专利名称:表达载体及应用微藻产生油脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种可在微藻中表达外源基因的表达载体，特别是涉及利用此表达载体提高微藻产油效率的方法。
背景技术：
微藻(microalgae)是一群微型生物的总称，包括众多真核和原核种类。微藻可以直接利用太阳能生产高品质的蛋白质和其它营养物质以及特殊生物活性物质。实际上微藻广泛应用在食品、饲料、医药等领域，生产例如藻体粉、长链不饱和脂肪酸、色素蛋白、或藻多糖等。近年来，随着原油价格飞涨及使用化石燃料引发的全球暖化问题，利用微藻制造生物燃料的构想也持续受到全球关注。
美国专利申请公开号US2010/0167339A1记载提高微藻浓度的条件及步骤，利用固体颗粒激烈搅动微藻，使其破裂，形成微藻浆，以吸收性泡沫分离步骤处理微藻浆，而形成流动性佳的藻体生物质，可应用于生物燃料中。
鉴于微藻的应用前景及高价值化，利用遗传工程改良微藻细胞中的基因产物，已被广泛使用。例如美国专利申请US2009/0176272A1记载一种生产生物燃料用的核酸序列的表达，使编码与形成丙酮酸脱氢酶复合体的脂肪酸生物合成相关的蛋白的基因通过重组质粒pDs69i 在藻体中表达，提高脂肪酸的产量。
W02009/073822A2揭示一种提高微藻生产生物燃料的基因及化学工程策略，通过包含一表达盒、一基因堆栈表达载体及一表达载体的重组藻体所达成，其中该表达盒包括抑制编码Cao、LHCII-b、DC、PFL1/PFLA或AGP酶的蛋白质的代谢基因表达的siRNA分子； 该基因堆栈的表达载体包括编码ACCase、DGAT, caleosin及oleosin多肽的核酸序列；以及该表达载体包括编码PCC 7942ftp-l基因的核酸序列。
本发明人等鉴于先前技术的繁复操作步骤及产生油脂的效率，根据微藻的生理特性，设计新颖的表达载体，通过基因工程重组产油相关基因，突破野生型微藻无法兼具高光合效率、高二氧化碳固定效率及生长速率的特性，在传统的微藻培养系统中，提高产油效率。
发明内容
本发明的一个实施方案中，提供一种表达载体，包括一蛋白质表达盒以及至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒的两侧；其中该蛋白质表达盒包括第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子的下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(Cauliflower mosaic virus ;CaMV) 35S启动子、1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose bisphosphate carboxylase ；RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase ；AMT)启云力子、硝酸盐还原酶(nitrate reductase ； NR)启动子或上述组合。
本发明的另一个实施方案中，提供一种在微藻中表达蛋白质的方法，包括将一外源基因克隆入上述表达载体中；将该具有外源基因的表达载体转化至微藻中，以及表达该外源基因。
本发明的另一个实施方案中，提供一种应用微藻产生油脂的方法，包括提供一种如上述的表达载体；将至少一外源基因插入该多重克隆位点；将该具有至少一外源基因的表达载体转化至微藻中；以及于微藻中表达该至少一外源基因；其中，该外源基因包括编码与脂质生物合成相关的酶的基因或与前述基因的序列同一性至少为80%的基因。在本发明的一种具体实施方案中，该外源基因选自下组编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO :1 6)、甘油_3_磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因(SEQ IDNO 7 10)、编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因(SEQ IDNO :11 12)、编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、编码乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO :22)、编码碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ IDNO :23)、以及与前述任一基因的序列同一性至少为80%的核苷酸序列。
本文所述的”表达载体”意指可将特定基因导入宿主细胞中使该基因表达的核酸分子，通常为质粒，例如Ti质粒(tumor inducing plasmid)、pBI121 二元载体(binary vector)、pBluescript II SK+噬菌粒(phagemid)、或类似的载体或质粒。为了基因的表达， 表达载体通常还包括调控序列(regulatory sequence)，例如增强子(enhancer)、启动子 (promoter)等；以及报道基因(importer gene)，例如编码荧光蛋白质的核苷酸序列。为了进行克隆(cloning)，表达载体通常还包括筛选基因，例如抗生素基因；以及多重克隆位点 (multiple cloning site ；MCS)。
本文所述的”蛋白质表达盒”(protein expression cassette)意指由一个以上的基因及控制该基因表达的序列所组成的表达蛋白质的盒。表达盒通常为表达载体的一部分，用于克隆及转化。一般来说，表达盒可包括启动子序列、开放阅读框(open reading frame)、该基因表达所需的核苷酸序列、或转化于宿主细胞所需的核苷酸序列。
本文所述的”同源重组 DNA 片段”(homologous recombinant DNAfragment)意指可与同源DNA序列配对进行交换的序列片段，分别位于该蛋白质表达盒的两侧，该”两侧” 代表位于两翼位置(flanking)，即，紧邻该蛋白质表达盒的上游(5’侧翼位置)及下游(3’ 侧翼位置)。例如可与植物细胞的遗传物质同源交换的序列，可包括T-DNA序列中的左端 (left border ；LB)及右端(right border ；RB)，例如 SEQ ID NO 24 或 25 所示的序列、其部分序列、或的上述组合，但没有特别限定。同源重组DNA片段可根据表达载体或宿主细胞的特性等条件以公知的DNA重组技术适当设计、合成。
本文所述的”筛选标记”包括用于特定基因的克隆及报导，例如编码卡那霉素 (Kanamycin)抗生素的基因、编码的遗传霉素(Geneticin ；G418)抗生素的基因、编码博莱霉素抗生素(Zeocin)的基因、编码潮霉素抗生素(Hygromycin)的基因、编码红色荧光蛋白 (DsRed)的基因、编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因、编码蓝色荧光蛋白(BFP)的基因、或类似的基因。筛选标记基因可根据表达载体的特性及克隆的基因性质适当设计，没有特定的限制。
本文所述的”启动子”意指在基因表达时容许RNA聚合酶连接的核苷酸序列，为转录作用(transcription)的开始。本文的启动子的设计，考量欲表达的核苷酸序列及表达载体的性质，可采用单启动子、双启动子或多启动子的模式，以提高欲表达基因的表达量。
本文所述的”多重克隆位点”意指具有一个以上的限制性酶切位点的序列片段，邻接于启动子的下游，该”邻接”表示其间隔距离仅为数个至数十个核苷酸以内，且仍然操作性连接(operatably linked)于启动子，可受启动子的调控。常用的限制性酶切位点，例如 SacI> Ecol、XbaI> Spel、SmaI> EcoRI> Hindlll、AccI、Sail、Scil、ApaI> KpnI> Acc65I、 MRrh4273I、MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、或 PspOMI等，可依克隆的基因片段适当设计。
本文所述的”外源基因”，又可称为”异源基因”表示来自与宿主细胞不同种的生物体的基因或核苷酸片段。
本文所述的”序列同一性”(sequence homology)意指不同的核苷酸序列中碱基的相似度。序列同一性可通过例如 BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)、 FASTA(http://www. ebi. ac. uk/Tools/sss/fasta/)等公知软件比对两种以上的核苷酸序列而获得相似度。序列同一性愈高的序列，通常表示具有相似的生物活性或在演化分类中具有相近的亲缘关系。
本文所述的”微藻”泛指微型生物，更具体地说，包括小球藻(Chlorella sp.)、微星藻(Micractinium sp·)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、拟球藻(Nanno ch loropsis sp·)、雨生血红藻(Haematococcus sp.)、栅藻Gcenedesmus sp.)、或这些藻类的组合。
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本文的表达载体的设计主要着眼于可在微藻中表达特定基因的载体，特别是与产生脂质相关的基因。
本文一实施例选用pBluescript II SK+噬菌粒(phagemid)作为表达载体的骨架。 pBluescript II SK+噬菌粒为商业上可购买的质粒，包含具有21个限制性酶切位点的多重克隆位点、大肠杆菌(E.coli)的复制起始点(ColEl ori)、及T7与T3启动子等区域，为公知用于克隆DNA片段的表达质粒。
在此实施例中，如第IA IE图所示，利用pBluescript II SK+噬菌粒为骨架，经由限制性酶作用连接卡那霉素(Kanamycin)抗生素基因(KanK)以及农杆菌 (Agrobacterium)的基因复制起点(Inc W ori)。
另一方面，此实施例选用植物转化用的表达载体pBI121进行再构建 (reconstruction)。表达载体pBI121已知具有T-DNA部位，该T-DNA部位包含一表达盒具有花椰菜叶病毒(Cauliflower mosaic virus) 35S启动子(PCaMV35S)、胭脂碱合酶(nopaline synthase ；N0S)启动子(PNOS)及新霉素磷酸转移酶II (neomycin phosphotransferase II ；NPTIIe)作为G418的筛选基因，以及位于该表达盒两端的左端 (left border ；LB) (SEQ ID NO :24)及右端(right border ；RB) (SEQ ID NO :25)。当该 PBI121载体进入宿主细胞后，T-DNA部位的核苷酸序列由于左端(LB)及右端(RB)与宿主细胞的基因进行同源交换(homologous recombination)，使左端至右端的间基因可嵌入宿主细胞的遗传物质中，而使该部分的基因被表达。
此实施例中，选用pBI121进行再构建，在其T-DNA部位以限制性酶作用连接编码红色荧光蛋白(DsRed)的基因或编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因及编码蓝色荧光蛋白(BFP)的基因、以及在紧邻多重克隆位点的上游连接花椰菜叶病毒(Cauliflowermosaic virus) 35S 启云力子(Pcaiv35s)。
之后，利用聚合酶链式反应(PCR)使pBI121载体上的左端至右端的核苷酸序列扩增(amplification)后，接合至上述重组的pBluescript II SK+噬菌粒，形成本文一实施例的表达载体(该表达载体保藏于德意志微生物及细胞培养物保藏中心(DEUT SCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UNDZELLKULTUREN GmbH ;DSMZ)，保藏日期为 2010 年 10 月 3日，保藏编号DSM 24099o
本文的表达载体，除上述的花椰菜叶病毒(Cauliflower mosaic virus) 35S启动子(PcaMv35s)以外，也可连接源自菊花(Chrysanthemum morifolium)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶 / 力口氧酶小亚基启云力子(Ribulose bisphosphate carboxylas印romoter ;PKBCs)、源自小球藻(Chlorella virus)的腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase ；AMT)启动子、源自小球藻(Chlorella vulgaris)的硝酸盐还原酶(nitrate reductase ；NR)启动子、或上述启动子的组合。
由于此表达载体中LB至RB的序列可通过同源交换的方式，使该段序列嵌入宿主细胞的遗传物质中，而使该段序列被表达。再者，此表达载体包含抗生素基因与荧光蛋白基因的双筛选标记基因以及CaMV 35S启动子(PCaMV35S)、RBC启动子(Pkbcs)、AMT启动子(Pamt)、 NR启动子(Pnk)的多启动子。通过双筛选标记及多启动子模式，此表达载体可提高对宿主细胞的筛选效率及克隆基因的稳定性，使后续连接于多重克隆位点上的特定基因容易表达。 而且表达载体上的多重克隆位点，可连接感兴趣的核苷酸序列。为了达到提高生体内脂质生产量的目的，本文一实施例于多重克隆位点连接编码与脂质生物合成相关的酶的基因。 然而本发明的表达载体不限于连接此序列片段，此技术领域：
中具有通常知识者可依其它目的，于上述表达载体的多重克隆位点连接感兴趣的核苷酸序列，这些变化或应用也包含于本文发明的范围。
上述所谓”限制性酶作用”表示利用相同的限制性酶剪切欲克隆的DNA片段及载体，使两者具有可互相配对(互补)的核苷酸端，在碱基间形成氢键而连结克隆的DNA片段及载体。此述的限制性酶没有特别限定，可根据克隆的片段及载体特性等条件适当设计。
上述”聚合酶链式反应(PCR) ”为使用DNA聚合酶、寡核苷酸的引物对、模板及脱氧核糖核酸(dNTP)，通过温度设定使模板变性(denaturation)、模板与引物黏合(anneal)、 及根据模板的核苷酸序列扩增DNA的方法。选用的引物对可根据欲扩增的DNA片段选择商业上可购买的套组，也可视需要适当设计。引物对包括与模板5’端黏合的正向引物及与模板3’端黏合的反向引物，分别使模板的双股DNA序列各自复制、扩增。为避免引物的碱基自行配对而降低与模板的黏合及造成非特异性的PCR反应，引物的设计可利用BLAST软件 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)等分析引物内的碱基相似度。PCR的反应温度可设定为， 94 95°C进行30 60秒、55 56°C进行30 60秒及72 73°C进行1 2分钟为1次循环，进行20 40次循环。
上述所谓”与脂质生物合成相关的酶”是指于生物体内合成脂肪酸、三酸甘油脂及脂质的相关酶，特别是在植物体内合成脂质的关键酶。
植物体内脂质的合成途径可分为两部分，一部分于叶绿体中进行脂肪酸的合成， 另一部分于内质网中进行脂肪酸的聚合，即合成甘油三酯(TGA)，又称为Kennedy pathway.
简单地说明如图2所示，图2左图表示在叶绿体中进行的脂肪酸生物合成，包括来自光合作用、糖酵解作用或卡尔文循环(Calvin cycle)间接形成的乙酰辅酶A (acetyl-CoA)。乙酰辅酶A (acetyl-CoA)经由乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase ；FAS)、硬脂酰-ACP 不饱和酶 (stearoyl-acyl carrier protein (ACP) desaturase ； Δ 9-desaturase)、酉先基-ACP 硫化酉旨酶(acyl-ACP thioesterase)、及酰基-CoA 合成酶(acyl-CoA synthase)，形成非脂化脂肪酸(non-esterified fatty acid ;NEFA)、细胞质中的酰基辅酶A (acyl-CoA)及二羟丙酮磷酸(Dihydroxyacetone phosphate ；DHAP)。
细胞质中的酰基辅酶A (acyI-CoA)与甘油_3_磷酸(G_3P)为内质网中三酸甘油脂合成途径(Kennedy pathway)的底物，经甘油_3_磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydroxylase ；G3PDH)把二羟丙酮磷酸(Dihydroxyacetone phosphate ；DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G-3P)。如图2右图表示在内质网中进行的Kennedy pattiway，包括第1步骤利用甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase ；GPAT)，将甘油-3-磷酸(G-3P)转化为溶血磷脂酸(Lyso-PA)；第2步骤利用溶血磷脂酸酰基转移酶 (lysophophatidic acid acyltransferase ;LPAAT)，将溶血磷脂酸(Lyso-ΡΑ)转化为磷脂酸(PA)；第3步骤利用磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase ;PAP)，将磷脂酸 (PA)转化为二酰基甘油(DAG)；以及第4步骤利用二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase ；DGAT)，将酰基甘油(DAG)转化为甘油三酯(TGA)。
本发明的设计将编码上述脂质生物合成途径中关键酶的核苷酸序列，重组于上述表达载体的多重克隆位点，通过将该表达载体转化至微藻而大量繁殖时，该编码脂质生物合成关键酶的核苷酸序列被大量表达，提高微藻的产油效率。
具体地说，本文选用编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的核苷酸序列(SEQ ID NO 1 6)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的核苷酸序列(SEQ IDNO 7 10)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的核苷酸序列(SEQ ID NO 11 12)、磷脂酸磷酸酶(PAP)的核苷酸序列 (SEQ ID NO 13 16)及二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的核苷酸序列(SEQ ID NO 17 21)，通过表达载体于宿主体内表达。本文更进一步选取编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的核苷酸序列(SEQ ID NO 22)及编码卡尔文循环中的碳酸酐酶(carbonic anhydrase ；CA) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :23)(图2左图)，希望从脂肪生物合成途径的上游端来提高脂肪产量。
上列酶及编码该酶的基因名称及来源如表1所示。
[表 1]
8
权利要求
1.表达载体，包括 蛋白质表达盒；和至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒两侧；其中该蛋白质表达盒包括第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(CaMV) 35S启动子、1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、硝酸盐还原酶(NR)启动子或上述组合 ο
2.如权利要求
1所述的表达载体，其中，该至少两个同源重组DNA片段包括LB片段 (SEQ ID N0:24)、RB片段(SEQ ID NO :25)、其部份序列、或上述组合。
3.如权利要求
1所述的表达载体，其中，该第一筛选标记包括编码红色荧光蛋白 (DsRed)的基因、编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因、或编码蓝色荧光蛋白(BFP)的基因，该第二筛选标记包括编码遗传霉素(G418)的基因、编码博莱霉素(Zeocin)的基因、或编码潮霉素(Hygromycin)的基因。
4.如权利要求
1所述的表达载体，其中，该多重克隆位点包括限制性酶切位点SacI、 EcoI、XbaI、SpeI、SmaI、EcoRI、HindIII、AccI、SalI Jci I、ApaI、KpnI、Acc65I、MRrh4273I、 MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、PspOMI 或上述组合。
5.如权利要求
1所述的表达载体，其中，该蛋白质表达盒还包括至少一个外源基因，其插入该多重克隆位点。
6.如权利要求
5所述的表达载体，其中，该外源基因包括选自下组的基因 编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO :1 6)、编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因(SEQ ID NO 7 10)、 编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因(SEQ ID NO 11 12)、 编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、 编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、 编码乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO :22)、 编码碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ ID N0:23)、以及与前述任一基因的序列同一性至少为80%的核苷酸序列。
7.如权利要求
1所述的表达载体，其中，该表达载体在微藻中表达。
8.如权利要求
7所述的表达载体，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、 雨生血红藻或栅藻。
9.一种在微藻中表达蛋白质的方法，包括将一外源基因克隆入如权利要求
1-6中任一项的表达载体中； 将该具有外源基因的表达载体转化至微藻中，以及表达该外源基因。
10.如权利要求
9所述的在微藻中表达蛋白质的方法，其中该转化步骤是使用电穿孔法。
11.如权利要求
9或10所述的在微藻中表达蛋白质的方法，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、雨生血红藻或栅藻。
12.—种应用微藻产生油脂的方法，包括提供一种如权利要求
1所述的表达载体；将至少一外源基因插入该多重克隆位点；将该具有至少一外源基因的表达载体转化至微藻中；以及于微藻中表达该至少一外源基因；其中，该外源基因包括编码与脂质生物合成相关的酶的基因或与前述基因的序列同一性至少为80%的基因。
13.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其中，该外源基因包括选自下组的基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因(SEQ IDNO :1 6)、编码甘油_3_磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因(SEQ ID NO :7 10)、编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因 (SEQ ID NO :11 12)、编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、编码乙酰基-CoA羧基酶(ACCase) 的基因(SEQ IDNO :22)、编码碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ ID NO :23)、以及与前述任一基因的序列同一性至少为80%的核苷酸序列。
14.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、雨生血红藻、或栅藻。
15.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其中，该转化步骤是使用电穿孔法。
16.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其将单一外源基因插入该多重克隆位点，该单一外源基因为编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因，具有SEQ ID N0:1 6所示的序列；或编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因，具有SEQ ID NO 7 10所示的序列；或编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID N0:11 12所示的序列；或编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID NO :13 16所示的序列；或编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID NO 17 21所示的序列。
17.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其将两个外源基因插入该多重克隆位点，该两个外源基因为编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID NO 12所示的序列；以及编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID N0:16所示的序列；或编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因，具有SEQ ID NO :8所示的序列；以及编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID N0:20所示的序列。
18.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其将三个外源基因插入该多重克隆位点，该三个外源基因为编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID NO 19 所示的序列；编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID N0:12所示的序列； 以及编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID N0:16所示的序列。
19.如权利要求
12所述的应用微藻产生油脂的方法，其将四个外源基因插入该多重克隆位点，该四个外源基因为编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID NO 19 所示的序列；编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因，具有SEQ ID N0:10所示的序列；编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID NO :12所示的序列；以及编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID NO: 16所示的序列。
专利摘要
一种表达载体，包括蛋白质表达盒以及至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒两侧；其中该蛋白质表达盒包括第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(CaMV)35S启动子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose bisphosphate carboxylase)(RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、硝酸盐还原酶(NR)启动子或上述组合。
文档编号C12N15/63GKCN102559727SQ201110278884
公开日2012年7月11日 申请日期2011年9月20日
发明者简良荣, 谢欣如 申请人:明志科技大学, 财团法人工业技术研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan