专利名称:用Δ133p53β检验被认为倾向于具有转移性癌症的受试者的方法
技术领域：
本发明涉及一种检验被认为倾向于具有转移性癌症(优选乳腺癌或结肠癌)的受试者的方法。
背景技术：
尽管已努力改善癌症患者的治疗和处理，对于多种癌症类型而言，在过去二十年中癌症患者的生存率并没有改善。肿瘤发生期间的一个关键事件是原发性局部肿瘤转化为侵袭性转移肿瘤。多数具有转移肿瘤的患者死于转移肿瘤。新近检测出的患者只有35%没有转移肿瘤。
侵袭过程是细胞形态改变的结果，细胞形态改变开始于因上皮连接的破坏导致的粘附性丧失。然后，细胞通过重塑肌动蛋白细胞骨架获得迁移能力，重塑细胞骨架中涉及小 GTP酶的他0家族。肿瘤细胞能应用两种模式的迁移需要整联蛋白介导的粘附动力学及表面蛋白酶以降解细胞外基质(ECM)的间充质迁移或更有效地而无需ECM消化或整联蛋白介导的粘附但涉及RhoA/ROCK通路的阿米巴样迁移(amoeboid migration)。肿瘤抑制剂p53 通过调节Mio GTP酶介导的细胞运动防止癌症进行至侵袭阶段。
最佳治疗基于诊断和预后信息的组合。需要准确而可重复的诊断性检验以提供预后评估，其将提供关于生存的特定信息。
在乳腺癌中，普遍使用的预测原发性手术治疗生存率的临床和生物学变量有区域性淋巴结侵袭、组织学级别及激素受体表达。所有这些参数是已良好鉴定的预后和预测因
ο
然而，这些变量不能建立特定的及完整的生存率预后。实际上，在罹患同类型乳腺癌的患者中有重要的异质性。
因此，存在提供另外的生物标记的需要，该生物标记能够增强乳腺癌患者生存率的预测。[0008]生物标记可用在生物学中区分正常医学状态和病理状态，或评价病理进展。允许癌症早期检测的技术得益于生物标记，在癌症搜索和临床护理中是非常有益的。
肿瘤标记的重要性在于建立、评估及验证人类肿瘤的分子分类，因而从诊断可以允许
-更好地评价癌症的亚临床(infraclinic)转移潜力，从而避免存在低风险的患者的过度治疗并从而允许分离存在进化高风险的患者；
-从群体评价转换为个体评价，从而给以可能的个性化治疗；
-指导存在进化高风险并对常规治疗不敏感或几乎不敏感的患者进行治疗革新； 及
-允许评估可选的治疗性分子的效果。
乳腺癌每年影响大约一百万人，代表妇女中最普遍的癌症形式，影响着西方世界中处于一生某阶段中的所有妇女的大约10%。男性也能发展乳腺癌，尽管他们的风险小于千分之一。
世界卫生组织已计划，在2010年前癌症将成为世界范围内死亡的首要原因，处于心血管病之前。法国的最近发病率和死亡率数据显示相同的进化情况(Communication 2008 of Francim,the Institut de Veille Sanitaire,the Hospice Civils of Lyon and the Institut National du Cancer)。
在乳腺癌中，依照患者肿瘤的生物病理特征治疗患者是重要的。因此目标是提供可信的预测因素以选择仅针对化疗敏感(chimiosensive)患者的靶向化疗 (chimiotherapy)及依照特定肿瘤生物标记选择特定药物。因此，化疗的效果依赖于细胞特征和敏感性生物标记(如激素受体，UPA、PAIU Her2及拓扑异构酶II α表达)的存在。 肿瘤抑制剂Ρ53是在人类肿瘤中最常突变的基因。然而，影响ρ53基因的突变应被仔细解释，特别是因为它的预测价值取决于乳腺癌类型。
发明内容
发明者现在发现肿瘤抑制剂ρ53同种型的表达模式由异常剪切(印issage)引起， 与预后不佳相关。
换句话说，发明者已鉴定了与转移癌特异相关的标记。因此，这些p53同种型允许将转移癌与非转移癌区分开。
本发明涉及一种检验被认为倾向于患有癌症的受试者的方法，其包括步骤i)分析来自所述受试者的生物样品来检测选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型的存在，所述Ρ53同种型的存在是癌症、优选转移性癌症的指示物。
优选地，所述方法是一种检验被认为倾向于患有转移性癌症的受试者的方法。
在一特定实施方案中，ρ53同种型的存在与确定ρ53同种型的表达水平相对应。
能够通过检测ρ53同种型多肽或其片段、或通过检测ρ53同种型mRNA或其片段评价P53同种型的存在。
此外，所述方法可以包括将检测到的p53同种型的表达水平和阈值比较的又一步骤。所述阈值可以与阳性对照或阴性对照相对应。
例如，阴性对照可以是患有非转移癌症受试者的p53同种型表达水平或健康受试者的P53同种型表达水平。
优选地，高于阴性对照的表达水平指示转移性癌症。
例如，阳性对照可以是患有转移性癌症受试者的p53同种型表达水平。
优选地，根据本发明的方法是体外方法。
优选地，所述癌症是转移性癌症。
另一方面，本发明涉及一种用于测定受试者中癌症侵袭性的方法，其包括步骤i) 确定来自受试者的生物样品中选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型的存在，所述Ρ53同种型的存在是侵袭性癌症的指示物，优选地，所述同种型是转移性癌症的指示物。
另一方面，本发明涉及一种确定受试者对于抗癌治疗的反应的方法，所述受试者正在接受或已接受对于癌症相关状态的治疗，其包括步骤[0031]i)确定来自受试者的生物样品中的选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的 Ρ53同种型的表达水平，及
ii)将其与阈值相比较。
所述阈值可以与如上所定义的阳性对照或阴性对照相对应，或与来自受试者的样品中所测的、在所述受试者接受治疗之前的表达水平相对应。
优选地，此方法包括确定受试者是否对于治疗有反应的又一步骤。
例如，当所述p53同种型表达水平低于在所述受试者接受治疗之前的来自受试者样品中所测表达水平时，所述同种型的存在是受试者对于治疗有反应的指示物。或者，当所述P53同种型表达水平等于或低于来自没有癌症的受试者的样品中所测表达水平时，所述 P53同种型的存在是受试者对于治疗有反应的指示物。
本发明的上述方法能与其他癌症诊断或预后方法组合使用。
在此所用的术语“p53同种型”指由剪接缺陷引起的、分别与具有序列SEQ ID 7的 p53多肽或与具有cDNA序列SEQ ID NO 8的p53mRNA不同的多肽或mRNA。本发明的p53 同种型选自 Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ 和 Δ 133ρ53 β。
优选地，所述ρ53同种型为Δ 133ρ53 β。
优选地，Δ 133ρ53 β多肽以序列SEQ ID :1为代表，而Δ 133ρ53 β mRNA具有cDNA 序列 SEQ ID NO :2。
优选地，Δ 133ρ53多肽以序列SEQ ID 3为代表，而Δ 133p53mRNA具有cDNA序列 SEQ ID NO :4。
优选地，Δ 133ρ53 γ多肽以序列SEQ ID 5为代表，而Δ 133p53ymRNA具有cDNA 序列 SEQ ID NO :6。
“癌症”包括以失调或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如那些其细胞还未迁移到受试者体内初始肿瘤位点以外的位点的肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如那些由肿瘤转移产生的，肿瘤细胞迁移到与初始肿瘤位点不同的第二位点)O
在本发明方法中，此类癌症优先选自特别是人类受试者的乳腺癌、卵巢癌、消化道癌及喉癌，更优选的是乳腺癌或结肠癌，而更优选乳腺癌。
术语剪接过程由从前体信使RNA去除内含子以产生能被细胞翻译机制所使用的成熟信使RNA组成(SHARP，Cell, vol. 77，p. 805-815，1994)。在可选剪接的情况下，同一前体可作为编码具有不同功能的蛋白质的信使RNA的来源(BLACK，Annu. Rev. Biochem. vol. 72，p.291-336,2003)。
“剪接缺陷”意思是能导致异常同种型形成的异常剪接过程。
在此所用的关于癌症的术语“侵袭性” (agrressive)(或“侵袭性”(invasive))指肿瘤超越其边界扩张至邻近组织的倾向性，或指肿瘤关于转移的特征。侵袭性癌症能够与器官限定型癌症对照。例如，皮肤基底细胞癌是非侵袭性的或最小侵袭性的肿瘤，局限于原发性肿瘤位点并扩张大小但不转移。与之相反，黑色素瘤对于邻近及远端组织是高度侵袭性的。肿瘤的侵袭性质往往伴随蛋白水解酶(如胶原酶)的作用，蛋白水解酶降解基质材料和基底膜材料以使肿瘤得以扩张超越被膜的限制及超越肿瘤所在特定组织的限制。
在此所用的术语“转移”或“转移的”指在患者体内癌症从初始器官向另外的远端位点传播的情况。肿瘤转移的过程是多阶段事件，包括局部侵袭和细胞间基质破坏、向血管、淋巴管或其他转运管道内的内渗、循环系统中的生存、从管道外渗至继发位点及在新位置的生长。
术语“受试者”包括哺乳动物，例如人类、犬、奶牛、马、袋鼠、猪、绵羊、山羊、猫、小
鼠、兔、大鼠及转基因非人类动物，优选人类受试者，并更优选女性。
术语“生物样品”包括固体和体液样品。本发明的生物样品可能包括细胞、蛋白质、 血液或生物液如骨髓、腹水液或脑液(例如脑脊液)。
固体生物样品的例子包括取自粪便、直肠、中枢神经系统、骨、乳腺组织、肾组织、 宫颈、子宫内膜、头/颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、垂体腺、肾组织、肌肉、食道、胃、小肠、 结肠、肝、脾、胰脏、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体及胸腺的样品。“体液样品”的例子包括取自血液、血清、精液、前列腺液、精液(seminal fluid)、尿液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴和眼泪的样品。 用于本发明的测定的样品能以标准方法(包括静脉穿刺和手术活检)获得。在一具体实施方案中，生物样品是通过穿刺活检获得的乳腺组织样品。
在优选的具体实施方案中，用于本发明的方法的生物样品选自骨髓、血清、血浆、 血液、淋巴或来自癌变或疑似癌变组织或其邻近组织的细胞，优选骨髓样品。
术语“表达水平”或“水平”意指样品中表达产物(例如多肽或mRNA)的浓度。
如下面更详细地描述的，本发明的检测方法能用于体外检测生物样品中的本发明 P53同种型的mRNA、本发明p53同种型多肽或其特定片段。例如，用于检测所述p53同种型的mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测p53同种型及更具体地 Δ 133ρ53 β多肽的体外技术包括免疫组化、定量PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA) ,Western 印迹、免疫沉淀及免疫荧光。
在优选的具体实施方案中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中p53同种型是 Δ 133ρ53β。
当根据本发明所述的方法是基于检测或定量ρ53同种型mRNA，还优选所述mRNA的存在的确定包括又一步骤
扩增所述p53同种型mRNA或cDNA、其互补序列或其具有至少10个核苷酸长的片段(该片段特异于所述P53同种型)。
在此使用的术语“mRNA”指成熟mRNA，即已经进行过剪接事件的mRNA。
在此使用的术语“ cDNA，，应指mRNA的DNA拷贝。
还优选以PCR或RT-PCR反应完成扩增Δ 133ρ53 β mRNA或cDNA的步骤。
此检测可通过自样品分离mRNA来实现。当使用mRNA检测时，方法可能通过下述步骤进行根据标准方法将分离的mRNA转换成cDNA ；在容器中以扩增反应试剂(如cDNA PCR反应试剂)和核酸引物的适当混合物一起处理转换的cDNA ；容器的内容物进行反应以产生扩增产物；及分析扩增产物以检测生物样品中本发明P53同种型的特异核酸的存在。
优选地，所述引物具有序列SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10。
在此使用的术语“引物”指无论是自然发生(如在纯化的限制酶消化物中)还是合成生产的寡核苷酸，并且其在放置在适当条件(即，有核苷酸和诱发剂如DNA聚合酶存在时，及在合适的温度和PH)下时能够起始互补于核酸的链的合成。引物可能是单链或双链的，并且必须足够长以在诱发剂存在时启动所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物的序列和/或同源性及所用方法。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物通常包含10到25个或更多个核苷酸，取决于靶序列的复杂度，尽管引物可包含更少的核苷酸。
在此选择引物“实质上”互补于特定靶标DNA序列。其意思是引物必须足够互补以杂交于其分别的链。因此，引物序列不需要反映模板的精确序列。例如，非互补核苷酸片段 (即包含限制位点的)可被连接至引物的5’端，而引物序列的剩下部分互补于链。可选地， 非互补碱基或更长的序列可以被穿插进引物，只要引物序列与待杂交并形成用于合成延伸产物的模板的序列足够互补。
“扩增”指模板依赖性过程和载体介导的增殖，其导致特定核酸分子相对其最初浓度的浓度增加，或导致可检测信号浓度的增加。在此使用的术语模板依赖性过程意指涉及引物分子模板依赖性延伸的过程。
术语模板依赖性过程指RNA或DNA分子的核酸合成，其中核酸新合成链的序列由广为人知的互补碱基配对规则(见，例如，Watson，J.D.等，In =Molecular Biology of the Gene，第 4 版，W. A. Benjamin, Inc.，Menlo Park, Calif. (1987))决定。通常，载体介导的方法学包括引入核酸片段至DNA或RNA载体中，克隆扩增该载体，并回收扩增的核酸片段。 此类方法学的例子由 Maniatis T.等，Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. i^i"共。
多种模板依赖性过程可供扩增样品中存在的相关靶序列。熟知的扩增方法之一是聚合酶链式反应(PCR)，其在Mullis等，美国专利号4，683，195、Mullis等，美国专利号 4，683，202 和 Mullis 等，美国专利号 4，800，159，和在 Innis 等，PCR Protocols, Academic Press, Inc.，San Diego Calif.，1990中有详细描述。简单讲，PCR中，制备两条互补于靶序列的相反互补链区域的引物序列。将过量的脱氧核苷三磷酸连同DNA聚合酶(例如Taq 聚合酶)加入到反应混合物中。如果靶序列在样品中存在，引物会结合于靶标，并且聚合酶会通过加上核苷酸导致引物沿着靶序列被延伸。通过提高和降低反应混合物温度，延伸的引物会从靶标解离以形成反应产物，过量引物会结合于靶标和反应产物并重复该过程。优选地，可能进行反转录酶PCR扩增步骤以定量扩增的mRNA量。聚合酶链式反应方法在本领域内众所周知。
依据本发明，可能使用在GB申请号2 202 328和PCT申请号PCT/US89/01025中公开的其他扩增方法。在前一个申请中，在类PCR的模板和酶依赖性合成中使用了“修饰” 引物。可能通过以捕获部分(例如生物素)和/或检测部分(例如酶)进行标记来修饰引物。在后一个申请中，过量的标记探针被加入到样品。在靶序列存在时，探针结合并被催化切割。切割后，释放的完整靶标序列被过量探针结合。标记探针的切割示意靶序列的存在。
扩增后，可能检测扩增产物的存在。可能以本领域所知的任何方法测序扩增的产物。
在另一具体实施方案中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中通过探针进行选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型的存在的确定，该探针能特异杂交所述Ρ53同种型mRNA、其互补序列或其具有特异于所述ρ53同种型的至少10、15、20、25、 30、35、40、45、50或更多个核苷酸长的片段，优选杂交人类Δ 133ρ53 β mRNA,并更优选杂交具有序歹Ij SEQ ID NO 2 的 Δ 133ρ53 β mRNA。
有利的是，探针选自序列SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10或SEQ IDNO :11，优选序列 SEQ ID NO :11。
在特定实施方案中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中通过下面的方法进行P53同种型mRNA、更优选Δ 133ρ53 β mRNA的存在的确定，该方法包括步骤
(a)在杂交条件下，将生物检验样品接触特异于选自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53 β的ρ53同种型的核酸探针，该样品包括
-分离自人类受试者生物样品的RNA分子，其中生物样品疑似包含肿瘤细胞，或
-自分离的RNA分子合成的核酸分子如cDNA，
其中核酸探针具有包括p53同种型序列的至少15个核苷酸长的片段、或其片段、 或其互补的核苷酸序列，及
(b)检测核酸探针和检验样品的杂交物的形成，
其中杂交物的存在表明获自人类受试者的组织中肿瘤细胞的存在。
基于本发明核酸分子序列的探针能被用于检测对应于选自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ 和Δ 133ρ53 β的ρ53同种型的mRNA的转录物。例如，核酸探针可以是全长cDNA、或其片段 (如具有能在严谨条件下特异性杂交于本发明P53同种型mRNA的足够长度的寡核苷酸)。 mRNA与探针的杂交表明讨论中的标记正在被表达。在一具体实施方案中，探针包括连接其上的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
一种方式是，mRNA固定于固体表面并与探针接触，例如通过将分离的mRNA跑样于琼脂凝胶并将mRNA从凝胶转移至(如硝酸纤维素)膜上。另一种方式是，固定探针于固体表面并用探针接触mRNA，例如在Affymetrix基因芯片列阵中。技术人员能容易地调适已知的mRNA检测方法以用于检测由本发明标记物编码的mRNA的表达水平。
当根据本发明所述的方法是基于检测或定量p53同种型多肽表达水平时，还优选以使用能特异识别所述P53同种型的抗体的免疫组化或免疫测定来确定所述p53同种型的存在。
在一具体实施方案中，通过用特异于选自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和Δ133ρ53β 的ρ53同种型或其片段的抗体接触生物样品并确定抗体与生物样品的结合来进行选自 Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ 133ρ53β的ρ53同种型的存在的确定。
“抗体”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性决定簇，即包含特异结合(免疫反应于)抗原的抗原结合位点(表位)的分子。在H和L链的可变(V)决定簇中发现大量及多样化的抗体的结合特异性。抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、整个免疫球蛋白和免疫球蛋白的抗原结合片段。
通过分析自然产生的抗体片段定位包括抗体(即抗体的抗原结合功能)的蛋白质的结合位点。因此，抗原结合片段也拟被指定为术语“抗体”。术语抗体所涵盖的结合片段的例子包括由VL、VH、CL和Cm结构域组成的Fab片段；由VH和CHI结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；分离的互补决定区(CDR)；及F(ab’)2 片段(其是包括在铰链区以二硫键连接的两个Fab’片段的二价片段)。使用本领域技术人员熟知的常规技术可得到这些抗体片段，并且以与完整抗体同样的方式筛选片段的实用性。术语“抗体”还意在包括具有至少一个来源于抗体分子的抗原结合决定簇的双特异性和嵌合分子。
在本发明的诊断和预后测定中，抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并优选单克隆抗体。
优选地，所述抗体被标记。
通过酌情以多次皮下或腹腔内注射免疫原(抗原)和佐剂免疫动物(通常为哺乳动物)生产多克隆抗体。作为说明性实施方案，通常通过将大约Iyg到Img能引起免疫反应的蛋白质和增强载体制备物(如弗氏完全佐剂)或凝聚剂(如明矾)组合到一起并将该组合物皮下注射到多个位点而将动物进行针对蛋白质、肽或衍生物的免疫。稍后，通过皮下注射至多个位点，以至少一次弗氏不完全佐剂(或其它合适佐剂)中的较低量(如起初量的1/5到1/10)免疫原的后续给药来加强免疫动物。随后给动物抽血，测定血清以确定特异性抗体滴度，并且再次加强免疫动物并测定直至抗体滴度不再增加(即稳定期)。
此种抗体分子群体称为“多克隆”，因为该群体包括大量抗体，其中每一个均特异于免疫原中发现的多个不同表位之一，并且其中每一个的特征均为对于那个表位的特异性亲和性。表位是抗原性的最小决定因素，对于一种蛋白质来说其可能包括六到八个残基长度的肽(Berzofsky J.禾口 1. Berkower (1993) in Paul, W.,编，Fundamental Immunology, Raven Press, N. Y.，p. 246)。亲和性范围从低(例如I(T6M)到高(例如IO"11)。
通过熟知的技术(例如通过具有选择性结合免疫球蛋白分子的亲和基质如蛋白A 的层析)分离收集自哺乳动物血清的多克隆抗体部分以获得IgG部分。为增强抗体的纯度和特异性，还可以通过使用固相固定免疫原的免疫亲和层析进一步纯化特异性抗体。抗体与固相固定的免疫原接触一段足够长的时间以使得免疫原能免疫反应于抗体分子而形成固相固定的免疫复合物。通过标准技术(如通过使用降低PH或增加离子强度的缓冲液) 自固相洗脱结合的抗体，测定洗脱部分，并合并那些包含特异性抗体的部分。
在此使用的“单克隆抗体”指单分子组合物的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物显示对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。能使用通过连续培养培养中的细胞以生产抗体分子的技术制备单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Kohler和Milstein 所述的杂交瘤技术(1975，Nature, 256 :495-497 ；还见 Brown 等，1981，J. Immunol.，127 539-46 ；Brown 等，1980，J. Biol. Chem.，255 :4980-83 ；Yeh 等，1976，PNAS 76 :2927-31 ；和 Yeh 等，1982，Int. J. Cancer, 29 :269-75)和更近的人 B 细胞杂交瘤技术(Kozbor 等，1983， Immunol. Today 4 72) > EBV- 1 ^ ^ ^ ^ (Cole φ, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,Inc. ,pp. 77-96)和三源杂交瘤技术。用于生产杂交瘤的技术众所周知(一般见Current Protocols in Immunology,Coligan等编，John Wiley&Sons, New York, 1994) 0通过(例如使用标准ELISA测定)筛选杂交瘤培养上清中的结合目标多肽的抗体来检测生产本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
能够通过下列步骤生产单克隆抗体。在所有步骤中，如上面用于制备多克隆抗体所述，以抗原(如蛋白质(或其肽))免疫动物。通常通过以免疫有效剂量(即足够产生免疫反应的量)将免疫原给药至具有免疫能力的哺乳动物来完成免疫。优选地，哺乳动物是啮齿类动物如兔、大鼠或小鼠。然后，于所述加强免疫日程维持哺乳动物一段足够的时期， 以使哺乳动物生成高亲和性抗体分子。在生成高亲和性抗体的一段足够时间之后，处死动物(如小鼠)并从淋巴结、脾脏和外周血的一个或多个获得生产抗体的淋巴细胞。优选脾细胞，并且能够用本领域技术人员熟知的方法在生理培养基中将脾细胞机械分离为单个的细胞。通过融合于小鼠骨髓瘤系细胞永生化生产抗体的细胞。
小鼠淋巴细胞给出了高百分比的与小鼠同源骨髓瘤的稳定融合，然而也能使用大鼠、兔和蛙体细胞。一般在融合剂如聚乙二醇存在下，通过融合于骨髓瘤细胞永生化生产所需抗体的动物的脾细胞。使用标准技术，能够使用适于做融合配偶体的若干骨髓瘤细胞系的任意一个，例如，P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8. 653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤系，可从美国典型培养物收藏中心(ATCC)，罗克维尔，马里兰州获得。
在被设计用于消除未融合亲本骨髓瘤或淋巴细胞或脾细胞的选择性培养基(如 HAT培养基)中培养包括所需杂交瘤的融合产物细胞。选择杂交瘤细胞并在限制稀释条件下使其生长以获得分离的克隆。例如，通过用以确定所需抗原如用于免疫的抗原的免疫测定技术，筛选每个克隆杂交瘤的上清中所需特异性和亲和性抗体的生产。通过传统方法 (如硫酸铵沉淀、离子交换层析和亲和层析)从生产细胞的培养物中分离单克隆抗体(Zola 等，Monoclonal Hybridoma Antibodies :Techniques And Applications, Hurell (编)， pp. 51-52，CRC Press,1982)。
能使用本领域技术人员熟知的技术在体外或体内(在腹水液中)培养中繁殖根据这些方法生产的杂交瘤。
替代制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，能够通过用目标多肽筛选重组的组合免疫球蛋白库(例如抗体噬菌体展示库)来鉴定和分离针对本发明多肽的单克隆抗体。用于生成和筛选噬菌体展示库的试剂盒是市场上可买到的(例如法玛西亚重组噬菌体抗体系统， 目录号27-9400-01 ；及Mratagene SutfZ4P噬菌体展示试剂盒，目录号M0612)。此外， 能够在例如美国专利号5，223，409 ;PCT公开号WO 92/18619 ;PCT公开号WO 91/17271 ； PCT 公开号 WO 92/20791 ;PCT 公开号 WO 92/15679 ;PCT 公开号 WO 93/01288 ;PCT 公开号 W092/01047 ；PCT 公开号 WO 92/09690 ；PCT 公开号 WO 90/02809 ；Fuchs 等(1991)Bio/ Technology 9 :1370-1372 ；Hay 等(1992)Hum. Antibod. Hybridomas,3 :81-85 ；Huse 等 (1989) Science 246 :1275-1281 ；Griffiths 等(1993) EMBO J. ,12 :725-734.中找到特别经得起考验的适用于生成和筛选抗体展示库的方法和试剂的例子。
此外，包括人类和非人类部分的重组抗体(如嵌合和人源化单克隆抗体)，其能够用标准重组DNA技术制得，落在本发明的范围之内。通过本领域已知的重组DNA技术(例如使用在PCT公开号WO 87/02671 ；欧洲专利申请0 184 187;欧洲专利申请0 171 496 ；欧洲专利申请0 173 494;PCT公开号W086/01533;美国专利号4，816，567;欧洲专利申请0 125 023 ；Better等(1988)中公开的方法)能够生产此类嵌合和人源化单克隆抗体。在此使用的“标记抗体”包括以可检测的手段标记的抗体，并包括以本领域技术人员已知的多种不同方法的任意方法酶法地、放射性地、荧光地、化学发光地和/或生物发光地标记的抗体。
能够可检测地标记抗体的方式之一是通过将抗体连接于酶。此酶(当之后暴露于其底物时)反过来会以产生能被检测的(例如通过分光光度法、荧光仪或目测方法)化学部分的方式与底物反应。能被用于可检测地标记P53同种型特异性抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、金黄色葡萄球菌核酸酶、△-V-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天门冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、 B-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡萄糖糖化酶和乙酰胆碱酯酶。
可以用多种免疫测定的任意一种实现检测。例如，通过放射性标记抗体，可能通过使用放射性免疫测定检测该抗体。在Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,由 Work T. S.等编，North Holland Publishing Company，NY(1978)、
Chard T. )^111^ "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques”的一章，可以找到放射性免疫测定(RIA)的描述。通过如使用Y计数仪或闪烁计数仪或通过放射性自显影的方法能够检测放射性同位素。能特别用于本发明的目的的同位素有3H、131I、35S、14C，并优选 125I0
还可能以荧光化合物标记抗体。当荧光标记抗体暴露于合适波长的光下时，因为荧光的存在从而能检测它的存在。最常用的荧光标记化合物之中有荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白、邻苯二甲醛(ophthaldehyde)和荧光胺。
通过使用荧光发射金属如152Eu或其他镧系金属也能检测性标记抗体。这些金属能够通过使用如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团连接于抗体。
还能通过偶联抗体于化学发光化合物来检测性标记抗体。然后通过检测化学反应过程中发出的光的存在确定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子有鲁米那、荧光素、异鲁米那、theromatic吖啶酯(theromatic acridinium ester)、 咪唑、吖啶盐和草酸盐酯。
同样地，可能使用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是一类在生物系统中发现的化学发光，其中催化蛋白质增加了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在确定生物发光蛋白质的存在。用于标记目的的重要的生物发光化合物有荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
在本发明的检测测定中，抗体与生物样品的结合量能通过标记抗体所发出的信号强度和/或通过生物样品中结合于标记抗体的细胞数来确定。
生物样品中选自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型的检测或表达水平可通过放射性免疫测定、免疫放射分析和/或酶免疫测定来确定。
“放射性免疫测定”是使用标记(即放射性标记)形式的抗原(即Δ 133ρ53 β多肽)检测和测定抗原浓度的技术。用于抗原的放射性标记的例子包括3H、14c、和1251。生物样品中P53同种型的浓度通过让样品中的抗原与标记(即放射性的)抗原竞争与抗原抗体的结合来测定。为保证标记抗原和未标记抗原间的竞争性结合，标记抗原以足够浓度存在以饱和抗体的结合位点。样品中抗原浓度越高，将结合于抗体的标记抗原的浓度将会越低。
在放射性免疫测定中，为确定结合于抗体的标记抗原的浓度，抗原-抗体复合物必须从游离抗原分开。一个用于自游离抗原分开抗原-抗体复合物的方法是通过用抗同种型抗血清沉淀抗原-抗体复合物。另一用于自游离抗原分开抗原-抗体复合物的方法是通过用福尔马林杀死的金黄色葡萄球菌沉淀抗原-抗体复合物。还有另一个用于自游离抗原分开抗原-抗体复合物的方法是通过进行“固相放射性免疫测定”，其中抗体(即共价地) 连接于kpharose珠子、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微量滴定孔。通过与基于具已知浓度的抗原的样品标准曲线比较结合于抗体的标记抗原的浓度，可以确定生物样品中的抗原浓度。[0106]“免疫放射分析”(IRMA)是其中抗体试剂被放射性标记的免疫测定。IRMA需要通过如偶联于蛋白质(如兔血清白蛋白(RSA))的技术生产多价抗原偶联物。多价抗原偶联物必须每个分子具有至少2个抗原残基，并且抗原残基必须有足够的分开距离以允许至少两个抗体结合于抗原。例如，在IRMA中多价抗原偶联物可以被连接到如塑料球体的固体表面。
将未标记“样品”抗原和已被放射性标记的抗原的抗体加入到包含多价抗原偶联物包被的球体的试管中。样品中的抗原与多价抗原偶联物竞争抗原抗体结合位点。在适当的孵育期后，通过洗涤去除未结合的反应物并确定固相上的放射性量。结合的放射性抗体的量与样品中抗原浓度成反比。
最普遍的酶免疫测定是“酶联免疫吸附测定(ELISA) ”。“酶联免疫吸附测定 (ELISA) ”是用于使用标记(即酶连接)形式的抗体来检测和测定抗原浓度的技术。
在“夹心ELISA”中，抗体(即抗-Δ133ρ53β肽)被连接于固相(即微量滴定板) 并暴露于含抗原(即Δ133ρ53β肽)的生物样品。然后洗涤固相以去除未结合抗原。然后标记的(即酶连接的)抗体结合于结合的抗原(如果存在的话)形成抗体-抗原-抗体夹心层。能被连接于抗体的酶的例子有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和 3-半乳糖苷酶。酶连接的抗体与底物反应以生成能被分析的有色反应产物。
在“竞争性ELISA”中，抗体与包含抗原(即ρ53同种型肽)的样品孵育。然后将抗原-抗体混合物接触抗原包被的固相(即微量滴定板)。样品中存在的抗原越多，可获得的结合于固相的游离抗体越少。然后加入标记(即酶连接)的二抗到固相以确定结合于固相的一抗的量。
在“免疫组化测定”中，通过暴露组织于特异于待测定蛋白质的抗体，来检验部分组织的特定蛋白质。然后通过大量方法的任意一个可视化抗体以确定存在的蛋白质的存在和量。用于可视化抗体的方法的例子例如通过连接于抗体的酶(如荧光素酶、碱性磷酸酶、 辣根过氧化物酶或P-半乳糖苷酶)或化学法(例如DAB/产色原底物)或通过本领域技术人员所知的多种不同方法的任意方法的金、荧光或标记抗体。
另一方面，本发明涉及一种筛选潜在抗癌化合物并优选抗转移癌化合物的方法， 其包括步骤
a)可选地测定已知表达选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ 133ρ53β的ρ53同种型的细胞中所述Ρ53同种型的表达水平；
b)将待检验化合物与所述细胞接触；
c)通过上述检测所述p53同种型的方法确定所述p53同种型的表达水平；及
d)如果p53同种型在细胞中未表达或具有低于步骤a)之前的表达水平，则选择所述化合物作为潜在的抗癌化合物。可选地，所述筛选方法还可以包括步骤e)在细胞中、优选在转移癌细胞中检验步骤d)中所选的化合物，以证实所选化合物的抗癌性质、优选抗转移癌性质。
例如，所述步骤e)能对应于国际专利申请WO 2006/134305中公开的方法，即一种方法，其包括步骤将在其细胞膜上不表达E-钙黏着蛋白的肿瘤细胞与所选化合物接触， 并确定细胞表面E-钙黏着蛋白的存在，所述存在是抗转移活性的指示物。
所述步骤e)还能对应于SmithHW,Marra P,Marshall CJ. J Cell Biol. 2008 Aug25 ； 182 (4) :777-90中公开的方法，即在所选化合物存在时检验肿瘤细胞向三维胶原基质中侵袭的方法。
优选地，待检验化合物是反义RNA或干扰RNA (iRNA)。
另一方面，本发明涉及一种用于生产特异识别选自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53β的ρ53同种型多肽的多克隆抗体的方法，其中此方法包括步骤
a)以免疫有效剂量的选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型多肽(或抗所述多肽的至少9个氨基酸长度的特定表位片段，可选地具有增强载体制备物) 免疫哺乳动物；
b)可选地，体外确定动物血清或血浆中特异抗体的存在；及
c)自动物血清或血浆纯化或分离特异性抗-Δ 133ρ53、抗-Δ 133ρ53 γ或抗-Δ133ρ53β多肽的抗体。
本发明的一部分还涉及一种用于生产能分泌特异识别选自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ 和Δ133ρ53β多肽的ρ53同种型的单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，其中此方法包括步骤
a)以免疫有效剂量的选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型多肽(或抗所述多肽的至少9个氨基酸长度的表位片段，可选地具有增强载体制备物)免疫哺乳动物；
b)自哺乳动物的脾、淋巴结或外周血分离生产抗p53同种型肽的抗体的淋巴细胞；及
c)通过融合所述淋巴细胞和同种哺乳动物骨髓瘤系的细胞永生化生产抗-Δ133ρ53、抗-Δ133ρ53γ或抗-Δ133ρ53β多肽抗体的淋巴细胞。
本发明的一部分还涉及一种用于生产特异识别选自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ133ρ53β多肽的ρ53同种型的单克隆抗体的方法，其中此方法包括步骤
a)根据本发明的上述方法，生产能分泌特异识别选自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53 β多肽的ρ53同种型的单克隆抗体的杂交瘤细胞；
b)在合适的培养基和培养条件下培养此杂交瘤细胞；
c)自此培养基纯化或分离分泌的单克隆抗体。
在另一部分中，本发明包括以用于生产根据本发明的多克隆或单克隆抗体的方法获得的多克隆或单克隆抗体，其中所述抗体特异识别选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和 Δ 133ρ53β的ρ53同种型。
另一方面，本发明涉及一个用于检测或定量选自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53 β mRNA或多肽的ρ53同种型的试剂盒，其中此试剂盒包括
a)根据本发明所述的多克隆或单克隆抗体；或
b)选自能够扩增序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6或其具有至少 10个核苷酸长度的片段的一对引物的一对引物；或
c)具有包括选自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ和Δ 133ρ53β的ρ53同种型序列的至少 10个核苷酸长度的片段或其互补物的核苷酸序列的探针。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒能包括，例如(1)结合于根据本发明所述的 Ρ53同种型多肽的(例如，溶液中的或连接于固体支持物的)一抗；及，可选地，(2)偶联于可检测标记的第二个、不同的抗体，其结合P53同种型多肽或一抗。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒能包括，例如(1)杂交于p53同种型核酸序列(mRNA或cDNA，或其特定片段)的寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，或(2)用于扩增本发明P53同种型核酸分子的一对引物。该试剂盒还能包括，例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。该试剂盒还能包括检测可检测标记(如酶或底物)必需的组分。该试剂盒还能包含能够被测定和与生物样品比较的对照样品或系列对照样品。该试剂盒的每个组分均能封在一个独立容器中，并且所有不同容器能连同用于解释使用该试剂盒进行测定的结果的说明书放在一个单个包装内。
本发明还涉及一种用于补充形态学诊断的方法，其通过检测或定量哺乳动物生物样品中的选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型，通过上述方法或通过技术人员熟知的方法如免疫组化或免疫测定检测上述肽或通过检测任意类型(例如乳腺、结肠、胰腺、头颈等)肿瘤中的上述核苷酸序列的任意方法(例如RT-PCR、定量RT-PCR、FISH
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图1显示在患者表达或不表达Δ 133ρ53β的时间内的无病生存率(图la)和生存函数(图lb)。
图2显示在患者取决于Δ133ρ53β和ER表达的时间内的无病生存率(图2a)和生存函数(图2b)。
图3显示依赖于Δ 133ρ53 β表达的侵袭百分数(图3a)和迁移百分数(图北)。 图3c是代表p53和Δ 133ρ53 β同种型的示意图(NLS 核定位信号)。
图如显示在GFP阳性细胞中出泡细胞(blelibing cell)对贴壁细胞的定量分析。
图4b和c显示在用于E-钙黏着蛋白和β -整合蛋白western印迹的细胞中myc 标记的构建体表达的t Western印迹分析。Adh 仍与支持物粘附的细胞；bleb 显示出泡运动并已从支持物脱落的细胞。用抗GAPDH抗体进行标准化。
给出下列实施例和附图的目的在于说明本发明不同具体实施方案，而无意于以任何方式限制本发明。
具体实施方式
实施例
实施例1 材料和方法
DNA构建体、试剂和抗体
人p53同种型构建体由J. C. Bourdon馈赠。它们被亚克隆到pEGFPCl (Clonetech) 的EcoRI和BamHI位点以给出GFP-标记的蛋白质或亚克隆到pLPCmyc的BamHI和 EcoRI位点以给出myc-标记的蛋白质。根据厂商说明使用Nucleobond PC 500试剂盒 (Macherey-Nagel)扩增构建体。
Y27632购自calbiochem并在所有实验中以10 μ M使用。
小鼠抗-E-钙黏着蛋白(克隆36)、小鼠抗β 1-整合蛋白、小鼠抗-ROCK I和小鼠抗-ROCK II抗体购自BD-转导实验室并分别以1/400° ,1/2500° ,1/250°和1/250°进行稀释。小鼠抗jhoA和兔抗-ECT2抗体购自Santa Cruz (分别为和C-20)并分别以1/500°和1/200°进行稀释。小鼠抗-GEF-Hl抗体由K. Matter馈赠并以1/50°进行稀释。兔抗-P53抗体(CMl)由J. C. Bourdon馈赠并以1/1000°进行稀释。
辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗IgG抗体购自GE-Healthcare并以1/5000°进行稀释。
Western Lightning Chemiluminescence (ECL)试剂购自 PerkinElmer0
细胞培养和转染
Hctll6细胞由B. Vogelstein馈赠并在有5% C02存在时、在37°C培养于添加了 10%胎牛血清(FCS)的McCOY，5A培养基(Sigma)。
根据厂商说明使用JetPei试剂盒(Qbiogen)进行同种型的瞬时转染使用9μ g 的DNA转染一个70%铺满率细胞的IOOmm盘。在转染M小时后，以倍率稀释细胞并且所有试验在转染后48小时进行。根据厂商说明使用Lterferin(P0Iyplus)进行50ηΜ siRNA的瞬时转染。
延时成像
在配有自动快门和GFP滤光镜组、63χ油浸物镜(HC χ PL APO 1. 32-0. 6油CS) Leica DMIRE2倒置显微镜，样品加热器(37°C )和国产C02培养箱上进行延时诺马尔斯基 (nomarski)显微术。Wmicromax CCD相机(1300Y/HS)成像软件捕获图像，转换成TIFF文件并以metamorph进行编辑和编纂。对于GFP曝光时间为500ms而对于光为300ms。在5 分钟内每3秒捕获一次影像或12小时内每4分钟捕获一次。
FACS
用未用于侵袭测定的以GFP标记的p53同种型转染的细胞以1200rpm旋转5分钟并通过加入ImL的70% KOH在-20°C进行固定。进行碘化丙啶染色，并通过用CellQuest 软件和FACS定量和每个条件下的总细胞相比较的表达GFP的细胞的数目。
细胞抽提、Western印迹
以1200rpm旋转包含出泡细胞的培养基5分钟并裂解由出泡侵袭细胞构成的沉淀。在裂解缓冲液中轻柔刮掉剩余的贴壁细胞。分别分析每个条件下的两群细胞(见图示)。以BCA试剂盒(promega)定量每一提取物中的总蛋白质量。使用8% SDS-PAGE凝胶检测E-钙黏着蛋白、β 1-整合蛋白、ROCK 1、ROCK 2、ECT2和GEF-Hl，并用12 % SDS-PAGE 凝胶检测ΜιοΑ。在每一泳道上样等量(30yg)的蛋白质。然后通过电泳转移蛋白质到硝酸纤维素(对于P53、E-钙黏着蛋白、β 1-整合蛋白、ROCK UROCK 2、ECT2和GEF-H1)或 PVDF (对于GTP-IihoA)膜。在包含3%牛奶的TBS/0，1 % Tween 20中封闭膜一个小时，并随后以稀释在包含3%牛奶的TBS/0，Tween 20中的一抗孵育过夜。在TBS/Tween中洗涤几次后，以连接于HRP的抗-兔或抗-小鼠Ig抗体孵育膜。根据厂商说明，以ECL显影膜。
使用AIDA/2D密度测定软件定量扫描的放射自显影。
IihoA活性测定
对于RhoA 活性测定，在 50mM Tris, ρΗ7· 2,1% Triton Χ_100、0· 5%脱氧胆酸钠、 500mM NaClUOmM MgC12、lmM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物中裂解细胞。在4°C、以25yg 的包含Miotekin的IihoA结合结构域的商业化GST融合蛋白质(GST-RBD，细胞骨架)珠子孵育净化的裂解物 30 分钟。在含 Triton X_100、150mM NaClUOmM MgC12、0. ImM PMSF的Tris缓冲液中洗涤沉淀的复合物四次，以SDS样品缓冲液洗脱、并以特异于Mio A的抗体进行免疫印迹和分析。同时跑样用于沉淀的一等份总裂解物以定量细胞裂解物中存在的总ΜιοΑ。使用Aida/2D密度测定软件定量扫描的放射自显影，并标准化为MioA蛋白表达的函数。
侵袭分析
在包含荧光封闭聚碳酸酯微孔膜插入(Fluoroblock ；#351152 ；BD Biosciences ； 孔径8μπι)的Transwell细胞培养小室中进行细胞侵袭的定量。在"Transwell中制备 100 μ 1的含减少的(reduced)生长因子(来自Englebreth-Holm-Swarm肿瘤的商业制备的重组 BM，#；354230 ;BD Biosciences)的 2mg/mL Matrigel。在胰酶消化和于 Transwell 上层小室中包含的Matrigel的厚层(约500 μ m)顶部铺板上于含2% FCS的培养基中铺板 (10. IO4)之前，细胞作为单层被转染并以Y27632处理或不以Y27632处理。留下对照不予处理。然后将上层和下层小室分别填充含2% FCS的培养基和含10% FCS的培养基，从而建立允许细胞通过Matrigel的侵袭的化学吸引剂的可溶性梯度。在3. 7%甲醛中固定15 分钟之前，允许细胞在37°C、5% CO2下侵袭通过凝胶。通过GFP荧光检测过滤器下方的侵袭通过Matrigel的细胞并计算细胞数。计数过滤器的所有表面，并在每个条件下的三重复中进行两次的每一个测定。
乳腺癌患者
分析来自具有达到诊断要求的足够肿瘤组织剩余物和完整的临床和病理资料的 171名白人妇女(年龄范围M-89岁，年龄中值64岁)的原发性、以前未经治疗的可行手术的乳腺肿瘤。由专门的乳房病理学家显微解剖(macrodissect)肿瘤组织并在_80°C存储前速冻于液氮。从无乳腺癌个人或家族病史的正进行缩乳术的患者处获得正常的乳腺组织。经由泰赛德组织银行(Tayside Tissue Bank)授予权力的当地研究伦理委员会(Local Research Ethics Committee)的批准检查样品。
RT-PCR 分析
在750 μ 1 QIAzol 裂解试剂(Qiagen Ltd, Crawley, West Sussex,英国)中勻浆大约IOmg的肿瘤组织(> 40%的肿瘤细胞)，并用BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto，CA，美国)证实抽提的RNA质量，证明在RT-PCR之前有两个尖峰的 28S/18S 彡 1. 5。
p53同种型cDNA太长而不能用RT-qPCR特异定量，因此我们使用需要高质量总 RNA(28S/18S比例> 1.5)的半定量RT-PCR法。在使用随机引物反转录500ng总RNA之后， 以PCR扩增肌动蛋白cDNA以验证反转录效率。(AMV RT，45C，随机引物)反转录来自每一肿瘤样品的0. 5 μ g总RNA并通过以30个循环的PCR扩增肌动蛋白确定cDNA质量。使用之前所述的(Bourdon等，2005a)特异于每一同种型的引物通过30个循环的两个巢式PCR 扩增P53同种型cDNA。在测序相应PCR片段之后认为肿瘤表达每个p53同种型。
P53 突变分析 AmpliChip p53 试验
AmpliChip p53 1 ! ^!:^- Roche Molecular Systems, Inc (Pleasanton, California，美国)开发中的产品。此试验需要福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织的一个 10微米切片或是来自新鲜冷冻肿瘤的IOOng纯化的基因组DNA。在此研究中，抽提自勻质化的冷冻组织的IOOng基因组DNA被用于在两个反应(A和B)中扩增涵盖p53基因的编码区的产物。反应A扩增外显子2、5、8、10、及具有内对照的外显子4上游序列，而反应B扩增外显子3、6、7、9、11、及具有同样的内对照的外显子4下游序列。合并从A反应和B反应中生成的PCR产物用于DNA酶I切割以生成平均大小为50-100个核苷酸的小DNA片段。随后通过末端转移酶以生物素标记片段化的DNA扩增物。将生物素标记的p53靶DNA片段加入到杂交缓冲液中。使用 Affymetrix GeneChip Fluidics Station 450Dx 和 AmpliChip p53 特异规程杂交混合物于位于AmpliChipp53芯片上的寡核苷酸。洗涤杂交的AmpliChip p53 芯片并用链霉亲和素偶联的荧光染料(藻红蛋白)染色。染色后，以Affymetrix GeneChip karmerfOOODx、使用激发结合于杂交的p53靶DNA片段的荧光标记的激光扫描AmpliChip P53芯片。发射光的量与探针芯片上每个位置的结合的靶DNA成正比。
芯片设计和芯片信号的数据分析
Roche Molecular System设计的AmpliChip p53芯片由对于外显子2-11编码区的总共1268个核苷酸位置所铺设的220，000以上的单独寡核苷酸的超过33，000个探针组组成。探寻碱基位置的单个探针组包括五个探针，一个探针用以杂交野生型，三个探针来检测三个可能的单碱基对突变，还有一个探针用以检测单个删除。对于每个核苷酸位置有至少M个探针组，包括正义和反义探针序列。AmpliChip p53芯片由AfTymetrix使用结合光刻方法和组合化学的技术制造。通过Roche Molecular System开发的p53突变检测算法确定P53突变状态，该算法设计用于检测在野生型P53DNA探针强度背景下的样品的单碱基对置换和单碱基对删除。
统计学分析
用卡方SPSS统计学软件(需要ref)、双尾Fisher精确检验和Kaplan-Meier分析进行统计学分析。置信度大于95% (P ^ 0. 05)的结果被判定具有显著性。
实施例2 分析乳腺癌患者中的Δ 133ρ53 β表达
分析来自具有达到诊断要求的足够肿瘤组织剩余物和完整的临床和病理资料的 171名白人妇女(年龄范围Μ-89岁，年龄中值64岁)的原发性、以前未经治疗的可行手术的乳腺肿瘤。
结果
在171个乳腺癌中，鉴定到50/171( % )中表达Δ 133p53,20/171 (11 % )中表达Δ133ρ53β及27/171 (16%)中表达Δ 133ρ53 γ，而在正常乳腺组织中未检测到这三个同种型。
Δ 133ρ53 β表达与腋窝淋巴结转移相关(Marm-Whitney分析，精确单尾，ρ
<0.036)，并且与此一致，具有表达Δ133ρ53β的肿瘤的患者有显著的恶化无病生存率 (worse disease free survial) (log-rank, Cox-Mantel, ρ < 0. 025)(图 la)禾口总生存率 (log-rank, Cox-Mantel, ρ < 0. 025)(图 lb)。
Δ133ρ53β与低ER表达显著相关(χ2 = 4. 1，χ d. f.，分别为ρ < 0. 043)，特别是对于侵袭性导管癌(乳腺癌的最常见病理类型)来说(142/171例)(成对t-检验，ρ
<0. 015)。
图加显示，表达Δ 133ρ53 β的ER阳性患者比无Δ 133ρ53 β表达的ER阳性患者具有显著恶化的无病生存率(log rank, Cox-Mantel, ρ < 0.0002，成对比较 Δ 133ρ53 β +ER+ X^t Δ 133ρ53 β -ER+, ρ < 0. 003) 此外，图 2b 显示表达 Δ 133ρ53 β 的 ER阳性患者相对于ER阴性患者具有意想不到的低生存率(生存率log rank, Cox-Mantel, ρ < 0.0003，成对比较 A133p53^+ER+^ER-, ρ < 0.658)。
因此Δ133ρ53β与原发性乳腺癌的不良预后特征(腋窝淋巴结转移，ER阴性)、 较短无病生存率和更差预后相关。
实施例3 在侵袭过程中Δ 133ρ53 β同种型的主要作用
首先，使用侵袭测定(见方法)检验了 GFP标记的Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ133ρ53β同种型的表达对于保留上皮特征并表达野生型ρ53的结肠和乳腺癌细胞 (hctll6用于结肠癌及MCF7用于乳腺癌)侵袭的影响。
GFP单独转染的细胞被用作阴性对照。在再现生理基底膜的matrigel的厚层顶部铺细胞。此体外测定目的在于模拟肿瘤细胞穿过基底膜的进程。
图3a显示，Δ133ρ53β同种型的表达显著增加了侵袭。以MCF7获得了类似的结果(数据未显示)。这意味着异位Δ133ρ53β同种型的过表达可以克服内源性ρ53的抗迁移活性。
为确定表达ρ53同种型的细胞使用何种方式的迁移以侵袭经过matrigel，对表达 GFP标记的同种型的HCT 116细胞进行摄影。观察到了两群细胞贴附在玻璃上的粘合上皮细胞和粘合细胞之上的圆形细胞(位于上层焦点)。以GFP标记的Δ133ρ53β同种型转染的细胞在其表面生成动力学泡样结构。在摄像期间，一些圆形细胞移动了而一些粘合贴壁细胞逐步从上皮细胞脱离并变成圆形(数据未显示)。粘附结构的丧失和同时获得的圆形出泡运动与上皮阿米巴样转换(印ithelial-amoeboid transition, EAT)惊人地相似。以 FACS对照认识到这些出泡运动不是因为凋亡所致(数据未显示)。
为定量表型的外显率，从粘合细胞中分离圆形的细胞并用FACS计数两个群体中的GFP阳性细胞对于Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ，出泡细胞的数目分别比贴壁细胞数目升高了 2. 5和2. 25倍，而对于Δ 133ρ53 β，出泡细胞的数目比贴壁细胞数目升高了 4倍(图 4a)。总结一下，此表型是显著外显性的，即表达GFP标记的Δ133ρ53β同种型的细胞大部分采取圆形形态且细胞从上皮细胞脱落。
在EAT期间，首先分离紧密连接，然后是之后的粘着接消失。由于E-钙黏着蛋白是粘着连接的基本组分，它被广泛用作这些连接完整性的特异标记。在表达Ρ53的细胞中， E-钙黏着蛋白在贴壁粘合细胞中以高水平表达而在出泡细胞中E-钙黏着蛋白表达丧失 (图4b)，证明出泡细胞丧失了关键的表皮细胞特征。
已经历EAT的肿瘤细胞表达低水平的β 1-整合蛋白，并因此采取不依赖于整合蛋白-粘附过程的阿米巴样迁移。评估了在表达Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β同种型的hctll6细胞中β 1-整合蛋白的表达。对于E-钙黏着蛋白，出泡细胞不表达β -整合蛋白(图4c)。用myc-或GFP-标记的同种型获得了同样的结果。以使用抗myc抗体的 western印迹调控myc-标记的同种型的表达(数据未显示)。
这些结果显示，N末端删除的p53同种型的表达促进了 hctll6细胞中上皮-阿米巴样转换，其因此通过圆形出泡运动进行迁移。这种方式的迁移比间充质迁移更为有效，说明肿瘤中这些Δ133ρ53β变体的表达与患者的不良预后相关。这加强了这样的观点，即适当调节ρ53同种型表达的失败对肿瘤进展和转移造成巨大的后果。
因为圆形出泡相关的运动模式依赖于ROCKO^ho激酶)信号，在ROCK抑制剂Y27632存在时进行侵袭测定。规程如上所述。
结果显示，Y27632处理高度降低了转染细胞的侵袭性，表明ROCK活性为Δ 133p53 同种型表达所提供的侵袭性所必需。
近来，据报道两个同源ROCK可能在功能上不等同。为确定是否两个ROCK同种型对于P53同种型依赖性圆形出泡相关运动有相同的影响，研究了转染细胞中ROCK I和ROCK II的表达。结果显示，粘附细胞中ROCK I表达增加(与对照细胞相比，T)但在出泡细胞中显著降低。相反，在所有情况下ROCK II均高水平表达，并且特别是在出泡细胞中维持。这意味着，ROCK II为出泡运动所优先需要，而ROCK I可能在上皮-阿米巴样转换的前期步骤中涉及。尽管其具有高序列同源性(65%的总体同一性和在其激酶结构域内的92%同一性)，ROCK I和ROCK II不以冗余的方式作用在敲除小鼠内ROCK I不能补偿ROCK II的损失，并且两个同种型调控肌球蛋白II活性的不同方面。因此第一次显示了两个ROCK同种型在阿米巴样迁移和随后的侵袭中的不同意义。
在圆形出泡运动中ROCK-驱动的肌动蛋白重组在很大程度上依赖于MioGTP酶家族蛋白MioA。
为研究p53同种型在ROCK信号上行使其功能的机制，检查了表达3个Δ 133ρ53 同种型的粘附或出泡细胞的MioA表达。
当细胞表达或不表达ρ53 Δ 133同种型的时候，RhoA的总水平是相同的(数据未显示)。此表达在出泡细胞中得以维持。然而，该蛋白质的表达水平不反映激酶活性。使用只捕获活性的GTP结合形式的IihoA的pull-down测定比较了表达或不表达Δ 133ρ53同种型的粘附对出泡细胞的MioA活性。首先，我们观察了粘附上皮细胞中的MioA基础活性。 然而，在出泡细胞中此活性大大增加。有趣的是，以Δ 133 β-ρ53获得的增加比那些以其他同种型(Δ 133-ρ53和Δ 133 γ -ρ53)获得的增加高2. 5-3倍，其与Δ 133 β -ρ53表达细胞丧失表面粘附的重要能力相关。
问题在于，是否Δ 133-ρ53同种型表达的细胞中MioA的激活是由于鸟嘌呤交换激活因子(GEF)的过表达引起。研究聚焦于MioA的两个GEF，它们均涉及介导MioA的ρ53依赖性调控=GEF-Hl，其被发现被突变ρ53激活，并且其表达与肿瘤细胞中的ρ53状态强烈相关；及ECT2，其已知是野生型ρ53的转录靶标并且其涉及上皮连接的调控。
已发现，在表达3个ρ53同种型的出泡细胞中过表达了 GEF-Hl。相比而言，与贴壁细胞相比，在出泡细胞中ECT2的表达降低。在出泡细胞中ECT2的此下调与其已知作为上皮连接调节剂的功能相适应，但不涉及MioA激活，该激活可能依赖于GEF-Hl的上调。这表明了在上皮-阿米巴样转换期间GEF-Hl和ECT2的不同作用。结果与当转染小鼠成纤维细胞时GEF-Hl的转化能力及当在裸鼠中注射以GEF-Hl转染的细胞会诱导肿瘤相一致。I^hoA 下游的两个相反途径对于粘附连接的调控起作用R0CK依赖性途径涉及破坏上皮连接，及 Dia依赖性路径促进钙粘蛋白-连环蛋白复合物的形成及连接的稳定。一个可能是这两个通路为I^hoA的两个不同GEF所激活ECT2能激活I^hoA-Dia途径以促进粘附连接，因为此 GEF调控上皮极性，而GEF-Hl能激活MioA-ROCK途径以破坏细胞-细胞连接并促进上皮-阿米巴样转换。P53是这两个通路的上游介导物，而且p53的Δ 133同种型的表达在肿瘤发生期间使两个通路的平衡失去调控。
数据显示，Δ133ρ53同种型(在N端结构域删除的同种型)的失调表达赋予给肿瘤细胞增加的活动性和侵袭性。这表明改变P53同种型的比例有利于增加肿瘤细胞的肿瘤侵略性并增强转移能力，并且突出了癌症发展期间剪接事件的重要性。
权利要求
1.一种检验被认为是倾向于具有转移性癌症的受试者的方法，其包括步骤i)分析来自所述受试者的生物样品来检测选自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ 的ρ53同种型的存在，所述同种型的存在是转移性癌症的指示物。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中ρ53同种型的存在对应于ρ53同种型表达水平的确定，所述方法包括将检测的Ρ53同种型表达水平与阈值相比较的另一步骤。
3.一种用于测定受试者中癌症侵袭性的方法，其包括步骤i)确定来自所述受试者的生物样品中选自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的 Ρ53同种型的存在，所述同种型的存在是侵袭性癌症的指示物，优选地，所述同种型是转移性癌症的指示物。
4.一种用于确定受试者对于抗癌治疗的反应的方法，所述受试者正接受或已接受对癌症相关状态的治疗，其包括步骤i)确定来自受试者的生物样品中选自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同种型的表达水平，及 )将其与阈值相比较。
5.根据上述权利要求
任一项所述的方法，其中p53同种型是Δ133ρ53β。
6.根据上述权利要求
任一项所述的方法，其中通过检测ρ53同种型多肽或其片段、或通过检测Ρ53同种型mRNA或其片段评估检测选自Δ 133ρ53 β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的 ρ53同种型存在的步骤。
7.根据上述权利要求
任一项所述的方法，包括扩增所述ρ53同种型mRNA或cDNA、其互补序列或其具有特异于所述P53同种型的至少10个核苷酸长度的片段的另一步骤。
8.根据上述权利要求
任一项所述的方法，其中通过能特异杂交于所述p53同种型 mRNA、其互补序列或其具有特异于所述p53同种型的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸长度的片段、优选杂交于具有序列SEQ ID N0:2的A133p53i3mRNA的探针进行选自Δ 133ρ53 β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同种型存在的确定。
9.根据权利要求
1至7任一项所述的方法，其中通过下列方法确定选自Δ133ρ53β、 Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同种型的mRNA的存在，该方法包括步骤(a)在杂交条件下将生物检验样品于特异于所述p53同种型的核酸探针接触，该样品包括-分离自人类受试者生物样品的RNA分子，其中生物样品疑似包含肿瘤细胞，或-自分离的RNA分子合成的核酸分子如cDNA ；其中核酸探针具有包括P53同种型序列的至少15个核苷酸长度的片段、或其片段、或其互补物，及(b)检测核酸探针和检验样品的杂交物的形成；其中杂交物的存在表明获自人类受试者的组织中转移性癌细胞的存在。
10.根据权利要求
1至7任一项所述的方法，其中通过将特异于P53同种型多肽或其片段的抗体接触生物样品并确定抗体与生物样品的结合来确定选自Δ 133ρ53β、Δ 133ρ53 和Δ133ρ53γ的ρ53同种型存在。
11.一种筛选潜在抗转移性癌的化合物的方法，其包括步骤a)可选地测定已知表达选自Δ 133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同种型的细胞中所述P53同种型的表达水平；b)将待检验化合物与所述细胞接触；c)通过根据权利要求
1至10所述的检测所述p53同种型的方法确定所述p53同种型的表达水平；及d)如果p53同种型在细胞中未表达、或具有低于步骤a)之前的表达水平，选择所述化合物作为潜在的抗转移性癌的化合物。
12.一种根据上述权利要求
任一项所述的方法，其中癌症是乳腺癌或结肠癌。
13.一种用于生产特异识别选自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ多肽的ρ53同种型多肽的多克隆抗体的方法，其中此方法包括步骤a)以免疫有效量的选自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同种型多肽、或针对所述多肽的至少9个氨基酸长度的特定表位片段，可选地与增强载体制备物一起免疫哺乳动物；b)可选地，体外确定动物血清或血浆中特异抗体的存在；及c)自动物血清或血浆纯化或分离特异性抗-Δ133ρ53 β、抗-Δ 133ρ53或抗-Δ133ρ53γ多肽的抗体。
14.一种用于生产能分泌特异识别选自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ多肽的 Ρ53同种型的单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，其中此方法包括步骤a)以免疫有效量的选自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同种型多肽、或针对所述多肽的至少9个氨基酸长度的表位片段，可选地与增强载体制备物一起免疫哺乳动物；b)自该哺乳动物的脾、淋巴结或外周血分离生产抗p53同种型肽的抗体的淋巴细胞；及c)通过将所述淋巴细胞融合于同种哺乳动物骨髓瘤系永生化生产抗_Δ133ρ53β、 抗- Δ 133ρ53或抗- Δ 133ρ53 γ多肽的抗体的淋巴细胞。
15.一种用于生产特异识别选自Δ 133ρ53 β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ多肽的ρ53同种型的单克隆抗体的方法，其中此方法包括步骤a)根据权利要求
15所述的方法，生产能分泌特异识别选自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和 Δ 133ρ53 γ多肽的ρ53同种型的单克隆抗体的杂交瘤细胞；b)在合适的培养基和培养条件下培养此杂交瘤细胞；c)自此培养基纯化或分离分泌的单克隆抗体。
16.一种用于检测或定量选自Δ 133ρ53β、Δ 133p53和Δ 133p53 γ mRNA或多肽的p53 同种型的试剂盒，其中此试剂盒包括a)特异识别所述p53同种型的多克隆或单克隆抗体；或b)选自能够扩增序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6、或其具有至少10个核苷酸长度的片段的一对引物的一对引物；或c)具有包括选自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同种型序列至少10个核苷酸长度的片段或其互补物的核苷酸序列的探针。
专利摘要
本发明涉及一种检验被认为倾向于具有转移性癌症的受试者的方法，其包括步骤i)分析来自所述受试者的生物样品以检测选自Δ133p53、Δ133p53γ和Δ133p53β的p53同种型的存在，所述p53同种型的存在是转移性癌症的指示。
文档编号C12Q1/68GKCN102471801SQ201080029421
公开日2012年5月23日 申请日期2010年6月30日
发明者C·安吉耶, G·加德亚, J-C·鲍登, K·费尔南德斯, P·鲁, S·维诺 申请人:国家科学研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan