稳定剂”)以保证本发明的液体组合物的等渗压性，并且其包括多元糖醇，优选地包括三元或更高元糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂涉及宽的赋形剂种类，其在功能上覆盖的范围可以是从填充剂到添加剤，所述添加剂是治疗剂溶解或者有助于防止变性或粘附到容器壁上。典型的稳定剂可以是多元糖醇(以上例举的)；氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinositol)，半乳糖醇、甘油等，包括环醇诸如肌醇(inositol);聚こ二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代こ醇酸钠、硫甘油、α硫甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即< 10残基)；蛋白质诸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚こ烯吡咯烷酮单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；ニ糖诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖诸如棉子糖；多糖诸如葡聚糖。稳定剂可以以范围为0. I至10，000重量/重量部份活性蛋白。可以添加非离子表面活性剂或去垢剂(也被称为“湿润剂”)以促进治疗剂的稳定以及使治疗剂免于搅拌导致的聚集，其也允许制剂暴露于受压的剪切表面而不导致蛋白的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨糖醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、Pluronic. R. TM.多兀醇、聚氧こ烯山梨糖醇酐单酯(Tween. RTM. _20、Tween. R. TM. -80 等)。非离子表面活性剂可以以范围为大约O. 05mg/ml至大约I. Omg/ml,优选地大约O. 07mg/ml至大约O. 2mg/ml存在。另外的混合赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)以及助溶剤。如果为被治疗的适应证所需，本文中的制剂也可以包含超过ー种活性化合物，优选地包含具有彼此不产生不利作用的互补活性的那些。例如，可能需要进ー步提供免疫抑制剂。这些分子适合以对目的用途有效的量组合存在。也可以将活性成分夹在制备的微胶囊中，例如，在胶质药物递送系统(例如，脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在巨乳液中，分别通过凝聚技术或通过界面聚合，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酷)微胶囊。这种技术公开在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Remington 药物科学 ノ，16th edition, A. Osal,Ed. (1980)中。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以例如通过经由无菌滤膜过滤容易地实现。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括包含抗体或抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的固体疏水聚合物的半滲透基质，该基质是以成型物品的形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟こ基-甲基丙烯酸)或聚(こ烯醇))、聚交酷(美国专利号3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸こ酯的共聚物、不可降解的こ烯-こ酸こ烯酯、可降解的乳酸-こ醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (可注射微球，其由乳酸-こ醇酸共聚物和こ酸亮丙瑞林组成)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物诸如こ烯-こ酸こ烯酯和乳酸-こ醇酸能够释放分子超过100天，而某些水凝胶在更短的时间周期内释放蛋白。当被包起来的抗体留在体内很长时间时，它们可能由于在37°C暴露于湿气而变性或聚集，从而导致生物活性丧失以及可能的免疫原性的改变。可以根据所涉及的机制设计用于稳定化的合理机制。例如，如果发现聚集机制是通过硫-ニ硫互换的分子间S-S键形成，可以通过以下方法实现稳定化修饰巯基残基、从酸性溶液中冷冻干燥、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特异性的聚合物基质组合物。可以通过本发明的方法鉴定的用于预防或治疗眼睛疾病或病症的化合物通常通过以下方式给药眼部、眼内和/或玻璃体内注射，和/或巩膜旁注射，和/或筋膜下注射，和/或脉络膜上注射和/或以滴眼液和/或膏剂的形式局部给药。本发明的这些化合物可以通过多种方法递送，例如作为装置和/或贮藏物经玻璃体内递送，其允许化合物缓慢释放到玻璃体内，包括在參考文献诸如Intraocular Drug Delivery (眼内药物递送),Jaffe,Jaffe, Ashton 和 Pearson 编辑，Taylor & Francis (2006 年 3 月)中所述的那些。在一个实例中，装置可以以微型泵和/或基质和/或被动扩散系统和/或被包起来的细胞的形式，其在延长的时间周期内释放化合物(Intraocular Drug Delivery(眼内药物递送)，Jaffe,Jaffe,Ashton 和 Pearson 编辑,Taylor & Francis (2006 年 3 月))。也可以使用其他给药方法，其包括但不限于局部给药、肠胃外给药、皮下给药、腹膜内给药、肺内给药、鼻内给药和病变处给药。肠胃外注入包括肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、腹膜内给药或皮下给药。可以通过本领域中已知的方法和本领域中已知的成分来制备眼部、眼内或玻璃体 内给药的制剂。对有效治疗的主要需要是合适的穿透眼睛。与可以局部递送药物的眼前部疾病不同，视网膜疾病需要更具有位点特异性的方法。滴眼液和膏剂很少穿透眼睛的后部，并且血眼屏障妨碍被全身给药的药物穿透到眼组织中。因此，通常选择的用于药物递送以治疗视网膜疾病(诸如AMD和CNV)的方法是直接的玻璃体内注射。通常以一定的间隔重复玻璃体内注射，所述间隔取决于患者状态以及被递送药物的性质和半衰期。对于眼内(例如玻璃体内)穿透，通常优选的是具有较小尺寸的分子。可以通过通常用于评估眼内疾病的不同終点来測量对补体相关的眼睛病症诸如AMD或CNV的治疗效力。例如，可以评估视カ衰退。可以通过但不限于例如以下方法来评估视カ衰退通过到所需时间点的最佳校正视敏度(BCVA)距基线的平均改变来測量(例如，其中BCVA是基于糖尿病视网膜病变早期治疗研究(ETDRS)视カ表并且在4米的测试距离进行估定)，測量相比于基线在所需的时间点在视敏度方面失去少于15个字母的受试者的比例，測量相比于基线在所需的时间点在视敏度方面得到多于或等于15个字母的受试者的比例，測量在所需的时间点视敏度Snellen等效值为20/2000以下的受试者的比例，测量NEI视功能问卷，测量在所需的时间点的CNV的尺寸和CNV的渗漏量，例如通过荧光血管造影术等。进行视觉评估，例如，其包括但不限于例如进行眼部检查，測量眼内压，评估视敏 度，測量裂缝灯压力，评估眼内炎症等。将有效治疗特定疾病或病症的治疗性多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的量将取决于疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。当可能时，理想的是确定剂量-反应曲线并且首先在体外确定本发明的药物组合物，然后在人中测试之前在有用的动物模型系统中确定本发明的药物组合物。在一个实施方案中，通过皮下注射来给药治疗性多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的水溶液。在另ー个实施方案中，通过玻璃体内注射来给药治疗性多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的水溶液。每剂可以是范围为大约O. 5. mu. g至大约50. mu. g/千克体重,或者更优选地，大约3. mu. g至大约30. mu.
g/千克体重。皮下给药的用药时间表可以从每月一次到每天一次变化，其取决于众多临床因素，包括疾病类型、疾病的严重度，以及受试者对治疗剂的敏感性。仅出于例示目的提供以下实施例，而不是意欲以任何方式限制本发明的范围。本说明书中引用的所有专利和文献參考通过引用明显地完整地结合于此。实施例I确定因子D和抗因子D抗体的共晶结构将人和食蟹猴因子D两者表达在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。通过使CHO细胞的上清在抗因子D亲和柱上经过来进行纯化。用O. IM酸以及4% v/v I. 5M Tris pH 8. 6来洗脱蛋白，并且在含有IOmM Hepes pH 7. 2与140mM NaCl的缓冲液中透析。以冻干制剂提供抗因子D Fab并且用水使其再生。所得的溶液是50mg/mL的蛋白溶在40mM盐酸组氨酸、20mM氯化钠、180mM蔗糖、O. 04% (w/v)聚山梨醇酯20，pH 5. 4中。按I : I的比率混合人因子D蛋白和抗因子D Fab并且在Superdex 200柱上进行纯化,所述Superdex 200柱用20mM h印es、pH 7. 2和200mM NaCl预平衡过。收集含有复合物的峰馏分，浓缩到30mg/ml并且用于结晶实验。晶体使用气相扩散法以坐滴的方式在4°C生长。将包含O. IM TrisCl, pH 8. 5、O. 2M磷酸铵、50% ΜΗ)和O. OlM氯化六胺合钴(III)的结晶缓冲液与蛋白溶液等体积混合。晶体在6天后出现并且属于空间群P4A2。晶体用液氮速冻。在SSRL Synchrotron Source (SSRL同步加速器光源)在束线9-2收集至1J2.4A的数据集。遵从与以上所述相同的方案纯化食蟹猴因子D/抗因子D Fab复合物。在19°C从以下条件生长出用于结构确定的晶体0. IM MES pH 6. 5,25% PEG 550MME、0. OlM硫酸锌和3% 6-氨基己酸，使用气相扩散法，以坐滴的方式，所述坐滴中包含等体积的蛋白溶液(20mg/ml)和母液。晶体在I天后出现并且属于空间群C2，人因子D :Fab复合物的晶胞大小为a = 132. 048,b = 132. 048 ；c=l 80.288 A，而食蟹猴因子D :Fab复合物的晶胞大小为a = 182. 205 ；b = 80. 673 ；c= 142.575 A。将晶体在含有10%甘油的人工母液中浸泡并且在液氮中速冻。在SSRL Synchrotron Source (SSRL同步加速器光源)在束线9-2收集到2.1A的数据集。实施例2制备无催化活性的因子D蛋白 将全长因子D cDNA克隆到pRK表达载体中。使用QuickChange XL位点定向突变试剂盒遵从制造商的说明(Stratagene(Agilent), Santa Clara, CA)将作为部分的催化三联体的残基S208(距起始甲硫氨酸；使用胰蛋白酶编号为S195)突变为丙氨酸。蛋白在CHO细胞中表达，并且通过使上清多次通过偶联有26mg/ml抗因子D抗体的Affi-Gel10 (Bio-Rad)来纯化，并且在pH 3. O洗脱。使用ニ级10/10MonoS pH 6· O柱来进ー步纯化蛋白，用Amicon Ultra-IOkD离心过滤管(Millipore,Billerica,MA)来浓缩并且在PBS中透析。通过使用MALDI质谱的N端测序来验证蛋白序列。实施例3在液相旁路途径C3转化酶測定中抗因子D抗体阻断因子B切割测定缓冲液是0. I %明胶佛罗拿缓冲液/IOmM MgCl2,组分的终浓度为0. 125 μ M因子D、0. 5μΜ因子Β、0. 5μΜ C3b和5 μ M Fab抗体(抗因子D、8E2、对照人Fab)。将10 μ I 因子 D (0. 5 μ M)和 10 μ I Fab (20 μ Μ)混合 15min。将 10 μ I 因子 B (2 μ Μ)和 10 μ IC3b (2 μ Μ)添加到因子D-Fab混合物中并在37°C孵育30分钟。添加40 μ I Lammeli氏缓冲液以終止反应。将样品煮5分钟并且在Novex 4-20% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上以125mV电泳I. 5小时(SeeBlue 2MW标记)。用SimplyBlue SafeStain将凝胶染色一小时，用双蒸水过夜洗涤并且在玻璃纸之间干燥。如在图21中所示，因子B切割被抗因子D抗体阻断但是不被8E2阻断。结果显示抗因子D抗体在液相旁路途径C3转化酶測定中阻断因子B的切割。实施例4因子D(S208A)以772nM的亲和カ结合转化酶原(Bioacore分析)在Biacore 3000上进行结合分析。遵从制造商的建议将C3b胺偶联到CM5芯片上。用N-羟基琥珀酰亚胺和N-こ基-N’ _( ニ甲基氨基丙基)-碳ニ亚胺激活CM5芯片，流动 5 μ 1/min, 30 μ I。使 C3b (50 μ g/ml)流动 5 μ l/min、20 μ I 以最终获得 7300RU。使用GE Healthcare的AKTA在测定缓冲液佛罗拿缓冲液/ImM NiCl2/0. 05%表面活性剂P-20中对因子B、因子D、抗因子D抗体和8E2Fab片段蛋白和抗体进行缓冲液交換。结合測定使用“ Coinject (共注射)”程序。注射I μΜ因子B (流动30 μ I/分钟，90 μ I)，继之以共注射ΙμΜ因子B和因子D稀释液的混合物(流动30μ I/分钟，90μ 1)，然后允许其在測定缓冲液中解离5分钟。用3Μ NaCl、50mMこ酸钠pH 5. O洗涤I分钟，洗三次来使芯片再生，并且用缓冲液洗涤5分钟。如在图22和23中所示，如由此Biacore分析所确定的，因子(S208A)以772nM的亲和カ结合C3bB转化酶原。实施例5抗因子D抗体阻断因子D结合在Biacore 3000上进行结合分析。遵从制造商的建议将C3b胺偶联到CM5芯片上。用N-羟基琥珀酰亚胺和N-こ基-N’ _( ニ甲基氨基丙基)-碳ニ亚胺激活CM5芯片，流动 5 μ 1/min, 30 μ I。使 C3b (50 μ g/ml)流动 5 μ 1/min、20 μ I 以最终获得 6020RU。使用GE Healthcare的AKTA在测定缓冲液佛罗拿缓冲液/ImM NiCl2/0. 05%表面活性剂P-20中对因子B、因子D、抗因子D抗体和8E2Fab片段蛋白和抗体进行缓冲液交換。结合測定使用“ Coinject (共注射)”程序。注射I μΜ因子B (流动30 μ I/分钟，90 μ I)，继之以共注射I μ M因子B、I μ M因子D和Fab抗体稀释液的混合物(流动30 μ I/分钟，90 μ I)，然后允许其在测定缓冲液中解离5分钟。用3Μ NaCl、50mMこ酸钠pH 5. O洗涤I分钟，洗三次来使芯片再生，并且用缓冲液洗涤5分钟。如在图24和25中所示，抗因子D抗体阻断因子D(S208A)结合C3bB转化酶原。实施例5抗因子D抗体不影响催化切割小底物被与抗因子D抗体结合的因子D有效切割，证明因子D活性位点未发生大的构象变化。使用DTNB (Ellman试剂(5，5' - ニ硫双-(2-硝基苯甲酸))在測定缓冲液50mM HEPES pH7. 5/220mM NaCl中测量因子D对硫酯苄基底物Z-Lys-SBzl的水解。制备以下储液DMSO (ニ甲亚砜)中的3.2mM Z-lys_SBzl、320nM因子D蛋白(Genentech)、在测定缓冲液中的3. 2 μ M抗体和8mM DTNB，以及在异丙醇中的200mM DIFP (ニ异丙基氟磷酸)。测定体积是是200μ 1，在测定缓冲液中，其中以下各项的终浓度为2mM DTNB、800nMZ-Lys-SBzl、80nM 因子 D、800uM 抗体或 20mM DIFP。在 Spectramax Plus 384 分光光度计中在450nm处测量水解率，I. 5小时，每15秒采集读数，并且使用SoftMax Pro v5. 2软件计算 Vmaxο图26和27显示抗因子D抗体不影响催化切割。 图28是假设的模型，该模型描绘了抗因子D抗体如何抑制因子B激活。抗因子D抗体在空间上阻止因子D与因子B对接，阻止因子B的激活和活性C3转化酶的形成。
权利要求
1.晶体，所述晶体由天然序列因子D多肽或所述天然序列因子D多肽的功能片段或保守氨基酸置换变体形成。
2.权利要求I所述的晶体，其中所述天然序列因子D多肽是人或食蟹猴因子D。
3.权利要求2所述的晶体，其中所述天然序列因子D多肽是SEQID N0:1的人因子D。
4.权利要求3所述的晶体，其特征在于单位晶胞參数约等于以下各项晶胞大小a=132. 048，b = 132. 048 ；c = 180. 288，空间群 P43^2，晶体常数 2 4A 并且 R/Rfree =.21. 2% /27. 2。
5.权利要求2所述的晶体，其中所述天然序列因子D多肽是SEQID NO :2的食蟹猴因子D。
6.权利要求5所述的晶体,其特征在于单位晶胞參数约等于以下a= 182.205 ；b =.80. 673 ；c = 142. 575 ;空间群 C2，晶体常数2.lA;并且 R/Rfree = 21. 1% /26. 9。
7.组合物，所述组合物包含权利要求I、权利要求4或权利要求6所述的晶体。
8.可结晶组合物，所述可结晶组合物包含与抗因子D抗体或所述抗体的抗原结合片段复合的因子D多肽。
9.权利要求8所述的可结晶组合物，其中所述抗因子D抗体是单克隆抗体。
10.权利要求9所述的可结晶组合物，其中所述片段是Fab片段。
11.权利要求9所述的可结晶组合物，其中所述因子D多肽是SEQID NO :1的人因子D0
12.权利要求11所述的可结晶组合物，其具有在附录IA中所示的结构坐标。
13.权利要求9所述的可结晶组合物，其中所述因子D多肽是SEQID NO :2的食蟹猴因子D。
14.权利要求13所述的可结晶组合物，其具有在附录IB中所示的结构坐标。
15.权利要求8所述的可结晶组合物，其中所述因子D多肽包含催化三联体。
16.晶体，所述晶体包含与抗因子D抗体或其抗原结合片段复合的因子D多肽。
17.权利要求16所述的晶体，其中所述抗体是单克隆抗体。
18.权利要求17所述的晶体，其中所述片段是Fab片段。
19.权利要求17所述的晶体，其中所述因子D多肽是SEQID NO :I的人因子D。
20.权利要求19所述的晶体，其具有附录IA的结构坐标。
21.权利要求17所述的晶体，其中所述因子D多肽是SEQID NO :2的食蟹猴因子D。
22.权利要求21所述的晶体，其具有附录IB的结构坐标。
23.权利要求16所述的晶体，其中所述因子D多肽包含催化三联体。
24.权利要求19所述的晶体，其中在所述SEQID NO :1的人因子D多肽或其抗原结合片段中，氨基酸残基 D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222和K223中的一个或多个參与与所述抗因子D抗体的复合。
25.权利要求24所述的晶体，其中在所述SEQID NO :1的人因子D多肽或其抗原结合片段中，氨基酸残基 D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222和K223中的全部參与与所述抗因子D抗体的复合。
26.权利要求19所述的晶体，其中在所述SEQID NO :I的人因子D多肽或其抗原结合片段中，氨基酸残基R172与所述抗因子D抗体或其抗原结合片段的重链和轻链形成氢键。
27.用于产生分子复合物的三维表征的计算机，所述分子复合物包含由SEQID N01的人因子 D 的氨基酸残基 D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222和K223的结构坐标定义的结合位点，其中所述计算机包括(i)机器可读数据存储介质，所述介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包括 SEQ ID NO 1 的人因子 D 的氨基酸残基 D131、V132、P134、D165、R166、A167、T168、N170、R171、R172、T173、D176、G177、1179、E181、R222 和 K223 的结构坐标，以及(ii)用于将所述机器可读数据处理成所述三维表征的指令。
28.权利要求27所述的计算机，其还包括用于显示所述结构坐标的显示器。
29.用于评价化学实体与分子复合物缔合的潜能的方法，所述分子复合物包含由SEQID NO 1 的人因子 D 的氨基酸残基0131、￥132、卩134、0165、1 166、六167、1'168、附70、1 171、R172、T173、D176、G177、I179、E181、R222和K223的结构坐标定义的结合位点，所述方法包括以下步骤(i)采用计算方式来进行所述化学实体与所述分子复合物的结合位点之间的拟合操作；以及(ii)分析所述拟合操作的结果以定量所述化学实体与所述结合位点之间的缔合。
30.权利要求29所述的方法，其中所述化学实体是抗体或其抗原结合片段，或者所述抗体或抗体片段的肽或小分子模拟物。
31.权利要求30所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述残基中的ー个或多个形成氢键。
32.权利要求31所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与SEQID ΝΟ:1的人因子D的氨基酸残基R172形成氢键。
33.能够通过权利要求29-32中任一项所述方法鉴定的化学实体。
34.计算机，所述计算机用于确定对应于分子复合物的X射线衍射图案的至少部分结构坐标，其中所述计算机包括a)机器可读数据存储介质，所述介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包括根据图6和7或附录Ia或Ib的至少部分结构坐标山)机器可读数据存储介质，所述介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包括所述分子复合物的X射线衍射图案；c)用于存储处理a)和b)的所述机器可读数据的指令的工作存储器；d)与所述工作存储器和a)和b)的所述机器可读数据偶联在一起的中央处理单元，所述中央处理单元用于执行对(a)的所述机器可读数据的傅里叶变换以及用于将(b)的所述机器可读数据处理成结构坐标；以及e)与所述中央处理单元偶联的显示器，所述显示器用于显示所述分子复合物的所述结构坐标。
全文摘要
本发明涉及因子D和抗因子D抗体或其抗原结合片段的共晶结构。
文档编号G06F19/16GK102666850SQ201080056889
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者克里斯蒂安·维斯曼, 门诺·凡卢克伦·康帕涅 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司