专利名称：miR-24用于治疗或诊断心衰或患心衰倾向或者改善心肌细胞功能的方法
技术领域：
本发明涉及MicroRNA领域。本发明还涉及心衰的诊断或治疗，特别是心衰的早期诊断或治疗。本发明还涉及用于筛选诊断或治疗心衰的药物的方法。
背景技术：
心力衰竭(简称“心衰”)是各种心血管疾病发展的最终阶段，主要表现为心脏泵血能力下降、全身体血液循环不能维持正常运行而出现的系列综合征。随着经济社会发展和人口老龄化进程，心衰的发病率有逐年上升的趋势。我国50家主要医院病例调查显示， 心衰患者的住院数量占同期心血管疾病的20%，但死亡数量却占40%。2005年美国心脏病学会和美国心脏病学院(ACC/AHA)公布的心衰治疗指南指出心衰的早期防治将是战胜心衰的关键。但如何在早期防治心衰还是个很新且尚未解决的医学问题。以往针对心衰发生、发展分子病理机制的研究多集中在心衰发病的中晚期，即心脏组织结构明显改变、心功能严重受损阶段。近年来临床研究提示，在心脏病变发生的早期 (即心功能受损尚不十分明显的时期)进行诊断和干预，对于心血管疾病预后有着极其重要的影响。最近我们研究发现，在心衰发展的早期，当心脏泵血功能、心肌细胞收缩能力还没有明显异常的时候，细胞内分子水平的钙信号耦联已经出现了显著衰退。另一方面，传统的心衰治疗相关的研究策略集中在受体拮抗剂、炎症因子抑制剂、蛋白激酶的拮抗剂等方面。而近年来许多研究者开始意识到心肌细胞结构蛋白的改变在心衰发展中至关重要，是心衰治疗不容忽视的又一重要靶点。在细胞水平上，心肌兴奋-收缩耦联是钙致钙释放的过程。具体而言，心肌细胞膜(包括横管)分布着L-型钙通道(LCC)，由LCC流入细胞的Ca2+触发了雷尼丁受体 (ryanodine receptor,RyR)的开放，肌质网释放更多Ca2+产生全细胞的钙瞬变。多数研究认为，心肌肥厚及心衰过程中LCC活性基本不变，但在多数失代偿性心肌肥厚(DHT)及心衰模型中，相同的LCC电流所触发的钙瞬变幅度降低、钙释放速度减缓，表明LCC电流触发RyR 的效率降低。分子间耦联衰退不会影响细胞兴奋收缩耦联能力，只有分子间耦联衰退超出稳定裕度，心衰才会发生。潜性的分子间耦联衰退的发现对早期防治心衰有重要意义。Junctophi Iin蛋白家族是日本科学家hkeshima H等在2000年首次鉴定的，共有四种亚型，其中JP2在心肌和骨骼肌中特异性表达。近年来，对心肌细胞中JP2的研究主要集中在JP2与细胞兴奋收缩耦联的结构和功能上，尚处于起步阶段。在JP2与心衰关系的研究中还有一个重要的尚未解决的科学问题即心衰过程中 JP2表达水平下调的分子调控机制是什么。这种分子机制的揭示可否为心衰的防治提供新的线索呢？目前国内外尚未见调控JP2表达的分子机制的报道。MicroRNA(miRNA)MicroRNAs (miRNA)是一类小的、非编码蛋白的RNA (ncRNA)，它们大约为22个大小左右的核苷酸，在转录或转录后水平调控与其序列部分互补的靶mRNA的翻译或表达。miRNA作为一类小分子，几乎参与了人体一切生命活动的调节和所有疾病的发病过程。随着对miRNA功能广泛而深入的研究，miRNA在机体生理和病理过程中的重要作用，得到越来越多的认识。本文综述近来发现的一个重要miRNA—miRNA-24(在本文中也称为miR-M)的相关研究报道。在人类，miR-24-l和miR-M_2分别被位于九号染色体(9q2》和19号染色体 (19pl3)上的不同基因所编码。miR-M-1和miR-M-2经过Drosha和Dicer等内切酶加工为序列一致的成熟体miRNA。HIiR-M在进化过程中高度保守，不同种属间同源性比较高，并且含量也是比较丰富的，特别在心脏和肺内高表达。根据目前已发表的研究结果，HIiR-M的作用如下1. miR-24促进骨骼肌细胞的分化。(Nucleic Acids Research. 2008. 36. 2690-2699.)2.在新生大鼠心肌细胞过表达miR-M，引起细胞肥大。 (PNAS. 2006. 103. 18255-18260.)3. miR-24 在缺血预适应中表达上调。(Circ. Re s. 2009 ； 104 ；572-575.)4. miR-M在二氢叶酸还原酶基因上作用位点的多态性与甲氨蝶呤耐药的产生有关。(PNAS. 2007. 104. 13513-13518.)5. miR-24在定向造血干细胞终末分化过程中表达上调，使细胞停留在 Gl期与抑制DNA复制，从而抑制细胞的增殖，达到终止分化的效应。(Molecular Cell. 2009. 35. 610-625.)6.miR-M使其靶基因H2AX(其功能是修复断裂的DNA双链)的表达下调，这是不分裂细胞其修复断裂DNA能力比较弱的原因之一。(NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY. 2009. 16. 492-498)7. miR-24与机体的抗病毒感染能力呈正相关。(BBA. 2008. 1779. 628-633)虽然已有文献报道miR-M在心衰时表达上调，但并未明确阐明其是否与JP2直接相关及可能调控机制。此外，由生物信息学分析获得，JP2mRNA的3'非翻译区(3‘ UTR)上可能存在miRNA的结合位点在心血管研究中尚未被提及。本课题首次提出心衰早期重要结构蛋白的变化受miRNA调控的假说具有重要的临床意义；为心衰的早期检测和防治提供线索和理论依据。从目前的研究结果看，关于miR-M功能在心血管方面的研究还处在比较浅显的层面，病理情况下HliR-M上调的机理、作用靶点均未知晓。通过深入研究心血管系统 HliR-M相关的病理机制，可能将有助于我们更加有效的诊断、预防或治疗心血管疾病。
发明内容
本申请将我们的基于Jimctophi 1 in2 (也称JP^的基因治疗技术与现代腺病毒病毒载体靶向输送技术结合起来，从心衰模型开始，研究JP2转基因治疗技术应用于治疗心衰治疗的可行性和关键技术方法。 我们最近的研究利用携带JP2基因的病毒感染心衰大鼠的心肌细胞，测定其细胞膜钙通道与肌质网钙释放通道的分子耦联效率，发现提高JP2的表达可以显著改善心衰细胞分子钙信号耦联的效率；而当我们采用RNA干扰技术敲减正常大鼠心肌细胞JP2的水平时，细胞收缩功能明显受到抑制。因此JP2的表达减少，必然导致细胞膜钙通道与肌质网钙释放通道“脱耦联”，从而导致心肌细胞兴奋收缩耦联效率低下并最终发展为心衰。这些都提示JP2表达水平的下调可能导致心衰的发生。我们的研究还发现肌细胞特异性表达的结构蛋白Jimctophilin2(JP2)的水平与心衰的发生、发展有着密切的关系，并且在心衰的早期即有显著的变化。本发明一方面涉及在心肌细胞中改变JP2蛋白表达的方法，其中所述改变包括上调或者下调，并且所改变的表达例如是至少提高10% JO^JO^i、优选地是45%。所述方法包括步骤给心肌细胞(例如离体的、体内的)施用miR-M的抑制剂或者miR-M或其激动剂，或者将心肌细胞和miR-M的抑制剂或者miR-M或其激动剂接触。在一个优选实施方案中，本发明涉及在心肌细胞中上调(或者提高)JP2蛋白表达的方法，所述方法包括步骤给心肌细胞(例如离体的、体内的)施用HliR-M的抑制剂，或者将心肌细胞和HliR-M的抑制剂接触。优选，所述在心肌细胞中上调(或者提高)JP2蛋白表达的方法在有利于心肌细胞中JP2蛋白表达上调的时间和条件下进行。优选，本发明方法还可以包括检测JP2蛋白的表达。在本文中，所述心肌细胞可以是例如哺乳动物，例如大鼠或者人的心肌细胞。本文所述的心肌细胞可以是例如离体的、或者体内的(动物或人体内的)。在一个优选实施方案中，本文所述的心肌细胞可以是心衰心肌细胞。在本文中，所述的miR-M的抑制剂可以是能够抑制miR-M对靶基因(JP2基因) 的调控作用的任何物质。HiiR-M对靶基因(JP2基因)的调控作用包括抑制靶基因的表达， 例如miR-M对靶mRNA的降解或者抑制其翻译。因此，miR-M的抑制剂可以是在心肌细胞中抑制miR-M表达的物质，也可以是与miRNA具有特异性相互作用，例如与miRNA特异性结合的物质。miR-M的抑制剂例如可以抑制miRNA与DICER或RISC的相互作用。miR-M 的抑制剂优选可以是天然小分子物质，例如，盐酸小檗碱、溴乙锭、氯化两面针碱、或者去氢紫堇碱或者它们中的两种或者多种的组合。miRNA由细胞核中转运出来之后被特异性核酸酶DICER降解，并与 RISC(RNA-induced silencing complex)结合活化，然后引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译。如果往细胞中加入对miRNA具有特异性相互作用的天然化学小分子，那么小分子与 miRNA的结合将影响miRNA与DICER，RISC的相互作用，从而达到抑制miR-M对基因的调控作用。这些对miRNA有潜在抑制作用的小分子包括但不限于盐酸小檗碱、溴乙锭、氯化两面针碱、去氢紫堇碱，其中对miR-M序列双链RNA的亲合力顺序为盐酸小檗碱>溴乙锭> 氯化两面针碱>去氢紫堇碱。在一个优选实施方案中，本发明涉及核酸分子，其具有miR-M在JP基因上的靶点序列，选自SEQ ID NO :4或与SEQ ID NO :4在严紧条件下杂交的序列或与SEQ ID NO :4相比具有1-5个氨基酸的添加、缺失、插入和/或替代的序列。优选地，所述核酸分子在严紧条件下杂交的核酸分子。另一方面，本发明提供了 miR-M的抑制剂在心肌细胞中上调JP2蛋白表达的用途。所述心肌细胞来自例如哺乳动物，例如大鼠，优选地是人。
本发明还提供了 miR-M的抑制剂在制备用于在心肌细胞中上调JP2蛋白表达的制剂中的用途。本发明还提供了 miR-M的抑制剂，其用于在心肌细胞中上调JP2蛋白表达。本发明另一方面涉及所述的miR-M抑制剂在制备改善心肌细胞功能(例如提高心肌细胞的收缩能力或者提供或者改善心肌细胞兴奋-收缩耦联效率)，和/或预防或治疗心衰的药物中的用途。另一方面，本发明提供了上述miR-M抑制剂用于改善心肌细胞功能(例如提高心肌细胞的收缩能力或者提供或者改善心肌细胞兴奋-收缩耦联效率)，和/或预防和治疗心衰的方法。本发明另一方提供了通过检测miR-M的表达来诊断心衰或者患心衰倾向的方法，包括检测受试者样品中的HliR-M的量，并与正常无心血管相关疾病患者的HliR-M的量进行比较。其中，所述受试者样品优选血液。其中，所述受试者包括哺乳动物，优选人。哺乳动物可以是Sprague-Dawley大鼠即SD大鼠。本文所述诊断优选是早期诊断，所述“早期”是指在人心脏收缩功能(左心室射血分数，LVEF)处于正常数值范围(LVEF>50%)，但诊断有运动耐力下降的临床表现的时期； 对于大鼠，所述“早期”是左心室短轴缩短率> 40%，但是诊断出表现出明显的向心性心脏重构的时期。本发明另一方面提供了用于诊断受试者是有心衰或者有心衰倾向的试剂盒，其包含检测HliR-M丰度(或量)的试剂。在本发明的该方面中，所述试剂包括特异性结合 miRNAM的探针(核酸探针)，例如标记的探针。在该方面中，所述诊断优选是早期诊断。其中，所述受试者包括哺乳动物，优选人。另一方面，本发明提供了检测miR-M丰度(或量，即所测样本中miR-M多少)的试剂、检测HliR-M表达水平或者检测HliR-M表达变化水平的试剂在制备用于诊断，优选早期诊断受试者是否患心衰的诊断剂中的用途。在本发明的该方面中，所述试剂包括能够与 HiiR-M特异结合的核酸探针，特异性结合miRNAM的荧光标记探针。其中，所述受试者包括哺乳动物，优选人。本发明另一方面涉及筛选用于预防或治疗心衰的药物的方法，其包括筛选能够在心肌细胞、心脏成纤维细胞中抑制HliR-M表达的抑制剂。优选地，包括将心肌细胞与候选物质(如化合物)接触，检测HliR-M表达，和选择抑制HliR-M表达的物质。另一方面，本发明提供了根据上述方法筛选得到的物质，用于预防或治疗心衰。本发明一方面涉及调控JP2表达的miRNA的筛选。提取miRNA数据库miRbase中收集的人和大鼠已知miRNA序列和相应的JP2 3' UTR序列，利用miRanda、Targetscan等miRNA结合位点预测软件，对JP2 3' UTR上可能存在的miRNA结合位点进行预测，初步提出可能参与调控JP2表达的miRNA，具体包括 miR-24, miRNA96和miRNA343等，并在心衰样品中检测这些miRNA的表达情况。本发明的技术路线参见图1。在本发明的一个实施方式中，JP2基因3 ‘ UTR上miRNA的结合位点将通过软件预测完成。选择在JP2 3' UTR具有两个或更多结合位点的miRNA进行下一步研究。在本发明的另一个实施方式中，检测人和动物的心衰样品(包括人心脏移植术后标本，SD大鼠心室肌标本等)中表达变化的miRNA。在本发明的另一个实施方式中，心衰时表达变化的miRNA 利用Northern blot等方法进行检测。在本发明的另一个实施方式中，miRNA的筛选依据相关的评价指标(如预测 miRNA的总背景得分情况、合计Pct值等)结合心衰miRNA表达谱的变化初步筛选，设计体内外实验进一步筛选。本发明另一方面涉及确立可能参与JP2负性调控的miRNA。我们前期的预实验结果提示miR-M在JP2基因的3' UTR区存在2个结合位点， 提示HiiR-M可能参与JP2的表达调控。因此本课题将首先验证和阐明HiiR-M对JP2表达的调控作用。研究方法实验分为细胞实验和动物实验两大部分。技术路线参见图2。在本发明的一个实施方式中，采用升主动脉结扎技术建立压力负荷诱导的心衰大鼠模型；在本发明的另一个实施方式中，利用Northern blot和real-timePCR等方法检测 miR-24的表达情况；在本发明的另一个实施方式中，采用Wfestern blot和real-timePCR等方法检测 JP2的表达情况；在本发明的另一个实施方式中，利用电镜方法检测心肌细胞亚细胞水平的超微结构变化；在本发明的另一个实施方式中，利用激光共聚焦显微镜和膜片钳技术检测心肌细胞功能；在本发明的另一个实施方式中，构建JP2 3' UTR荧光素酶报告基因质粒及与 miR-24共转染于HEK-293细胞，检测JP2 3 ‘ UTR是否存在miR-M的结合位点；在本发明的另一个实施方式中，干扰miR-M与作用靶点的结合和过表达miR-M 技术分别构建含有antisense miR-M和miR-M编码基因的质粒，以病毒(腺病毒、慢病毒)为载体导入大鼠体内或者心肌细胞之中，确定JP2的表达情况。本发明另一方面涉及miR-M的变化规律在心衰检测中的重要作用。我们在前期的研究中发现分子水平兴奋收缩耦联的时间在心衰样品中显著延长， 因此可以利用它检测心衰前期心脏的功能异常。但是鉴于JP2基因在心脏特异表达，取材和检测有一定的困难，由此若能根据miRNA的变化规律检测心衰的发展，将更具有临床意义。我们将从已经建立的临床数据库中，选取500例初诊时具有心衰潜在危险因素(高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化)，但是缺乏明确心衰症状的患者和无心血管相关疾病患者的资料，测定血浆中miRNA水平和心功能，并设计双盲方法随访检测上述数据的可靠性和随病程变化上述数据的波动；通过对这些数据的深入分析，阐明miRNA的动态变化在心衰检测中的重要意义。研究方法分析miR-M等待检miNA的表达变化与心功能的联系。技术路线参见图3。在本发明的另一个实施方式中，利用高通量试剂盒结合PCR技术检测血液中的 miRNA。
发明的有益效果本发明在生物信息学预测分析的基础上，提出了 miR-M调控JP2的分子机制，确立了心衰中HiiR-M与JP2下调的直接关系，在分子水平阐明了新的参与心衰早期病理改变的重要机制，为心衰的早期特异性诊断和早期防治提供了新的线索。
图1 显示用于筛选调控JP2表达的miRNA的技术路线。图2 显示用于确立可能参与JP2负性调控的miRNA的技术路线。图3 显示用于miRNA变化与心功能关联分析的技术路线。图4 显示心衰大鼠左心室肌内miR-M的Nothern Blot实验。a. CHT为处于代偿期心力衰竭大鼠左室肌的组织，与对照组(Control)相比，miR-M表达明显上调，η = 7只， ***Ρ < 0. 001。b. DHT为处于是代偿期心力衰竭大鼠左室肌的组织，与对照组相比，miR-M 表达亦上调，η = 5只，**Ρ < 0. 01。rRNA为内参。图5 显示心衰大鼠左心室肌内miR-M表达的Real-time PCR实验。CHT为处于代偿期心力衰竭大鼠左室肌的组织，DHT为处于是代偿期心力衰竭大鼠左室肌的组织，与对照组(Control)相比，miR-24 表达上调，η = 4-6 只，***P < 0. 001，*P < 0. 05vs Control。图6 显示心衰患者左心室肌内miR-M表达的Nothern Blot实验。正常(Normal) 组为非心源性脑卒中心脏捐助者的心肌组织，心衰(HF)组为心脏移植术后心衰心肌组织， HF组miR-M的表达较Normal组增高，例数=5例。图7 显示心衰患者左心室肌内miR-M表达的Real-time PCR实验。正常 (Normal)组为非心源性脑卒中心脏捐助者的心肌组织，心衰(HF)组为心脏移植术后心衰心肌组织，HF组miR-24的表达较Normal组增高，**P < 0. 01，例数=4-6例。图8 显示心衰大鼠左心室肌内JP2表达分析。A 为westernblot方法检测到在心衰大鼠(HF)左心室内JP2表达较对照组的正常大鼠(Normal)明显减少。#*P<0.001，n =6。B 为Real-time PCR方法检测到HF组JP2的mRNA表达亦下调。< 0. 01，n = 6图9 显示心衰患者心室肌内JP2表达分析。A 为westernblot方法检测到在心衰患者(HF)左心室内JP2表达较对照组的正常人(Normal)明显减少。*P < 0. 001，η = 5-7。B 为Real-time PCR方法检测到HF组JP2的mRNA表达亦下调。< 0. 01, η = 5-7。图10 显示HEK-293细胞中miR-M对JP2调控的萤光素酶活性实验。Control miRNA :miR-24的阴性对照序列；Iuci 含有JP 23’ UTR的荧光素酶报告基因质粒； luci-ml 将miR-M在JP2 3’ UTR第一个可能结合的靶序列突变后的荧光素酶报告基因质粒；luci-m2 将miR-M在JP2 3’ UTR第二个可能结合的靶序列突变后的荧光素酶报告基因质粒；luci-m3 将miR-M在JP2 3’ UTR可能结合的两段靶序列同时突变后的荧光素酶报告基因质粒。将miR-M与Iuci共转染于HEK-293细胞后，萤光素酶的活性较Control miRNA+luci组明显受抑制，而将miR-M在JP2 3’ UTR上可能结合的两段靶序列同时突变后，miR-M对萤光素酶的抑制作用消失了，说明JP2 3’UTR上的两段靶序列是miR-M的结合序列。**P < 0. 01，##P < 0· 01。图11 显示过表达miR-M (慢病毒载体)下调新生大鼠心肌细胞的JP2水平。新生大鼠心肌细胞感染表达miR-M的慢病毒，MOI = 10，感染48h。A, a为病毒感染细胞情况，b为心肌细胞感染病毒后，通过real-time PCR方法，检测到的miR-M过表达的倍数， *P<0. 05。B，a过表达miR-M后，通过Wfestern blot方法检测到JP2蛋白表达下调，b通过 real-time PCR 方法检测到 JP2 mRNA 表达下调，< 0. 01，*#P < 0. 001，例数=3。图12 显示携带JP 2的腺病毒感染心衰的大鼠心肌细胞后改善心肌细胞内的钙致钙释放状态。A，构建表达JP2基因的病毒。将携带JP2的腺病毒感染心衰的大鼠心肌细胞后，细胞内JP2的表达水平上调。耦联潜伏期(Latency interval)是衡量L-型钙通道分子(L-type calcium trannel)与兰尼丁受体分子(Ryanoidin receptor)间耦联效率 (calcium-induced calcium efficiency)的指标，这一腺病毒感染方法将改善心肌细胞内的钙致钙释放状态，恢复心肌细胞的正常功能。图A和B的数据来自大鼠的心肌细胞，考虑到大鼠与人的基因相似性，此结果可能也适用于人类。图B中，图例上方显示的是一个典型的钙火花图像(上)和时间曲线(下)。耦联潜伏期(latency)指的是从钙小星起始时间到触发钙火花发生之间的时间差。图例下方测量耦联潜伏期，JP-2组的潜伏期显著短于 GFP 组(P < 0. 05)。图13 小分子干扰miRNA示意图，小分子(drug moleculars)与miRNA特异性结合后影响miRNA的成熟进而影响miRNA对靶基因的调控作用。
14 g miRBase MiM^ (http//microrna. sanger. ac. uk/)白勺 miR-24 白勺前体序列(pre-miRNAM)，以及我们研究选取的部分序列一rnoM-a(miR-24)序列和 rno24-a (miR-24)的质谱。图15 :rn0M-a序列与小分子结合的质谱图，分别为盐酸小檗碱，绿化两面针碱， 其中小分子与RNA的浓度比为4 1, m/z 1679. 5为双链RNA峰。m/z 1713.4,1780.6, 1847. 0 为[d+P]5-，[d+2P]5-和[d+2P]5_，m/z 1747. 2，1813. 5 为[D+P]5_ 和[D+2P]5_。 对rn024-a序列双链RNA，其亲合力顺序为盐酸小檗碱>溴乙锭>氯化两面针碱>去氢紫堇碱。图16 压力负荷模型大鼠左心室舒张期后壁厚度(PWD)以及短轴缩短率(FS % ) 的变化。与假手术组(Control)相比，代偿性肥厚组(CHT)与失代偿性肥厚组(DHT)的 PffD均增厚，FS%只在DHT期明显下降，即收缩功能降低了。_P < 0. 001，< 0. Olvs Control, η = 4-11 只。图17:在JP2 3' UTR上具有两个或两个以上预测结合位点的miRNA(以大鼠基因为例)。在JP2 3，UTR第583-589个碱基和第675-681个碱基，分别存在与miR-24第2-8 个碱基互补的碱基序列(白色标记部分)，这提示miR-M可能通过与JP2 3’UTR的这些互补碱基结合，从而使JP2的表达下调。图18 显示JP2基因转染后，细胞的钙瞬变幅度及耦联效率。图 19 萤光素酶报告基因质粒 pMIR-REPORT Luciferase (ABI，AM5795)。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例1
参与调控JP2表达的miRNA的生物信息学预测和分析利用miRanda、TargetScan等软件对人和大鼠JP2基因的3'非翻译区(3‘ UTR) 中可能存在的已知miRNA的结合位点进行了生物信息学预测，从中筛选出在JP2 3' UTR 上具有两个或两个以上预测结合位点的miRNA(以大鼠基因为例)，如图17所示(来自 TargetScan软件的预测)，白色区域表示miR-M与JP2 3' UTR可能的结合位点，rno表示来自于大鼠，下同)。实施例2心衰大鼠和人的心肌细胞中miR-M的表达分析(1)大鼠心衰模型的建立为阐明心衰状态下miR-24的变化，我们通过对约50g重的雄性Sprauge Dawley(SD)大鼠进行升主动脉结扎手术，建立了压力负荷的心衰动物模型，方法如下动物在麻醉状态开胸，将内径0. 9mm的银夹置于主动脉根部2-3mm处；假手术组(sham)进行同样的手术处理，但并不放置银夹。术后7-11周，检测大鼠心脏的血流动力学及超声参数。 血流动力学指标的测定方法动物麻醉后(5%三溴乙醇腹腔注射，剂量250mg/kg体重)， 将其固定于恒温加热板上。取颈部右侧旁正中切口，分离皮下组织及胸锁乳突肌，暴露并分离右侧颈总动脉。将一端与多导生理记录仪(Biopac Systems)连接的2. OF Millar导管经右侧颈总动脉逆行插入左心室，稳定后记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP) > 左 Jll、室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)、收缩期左心室压力上升最大速率(maximum rate of rise of left ventricular pressure, +dp/dt max)禾口舒张期左^[>室压；0下P華最大速率(maximum rate of degression of left ventricular, -dp/dt min)。计算以左室内压校正的左室内压力下降最大速度-dp/dt min/LVSP。然后将导管从左室退出到升主动脉，稳定后记录主动脉内收缩压 (systolic blood pressure, SBP)、主动脉内舒张压(dias tolic blood pressure,DBP)。超声参数的检测方法如下采用 Vevo770ultrasound system (Visual Sonics Inc，Toronto， Canada)小动物超声仪，探头频率为17. 5MHz。探测深度2cm，扫描速度100mm/S大鼠吸入 4% 5%异氟烷(C3H2CIF50)基础麻醉后刮去胸前体毛，仰卧位固定于恒温加热板上，持续吸入2. 5%异氟烷，四肢与心电图电极相连用于监测心率并记录心电图，各参数连续测量 5个心动周期，计算均值。结果提示心衰组的左心室显著增厚但收缩指标(FS%)显著降低 (图16)。我们分别收取了 Sham(ControI)及心衰组(CHT 心衰代偿期，DHT 心衰失代偿期) 的心脏标本，进行 Northern blots 实验，探针序列为 5，-AATTCTGAGTGTGTCTGAGCCT_3，(SEQ ID NO :1)，5，端进行32P标记和real-time PCR, real-time PCR使用ABI公司试剂盒，其中
舌 Taqman microRNA assays (^^· :4427975, miR-24 :4373072, u6 :4395470X1)，Taqman universal PCR master:4324018), Taqman microRNARTkit ( Mj^ :4366596),
反应条件依照试剂盒说明书进行。检测到miR-M在CHT及DHT组大鼠较假手术组(即 control)表达增多(见图4和图5)。(2)心衰患者左心室肌中miR-M的表达分析根据上述(1)中的方法，在心衰患者左心室肌(细胞)中进行miR-M的表达分析。 检测到HiiR-M在CHT及DHT组较正常组(即control)表达增多，结果见图6，7实施例3
心衰大鼠和人的心室肌中JP2的表达分析。分别通过^festern blot和Real-time PCR方法检测JP2在蛋白和基因水平的变化。Western blot 采用10%的聚丙烯酰胺分离胶，每个样品50ug蛋白，电压为80v，待溴酚兰菊分离胶下缘1厘米，停止电泳。使用的是硝酸纤维素膜，转膜时间条件为200mA，2小时。JP2抗体由北京奥维亚生物技术有限公司合成纯化而成，抗体浓度为lug/ul，由2%的 BSA(牛血清白蛋白)稀释而成。先用5%牛奶室温封闭1小时，再用稀释好的JP2抗体孵育硝酸纤维素膜，4摄氏度，过夜。第二天采用TBST洗膜，320转，十分钟换液一次，采用山羊抗兔的辣根过氧化物酶标记二抗(中杉金桥，ZB2301)，稀释度1 5000，再次孵育1小时， 室温，240转。再次洗膜，条件同上。洗好膜后进行显影，将膜置于300ul反应液(150ul A 液，150ul B液，Thermo，Supersignal West Pico，Prod#1862420，1862421.)室温孵育 5min， 缓慢轻摇，将膜上液滴滴尽后封入保鲜膜，压入X光片曝光(曝光时间视信号强弱而定)。 Real-time PCR :JP2 (大鼠)引物序列上游5，_AGGCGGGTGCCAAGAAGAAG_3，(SEQ ID NO 2)； 下游 5，-CGATGTTCAGCAGGATCA(SEQ ID NO :；3)。GAPDH(大鼠)5，_ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA_3 ‘(SEQ ID NO 4) ；5，-AAGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3' (SEQ ID NO :5)。反应条件为预变性 950C 5min，变性94°C 30s，退火62°C 30s，延伸72°C 30s，30个循环。JP2 (人)引物序列上游 5，-ATGGGCTGGGCATAGAGAC-3，(SEQ ID NO :6)，下游 5，-TTGAAGCCATGTGTCCACTC-3，(SEQ ID NO :7)。GAPDH (人)上游 5，-AGCTGAACGGGAAGCTCACT-3，(SEQ ID NO 8)，下游 5，-TAGG TCCACCACTGACACGTTG-3，(SEQ ID NO 9)。反应条件为预变性 95°C lOmin，变性 95°C 15s 退火、延伸 60°C lmin，40 个循环。采用的仪器为 Eppendorf-Mastercycler 印 realplex, Germany，检测荧光信号，反应条件为预变性95°C 5min，变性94°C 30s，退火62°C 30s，延伸 72°C30s，30个循环。GAPDH作为内参进行校正。计算方法采用2_Δ 相对定量法对JP2的表达进行定量。结果见图8和图9，心衰患者心肌JP2表达下调。实施例4miR-24可能参与了 JP2的调控构建包含各个miR-M结合位点以及结合位点引入突变的JP23’ UTR构建萤光素酶报告基因质粒，所用质粒为PMI R-REP0RT Luc if erase (ABI, AM5795)(见图19)，插入的片段(即 JP2 3’ UTR)序列为GAGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGTCATCCCCTAGGACCAGTAGTGGG GGAGACCTGAGCATCTGAGCCTTTGGCTGGGAAGCCACCTAAAGGGGTCTGGGGTGGGGTGGAGAAGGTTAGGCATG TTGGTGATGGCCCCTAATTCTGAGTGTGTCTGAGCCTGAGGCAGGAAGCTT(SEQ ID NO :10)，内切酶使用 HindIII (NEB公司，识别序列AAGCTT)和Mel (NEB公司，识别序列GAGCTC)，突变位点为划线的碱基GAG，将其突变为CTC。为观察miR-M是否调控JP2的表达，构建萤光素酶报告基因质粒，进行荧光素酶报告基因试验。具体过程如下以SD大鼠基因组DNA为模板，进行PCR，引物序列为sense 5，-AGAGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGT-3’ (SEQ ID NO :11)，antisense 5’ -TAAGCTTCCTGCC TCAGGCTCAGACAC-3，(SEQ ID NO : 12)，反应条件为预变性 94°C 5min，变性 94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸72°C 30s，35个循环。产物为含有miR-M潜在作用靶序列的JP2 3，UTR(G AGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGTCATCCCCTAGGACCAGTAGTGGGGGAGACCTGAGCATCTGAGCCTTTGGCT GGGAAGCCACCTAAAGGGGTCTGGGGTGGGGTGGAGAAGGTTAGGCATGTTGGTGATGGCCCCTAATTCTGAGTGT GTCTGAGCCTGAGGCAGGAAGCTT)，之后切胶回收此目的片段，将其连接到T载体(GeneMar，T168-101，)，测序正确后将此片段从T载体切下，切胶回收后连接到pMIR-REPORT Luciferase载体上面，经测序正确后，将其与化学合成的成熟miR-M共转染到Human Embryonic Kidney-293 (HEK-293)细胞(上海沪峰化工有限公司，编号CRL-1573)，通过双荧光素酶检测仪(promega, Dual-Luciferase Reporter Assay System, cat#E1960),检测发现miR-M能够抑制荧光素酶活性。进一步将miR-M的潜在作用靶点进行突变(突变后的序列是GAGCTCTCCTCCAACCAGTCCAGTTGTCATCCCCTAGGACCAGTAGTGGGGGAGACCTGAGCATCT CTCCCTTTGGCTGGGAAGCCACCTAAAGGGGTCTGGGGTGGGGTGGAGAAGGTTAGGCATGTTGGTGATGGCCCCTA ATTCTGAGTGTGTCTCTCCCTGAGGCAGGAAGCTT) (SEQ ID NO :13)，可以发现将两段靴序列同时突变时，miR-24抑制作用消失，这说明JP2很可能受miR-M直接调控。具体变化见图10。实施例5过表达miR-M下调新生SD大鼠心肌细胞中JP2水平。将新生SD大鼠心肌细胞分离下来后，接种到6孔板中，每孔约1. 2x106个细胞及Iml培养液，3 后更换新鲜培养液一次，所述培养液为含10%胎牛血清的DMEM，然后加入表达pri-miRM(miR24的前体)的慢病毒(吉凯基因慢病毒载体系统由pGC_LV 载体、pHelper 1. 0载体和pHelper 2. 0载体三质粒组成。pGC-LV载体中含有HIV的基本元件5，LTR和3，LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对 pGC-LV 载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNA干扰等研究。pHelper 1. 0载体中含有 HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因， 编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2. 0载体中含有单纯疱疹病毒来源的 VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。)，M0I = 10，继续培养后，根据本领域已知的方法收集细胞并提取总蛋白和RNA。对所提取的总蛋白和RNA分别进行Western blot 实验和real-time PCR实验(请说明所用抗体、PCR引物等重要试剂和试剂盒名称PCR试剂 ^ =TransGen Biotech, Code#AQ101_03， TranStart Green qPCR Supermix) 。 JP2 $ 蛋白水平和mRNA水平的变化，同时也检测成熟miR-M的过表达情况。结果见图11。结果显示，过表达miR-M可以下调新生SD大鼠心肌细胞中JP2水平。实施例6miRNA对心衰心肌细胞超微结构的影响为阐明心衰状态下兴奋-收缩耦联的微观变化，我们通过主动脉结扎手术建立了压力负荷的心衰动物模型(SD大鼠)。动物在麻醉状态开胸，将内径0.9mm的银夹置于主动脉根部2-3mm处；假手术组进行同样的手术处理，但并不放置银夹。术后7_11周，检测大鼠心脏的血流动力学及超声参数(PLoS Biol. 2007，5:203-211.)。结果提示假手术组收缩参数指标(FS%=49.6±5. 75% )正常；心衰组的左心室显著增厚(心衰组PWD = 2. 53士0. 14mm，假手术组 PWD = 1.99士0.32mm)但收缩指标(FS % = 30. 72士2. 10% )降低。为鉴定JP2基因转染干预细胞兴奋-收缩耦联功能，即腺病毒载体(何种载体，来源)介导的大鼠JP2基因过表达对培养大鼠心肌细胞兴奋-收缩耦联功能的影响，我们通过酶解方法分离培养心室肌细胞，病毒转染后用全细胞膜片钳将细胞去极化到OmV并持续 300ms，结合激光共聚焦线扫描成像同步记录LCC钙电流及胞内钙瞬变。在本实施例中，采用全细胞膜片钳配合激光共聚焦显微镜钙信号同步记录的方法进行功能测定，将细胞钳制在-70mV，并依次给予从_70mV至+70mV的阶跃刺激，记录此时细胞的钙电流大小。同时， 结合激光共聚焦先扫描技术，我们以7. 68ms每道的速度采集细胞内钙瞬变信号。最后将不同去极化电位下的电流和钙荧光信号进行分析。在心衰细胞中，钙电流密度没有变化，钙瞬变幅度显著降低，因而兴奋-收缩耦联效率(钙瞬变与钙电流的比值)显著降低。相比之下，JP2基因转染组细胞的钙瞬变幅度及耦联效率都没有变化。这说明，JP2基因转染干预方法可以成功影响细胞的功能。具体数据参见图18 对照组细胞和JP2过表达的心衰组细胞钙瞬变幅度之间无显著差异，而(没有JP2处理的)心衰组细胞的钙瞬变幅度大大降低。 由于钙电流密度变化不大，因此其兴奋收缩耦联效率也是(没有JP2处理的)心衰组细胞明显低于对照组和JP2过表达组。心衰动物模型大鼠在体注射慢病毒和腺病毒载体携带的JP2基因我们扩增出大鼠JP2基因的编码区共2079bp，并将其分别插入带有荧光标记的腺病毒载体 pADeasy-CMV-CMV-GFP(来源)以及慢病毒载体 PII3· [CMV-IRES-tdTOMATA(来源)中， 并分别进行病毒包装扩增和纯化，最后鉴定滴度为腺病毒大于l*10~12pfU，慢病毒大于 l*10~9pfu，如上所述分离原代成年大鼠心肌细胞后测定心肌细胞的钙信号，结果提示JP2 病毒转染组，LCC-RyR分子耦联效率显著高于未转染病毒的细胞和转染GFP对照病毒的细胞。上述结果表明JP2的表达增强了心衰细胞LCC-RyR分子耦联效率。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
权利要求
1.在心肌细胞中上调JP2蛋白表达(例如至少提高10%、20%、30%、优选地45%、 60% )的方法，包括步骤给心肌细胞(例如离体的、或体内的)施用miR-M的抑制剂，或者将心肌细胞和miR-24的抑制剂接触。
2.miR-24的抑制剂在心肌细胞中上调JP2蛋白表达的用途。
3.miR-24的抑制剂在制备用于在心肌细胞中上调JP2蛋白表达的制剂中的用途。
4.miR-24的抑制剂，用于在心肌细胞中上调JP2蛋白表达。
5.改善心肌细胞功能，和/或预防或治疗心衰的方法，包括给心肌细胞(例如离体的、 或体内的)施用HliR-M的抑制剂，或者将心肌细胞和HliR-M的抑制剂接触。
6.miR-24抑制剂在制备改善心肌细胞功能(例如提高心肌细胞的收缩能力或者提高， 或者改善心肌细胞兴奋-收缩耦联效率，或者改善心肌细胞内的钙致钙释放状态)，和/或预防或治疗心衰的药物中的用途。
7.miR-24抑制剂用于改善心肌细胞功能，和/或预防或治疗心衰的用途。
8.miR-24抑制剂，用于改善心肌细胞功能，和/或预防或治疗心衰。
9 通过检测miR-M的表达来诊断心衰或患心衰倾向的方法，包括检测受试者样品(优选血液)中的HliR-M的量或丰度，并与正常无心血管相关疾病患者的HliR-M的量进行比较，所述诊断优选是早期诊断。
10.用于(优选早期)诊断受试者(包括哺乳动物，优选人)是否患心衰或患心衰倾向的试剂盒，其包含检测HliR-M丰度(或量)的试剂，所述试剂包括例如特异性结合 miRNA24的探针(核酸探针)，例如标记的(优选荧光标记的)探针。
11.检测miR-M丰度(或量)的试剂在制备用于(优选早期)诊断受试者是否患心衰或者有患心衰倾向的诊断剂中的用途。
12.筛选用于预防或治疗心衰的药物的方法，其包括筛选能够在(离体或者体内如实验动物中的)心肌细胞、心脏成纤维细胞中抑制miR-M表达的抑制剂。优选地，包括将心肌细胞与候选物质(如化合物)接触，检测miR-M表达，和选择抑制miR-M表达的物质。
13.权利要求12筛选得到的物质，用于预防或治疗心衰。
14.筛选用于预防和治疗心衰的药物的方法，其包括利用miRNA结合位点预测软件，对 JP23' UTR上可能存在的miRNA结合位点进行预测，提出可能参与调控JP2表达的miRNA， 并在心衰样品中检测这些miRNA的表达情况，以及针对验证得到的miRNA设计反义miRNA。
15.以上任何一项权利要求的主题，其中，所述的miR-M的抑制剂可以是能够抑制 miR-M对靶基因(JP2基因)的调控作用的任何物质，可以是在心肌细胞中抑制miR-M表达的物质，也可以是与miRNA具有特异性相互作用，例如与miRNA特异性结合的物质，或者抑制miRNA与DICER或RISC的相互作用的物质，miR-24的抑制剂优选可以是天然小分子物质，例如，盐酸小檗碱、溴乙锭、氯化两面针碱、或者去氢紫堇碱或者它们中的两种或者多种的组合。
16.核酸分子，其包含或具有miR-M在JP基因上的靶点序列，或者由miR-M在JP基因上的靶点序列构成，所述靶点序列选自(a)SEQ ID NO 10、14、15 或；或(b)(a)的互补序列；或(c)(a)或(b)的对应RNA序列；或(d)与(a)、(b)或(c)在严紧条件下杂交的序列或与(a)、(b)或(c)相比具有1-5个 (例如1-3个，1-2个，或1个)氨基酸的添加、缺失、插入和/或替代的序列。
17.与权利要求16的核酸分子在严紧条件(优选高严紧条件)下杂交的核酸分子(可以是DNA或者RNA)。
18.核酸，其序列选自或者其包含如下序列(a)SEQ ID NO :1-17 ；或(b)(a)的互补序列；或(c)(a)或(b)的对应RNA序列；或(d)与(a)、(b)或(c)在严紧条件下杂交的序列或与(a)、(b)或(c)相比具有1-5个 (例如1-3个，1-2个，或1个)氨基酸的添加、缺失、插入和/或替代的序列。
全文摘要
本发明基于JP2的基因治疗技术与现代腺病毒病毒载体靶向输送技术结合起来，从心衰模型开始，研究JP2转基因治疗技术应用于治疗心衰治疗的可行性和关键技术方法。本发明还提供了miR-24的抑制剂，及其在制备用于在心肌细胞中上调JP2蛋白表达、改善心肌细胞功能、和/或预防或治疗心衰的药物中的用途。本发明还提供了用于诊断受试者是否患心衰的试剂盒，其包含检测miR-24丰度(或量)的试剂。
文档编号G06F19/16GK102242080SQ20111012958
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月12日 优先权日2010年5月13日
发明者徐 明, 李素芳, 王世强, 王猛, 王秀杰, 骆观正 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京大学第三医院