专利名称：蛋白质结晶设备与蛋白质结晶方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质结晶设备与蛋白质结晶方法。
背景技术：
在蛋白质结构分析中用于生长蛋白质晶体的技术是非常重要的。可通过使用象X-射线衍射这样的分析方法来识别蛋白质晶体结构。蛋白质晶体结构识别对于包含有蛋白质晶体在内的药物的开发是必不可少的。
作为结晶蛋白质的方法，静止条件下的结晶蛋白质方法是已知的(静止条件下批量处理方法、液-液(自由边界的)扩散方法、小量分离方法等等)。在通过降低蛋白质溶解度从而结晶蛋白质的方法中，将蛋白质溶液和包含沉淀剂的缓冲溶液封闭在同一容器中。当沉淀剂扩散进入蛋白质溶液时，蛋白质溶解度降低从而使蛋白质结晶。
但是，在静止条件下的通过降低蛋白质溶解度从而结晶蛋白质的传统方法中，难以生长出各向同性的蛋白质晶体。
而且，该蛋白质结晶过程的晶体生长速度缓慢。由于这个原因，生长蛋白质晶体需要很长时间。这是妨碍提高蛋白质结构分析效率的一个因素。
和上述描述一道，在日本公开的专利申请(JP-A-平成6-321700)中披露了一种蛋白质结晶方法。在传统的蛋白质结晶方法中，如图1所示将包含蛋白质的蛋白质凝胶105、包含沉淀剂的沉淀剂凝胶106、以及只包含缓冲溶液的缓冲溶液凝胶107放入容器101中。这样，在传统的蛋白质结晶方法中凝胶用于提供蛋白质晶体生长所必需的材料。在上述参考资料中描述指出使用凝胶的目的是为了使流体对流运动尽可能小。在容器101中，形成为夹层结构，其中沉淀剂凝胶106、缓冲溶液凝胶107、蛋白质凝胶105、缓冲溶液凝胶107、以及沉淀剂凝胶106依次分层放置。在蛋白质晶体生长期间容器101上下来回地翻转。在传统的蛋白质结晶方法中，沉淀剂凝胶106包含的沉淀剂通过缓冲溶液凝胶107而扩散进入蛋白质凝胶105。本发明不需要凝胶化而且是从与传统的蛋白质结晶方法根本不同的技术。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种蛋白质结晶技术，可以更加各向同性地生长蛋白质晶体。
本发明的另一个目的是提供一种蛋白质结晶工艺，可以促进蛋白质晶体的生长。
在蛋白质晶体化设备中包括容器支承部分和旋转部件。容器以可拆卸方式固定在容器支承部分上。旋转部件绕着第一与第二旋转轴旋转容器支承部分。容器中包含有蛋白质溶液且在容器支承部分旋转期间生长蛋白质晶体。
旋转部件可包括第一旋转部件，其绕着第一旋转轴旋转容器；以及第二旋转部件，其绕着第二旋转轴旋转第一旋转部件。在这种情况下，第一旋转部件可包括内框架，其支承容器支承部分；以及第一电动机，其旋转内框架。还有，第二旋转部件可包括外框架，其上安装有第一旋转部件；以及第二电动机，其旋转第一旋转部件。
旋转部件旋转容器支承部分符合下面的微分方程(1)，φ.=A|sinφ|]]>θ.=B|sinφ|-----(1)]]>其中φ是与第一旋转轴垂直的预设方向和外框架之间的角度，而θ是与第二旋转轴垂直的预设方向和内框架之间的角度，而A与B以如下方式选择2m/n(m与n都是正整数)不是一个整数，使n与m取最小值以符合A∶B＝n∶m的关系。
而且，理想的状况是旋转部件旋转容器支承部分使得施加到容器上的重力各向同性。
而且，该容器可包括具有开口的容器部分；用于密封容器部分开口的密封部分；吸收件，其设置在容器部分中且其中吸收了沉淀剂溶液；以及扣形件(a button)，其设置在容器部分中远离吸收件，用以保持蛋白质溶液。沉淀剂由吸收件蒸发而扩散进入容器部分内部。蛋白质溶液吸收沉淀剂从而沉淀产生蛋白质晶体。
在本发明的另一个方面，蛋白质结晶方法是通过如下步骤来实施的(a)提供容器给容器支承部分；(b)绕着第一与第二旋转轴旋转容器支承部分；以及(c)在容器支承部分旋转期间生长蛋白质晶体，其中容器包含有蛋白质溶液。
可以通过如下方式实施(b)旋转步骤绕着第一旋转轴旋转容器；且绕着第二旋转轴旋转第一旋转部件。
还有，(b)旋转步骤可以通过旋转容器支承部分来实施，所述旋转符合下面的微分方程(1)，φ.=A|sinφ|]]>θ.=B|sinφ|-----(1)]]>其中φ是关于第一旋转轴的旋转角度，而θ是关于第二旋转轴的旋转角度，而A与B以如下方式选择2m/n(m与n都是正整数)不是一个整数，使n与m取最小值以符合A∶B＝n∶m的关系。
而且，(b)旋转步骤可以通过旋转容器支承部分来实施以使得重力各向同性地施加到容器上。
而且，蛋白质结晶方法还可包括提供容器。该容器包括具有开口的容器部分；用于密封容器部分开口的密封部分；吸收件，其设置在容器部分中且其中吸收了沉淀剂溶液；以及扣形件，其设置在容器部分中远离吸收件，用以保持蛋白质溶液。沉淀剂由吸收件蒸发而扩散进入容器部分内部。(d)生长步骤可通过如下方式实施由吸收件对沉淀剂蒸发；蛋白质溶液吸收沉淀剂；以及沉淀产生蛋白质晶体。
图1显示了传统的蛋白质结晶方法；图2显示了依照本发明实施例的蛋白质结晶设备；图3A与3B显示了容器的构造；图4A是在容器旋转条件下生长的溶菌酶晶体表面观察图片，而图4B是在容器不旋转条件下生长的溶菌酶晶体表面观察图片；以及图5是显示容器旋转生长得到的溶菌酶晶体与容器不旋转生长得到的溶菌酶晶体之间特征差异的表格。
具体实施例方式
在下文中，将结合附图详细描述依照本发明实施例的蛋白质结晶设备。
图2显示了依照本发明实施例的蛋白质结晶设备。蛋白质结晶设备由三维回转器1与容器2组成。蛋白质晶体生长在容器2中。
三维回转器1包括主部件3、电动机4、外框架5、电动机6、内框架7以及容器支承部分8。主部件3包括底部3a以及支架3b与3c。支架3b和3c与底部3a连在一起。电动机4设置在支架3b。外框架5与电动机4连在一起。电动机4具有旋转轴4a从而旋转外框架5。电动机6设置在外框架5。内框架7与电动机6连在一起。电动机6具有旋转轴6a从而旋转内框架7。旋转轴6a实质上垂直于旋转轴4a。
容器支承部分8与内框架7连在一起。容器支承部分8与内框架7同时旋转。容器支承部分8支承着上述的容器2。当外框架5与内框架7分别旋转时，该容器的旋转具有两个旋转轴。同时，容器2位于旋转轴4a与旋转轴6a的交点附近。
图3A与3B显示了容器2的构造。图3A是容器2的垂直横断面视图，而图3B是容器2的沿着图3A中A-A′线的横断面视图。容器2包括容器主部件21、扣形件22以及密封件23。
如图3A所示，在扣形件22的上表面设置空腔22a。将其中溶解了蛋白质的少量蛋白质溶液注入空腔22a。该蛋白质溶液的量典型地为20μl。使用的蛋白质溶液具有流动性。注入空腔22a的蛋白质溶液在表面张力作用下保持在空腔22a中。因此，即使旋转容器2，蛋白质溶液也不会从空腔22a中溢流出去。这样，用于支承蛋白质溶液的机构大大简化了。而且，如图3B所示，在扣形件22上设置间隙22b，从扣形件22的上表面贯穿至其下表面。
纤维素纤维24放在容器主部件21的内部。纤维素纤维24吸入了溶解了沉淀剂的沉淀剂溶液。只有一部分被吸收进入纤维素纤维24的沉淀剂经过间隙22b蒸发且扩散进入放置在空腔22a中的蛋白质溶液。当沉淀剂扩散进入蛋白质溶液时，蛋白质的溶解度下降从而从蛋白质溶液中结晶出蛋白质。
纤维素纤维24吸入了沉淀剂溶液因此当容器2旋转时沉淀剂溶液不会渗流出来。这就防止了沉淀剂溶液与注入空腔22a中的蛋白质溶液在容器2旋转时接触。
开口21a设置在容器主部件21。蛋白质溶液与沉淀剂溶液由开口21a注入容器2。密封件23密封开口21a从而使容器2内部保持密封状态。
下面，将描述蛋白质晶体的生长步骤。
首先，将蛋白质溶液与沉淀剂溶液注入容器2。蛋白质溶液注入在上述的空腔22a中。而且，沉淀剂溶液被吸收进入纤维素纤维24中。然后，用密封件23封住开口21a从而密封容器2。然后，将容器2装入容器支承部分8。
之后，电动机4与电动机6分别旋转外框架5与内框架7。容器2的旋转具有两个旋转轴。在容器2的旋转期间，沉淀剂在容器2中蒸发。蒸发的沉淀剂通过设置在扣形件22上的间隙22b扩散进入被注入在空腔22a中的蛋白质溶液。当沉淀剂扩散进入蛋白质溶液时，蛋白质在蛋白质溶液中的溶解度降低从而产生蛋白质结晶。这个时候，因为容器2在蛋白质结晶化期间处于旋转状态，所以蛋白质晶体各向同性地生长。
下面的两个理由可以解释为什么通过旋转容器2可以使蛋白质晶体生长各向同性。第一个理由是，据估计蛋白质溶液轻轻流动使蛋白质浓度变得均匀了。为了蛋白质晶体生长各向同性，蛋白质溶液的蛋白质浓度均匀是必需的。通过旋转容器2，蛋白质溶液轻轻流动使蛋白质浓度变得均匀了。因此，估计蛋白质晶体的生长各向同性。第二个理由是，生长的蛋白质晶体不会落到容纳蛋白质溶液的容器的底部而且也永远不会粘附在该容器的壁上。假如该蛋白质晶体落在容器上或粘附在壁上，晶体的生长在接触面上就会受到阻碍。如此，蛋白质晶体的生长就不会是各向同性的。据估计，容器2的旋转可阻止蛋白质晶体的沉淀以及粘附到壁上，因此使得蛋白质晶体的生长各向同性。
而且，通过旋转容器2，可获得较大的蛋白质晶体。这个理由未必清楚。但是，当旋转容器2时，据估计只有部分蛋白质晶体的晶核选择性地生长从而晶核生长为大的蛋白质晶体。
需要电动机4与电动机6分别旋转外框架5与内框架7以使得施加到容器2的重力各向同性。那即，当在一段足够长的时间内观察容器2时，需要施加到容器2上的重力在各个方向上都是均匀的。这使得蛋白质晶体的生长更加各向同性。
如下所述，需要电动机4与电动机6分别旋转外框架5与内框架7。假定φ是与旋转轴4a垂直的任意方向和外框架5之间的角度。而且假定θ是与旋转轴6a垂直的任意方向和内框架7之间的角度。这时，外框架5与内框架7旋转，其角度φ与θ符合下面的微分方程，φ.=A|sinφ|]]>θ.=B|sinφ|-----(1)]]>应当注意到，φ与θ的初始值是任意的。还有，A与B以如下方式选择2m/n不是一个整数，使n与m取最小值以符合A∶B＝n∶m的关系。
当角度φ与θ的设定符合微分方程(1)时，重力是各向同性地施加到容器2上的。该理由在由本发明受让人提交的日本公开的专利申请(JP-P2000-79900A)中有描述。
然后，在这个实施例中说明了通过蛋白质结晶设备生长蛋白质晶体的一个示例。
将其中溶解有溶菌酶的溶菌酶溶解缓冲溶液用作蛋白质溶液。溶菌酶溶解缓冲溶液的溶菌酶浓度是80mg/ml。将乙酸与乙酸钠作为缓冲剂溶入溶菌酶溶解缓冲溶液。乙酸与乙酸钠的浓度分别都是50mM。制成的溶菌酶溶解缓冲溶液的pH值为4.7。
将其中溶解有氯化钠的氯化钠溶解缓冲溶液用作沉淀剂溶液。氯化钠的浓度是1.0M。将乙酸与乙酸钠作为缓冲剂溶入氯化钠溶解缓冲溶液。乙酸与乙酸钠的浓度分别都是50mM。制成的氯化钠溶解缓冲溶液的pH值为4.7。
将溶菌酶溶解缓冲溶液20μl注入扣形件22的空腔22a中。而且，将氯化钠溶解缓冲溶液300μl吸收进入纤维素纤维24。用密封件23封住容器2且将容器2固定到容器支承部分8上。
当三维回转器1开始动作时溶菌酶晶体也就开始生长。以平均旋转速度约1.5rpm绕着旋转轴4a旋转外框架5。以平均旋转速度约1.7rpm绕着旋转轴6a旋转内框架7。这样，容器2的旋转具有两个旋转轴，因此施加到其上的重力各向同性。当容器2旋转期间容器2保持恒定温度约20℃。旋转持续约90个小时。之后，取出得到的溶菌酶晶体。
作为一个对比实验，执行一个类似的实施例，只是容器2不旋转。
对得到的溶菌酶晶体执行晶体结构分析，诸如测量晶体的尺寸大小、外观观测、密度测量以及X射线衍射。
通过外观观测发现，通过旋转容器2获得的溶菌酶晶体更加各向同性。图4A是在容器2旋转条件下生长的溶菌酶晶体的表面观察图片。图4B是在容器2不旋转条件下生长的溶菌酶晶体的表面观察图片。在容器2旋转条件下生长的溶菌酶晶体具有比较光滑的表面。这表明溶菌酶晶体的生长通过旋转容器2更加各向同性。
而且，发现旋转或不旋转容器2对作为晶体尺寸测量结果的溶菌酶晶体尺寸大小有影响。在容器2旋转的条件下获得尺寸大于200μm的溶菌酶晶体和尺寸小于20μm的溶菌酶晶体。另一方面，在容器2不旋转的条件下获得的溶菌酶晶体尺寸范围为50-100μm。这表明只有部分溶菌酶晶体的晶核选择性地生长且表明当容器2旋转时该晶核生长为大的溶菌酶晶体。
作为密度测量与晶体结构分析的结果，发现旋转或不旋转容器2对溶菌酶晶体密度、品格结构以及微晶都没有影响。图5显示了获得的溶菌酶晶体的特征。不管是否旋转容器2，生成的溶菌酶晶体的密度均约为1.25g/ml。发现X-射线分析结果表明不管是否旋转容器2，所获得的溶菌酶晶体都具有四方晶系的晶体结构且其点群为P43212。而且，作为X-射线分析结果，不管是否旋转容器2，生成的溶菌酶晶体的单位晶胞的大小尺寸大致彼此相同。而且，作为镶嵌扩散的观察结果，发现镶嵌系数为0.2且彼此相同。而且，用X射线照射获得的溶菌酶晶体以产生布喇格反射。此时，发现任意溶菌酶晶体的最大分辨率都等于或大于约1.4且彼此大致相同。因此，发现旋转容器2不会对所获得溶菌酶晶体的微晶产生不利的影响。
本发明提供了促进蛋白质晶体生长的蛋白质结晶技术。
而且，本发明提供了蛋白质晶体可以更加各向同性生长的蛋白质结晶技术。
权利要求
1.一种蛋白质结晶设备，其包括容器支承部分，其上以可拆卸方式固定有至少一个容器；以及旋转部件，其绕着第一与第二旋转轴旋转所述容器支承部分，其中所述容器包含有蛋白质溶液且在所述容器支承部分旋转期间生长蛋白质晶体。
2.依照权利要求1所述的蛋白质结晶设备，其中所述旋转部件包括第一旋转部件，其绕着所述第一旋转轴旋转所述容器；以及第二旋转部件，其绕着所述第二旋转轴旋转所述第一旋转部件。
3.依照权利要求2所述的蛋白质结晶设备，其中所述第一旋转部件包括内框架，其支承所述容器支承部分；以及第一电动机，其旋转所述内框架，并且所述第二旋转部件包括外框架，其上安装有所述第一旋转部件；以及第二电动机，其旋转所述第一旋转部件。
4.依照权利要求3所述的蛋白质结晶设备，其中所述旋转部件旋转所述容器支承部分以符合下面的微分方程(1)，φ.=A|sinφ|]]>θ.=B|sinφ|]]>...(1)其中φ是与所述第一旋转轴垂直的预设方向和所述外框架之间的角度，而θ是与所述第二旋转轴垂直的预设方向和所述内框架之间的角度，而A与B以如下方式选择2m/n(m与n都是正整数)不是一个整数，使n与m取最小值以符合A∶B＝n∶m的关系。
5.依照权利要求1-4中任意一个所述的蛋白质结晶设备，其中所述旋转部件旋转所述容器支承部分，使得施加到所述容器上的重力各向同性。
6.依照权利要求1-4中任意一个所述的蛋白质结晶设备，其中所述容器包括具有开口的容器部分；密封所述容器部分的所述开口的密封部分；吸收件，其设置在所述容器部分中且其中吸收了沉淀剂溶液，沉淀剂由所述吸收件蒸发而扩散进入所述容器部分内部；以及扣形件，其设置在所述容器部分中远离所述吸收件，用以保持所述蛋白质溶液，所述沉淀剂由所述蛋白质溶液吸收从而沉淀产生蛋白质晶体。
7.一种蛋白质结晶方法，其包括步骤(a)提供容器给容器支承部分；(b)绕着第一与第二旋转轴旋转所述容器支承部分；以及(c)在所述容器支承部分旋转期间生长蛋白质晶体，其中所述容器包含有蛋白质溶液。
8.依照权利要求7所述的蛋白质结晶方法，其中所述(b)旋转步骤包括步骤绕着所述第一旋转轴旋转所述容器；以及绕着所述第二旋转轴旋转所述第一旋转部件。
9.依照权利要求7所述的蛋白质结晶方法，其中所述(b)旋转步骤包括步骤旋转所述容器支承部分以符合下面的微分方程(1)，φ.=A|sinφ|]]>θ.=B|sinφ|]]>...(1)其中φ是关于所述第一旋转轴的旋转角度，而θ是关于所述第二旋转轴的旋转角度，而A与B以如下方式选择2m/n(m与n都是正整数)不是一个整数，使n与m取最小值以符合A∶B＝n∶m的关系。
10.依照权利要求7-9中任意一个所述的蛋白质结晶方法，其中所述(b)旋转步骤包括步骤旋转所述容器支承部分使得施加到所述容器上的重力各向同性。
11.依照权利要求7-9中任意一个所述的蛋白质结晶方法，还包括步骤提供所述容器，所述容器包括具有开口的容器部分；密封所述容器部分的所述开口的密封部分；吸收件，其设置在所述容器部分中且其中吸收了沉淀剂溶液，沉淀剂由所述吸收件蒸发而扩散进入所述容器部分内部；以及扣形件，其设置在所述容器部分中远离所述吸收件，用以保持所述蛋白质溶液，且其中所述(d)生长步骤包括如下步骤由所述吸收件蒸发所述沉淀剂；所述蛋白质溶液吸收所述沉淀剂；以及沉淀产生所述蛋白质晶体。
全文摘要
蛋白质结晶设备和蛋白质结晶方法。蛋白质结晶设备由容器支承部分(8)与旋转部件(1)组成。容器(2)可拆卸地固定在容器支承部分上。旋转部件绕着第一与第二旋转轴(4a、6a)旋转容器支承部分。该容器由以下部分组成:具有开口的容器部分;密封所述容器部分的所述开口的密封部分;吸收件,其设置在容器部分中且其中吸收了沉淀剂溶液;以及扣形件,其设置远离吸收件用以保持所述蛋白质溶液。在容器支承部分旋转期间沉淀剂蒸发而扩散进入容器部分内部。蛋白质溶液吸收沉淀剂从而沉淀产生蛋白质晶体。
文档编号C30B30/08GK1381618SQ0211869
公开日2002年11月27日 申请日期2002年4月12日 优先权日2001年4月12日
发明者植村胜 申请人:三菱重工业株式会社