专利名称:一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域：
，具体涉及一种羰基还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，该羰基还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯等前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。
背景技术：
(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(分子式为C6H5 (CH2)2CH(OH) COOCH2CH3,分子量为208.25，CAS号:90315-82-5 )是合成多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利药物，如贝那普利、西拉普利等的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗高血压、充血性心力衰竭等疾病。在抗高血压药物市场中，与非肽类血管紧张素II受体抑制剂、钙通道拮抗剂形成了三足鼎立的市场格局。国内对普利原料药需求旺盛，价格稳定，尤其是贝那普利等紧俏产品，主要依赖进口。因此，研究(R)_2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的手性合成具有广阔的应用前景。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、高转化率、高对映体选择性等多种优点。生物法又包括动力学拆分法和不对称合成法。其中，不对称合成法由于可实现100%的理论产率，更受研究者的青睐。
不对称合成法所研究的较多是用野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶进行催化。在已报道的不对称合成方法中，底物浓度的最高水平是400mM(82g/L)，所用催化剂为预处理的面包酵母(Baker’ s yeast),但是反应48h后仅有41.9%的底物转化成(R)_2_轻基-4-苯基丁酸乙酯，且对映体过量值(ee)只有87.5% (Biocatal.Biotransfor.2009,27,211-218)。很多其他报道可以达到高对映选择性的催化，但是生成的产物浓度一般都很低，不具备产业化的可行性。Zhang等用克鲁氏假丝酵母(Candida krusei SW2026)不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯制备(R) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，在底物浓度为2.5g/L时，ee值99.7%，分离得率95.1%。但当底物浓度提高到20g/L后，ee值降低到97.4%(Process Biochemistry 2009,44,1270-1275) oLavandera等用重组醇脱氢酶催化还原 5g/L的2-擬基-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-2-轻基-4-苯基丁酸乙酯，ee值99%以上,但是需要外源添加ImM NADH (ChemSusChem 2008，1，431-436)。林文清等用筛选的博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等,在水相和水/有机两相两相体系中，催化还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，产品ee值为84.9% -98.88%，然而该方法的产物浓度也不高，最高为50g/L(中国专利，公开号CN 101314784A)。
以上方法仅限于实验室规模，且存在产物浓度不高，需要添加昂贵辅酶，以及反应时间长等缺陷，不适合用于工业化生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(一般要求产物浓度应在100g/L以上)。
发明内容
[0005]本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的生物催化不对称合成(R)-2_羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应中酶催化活性偏低、底物耐受性差、产物浓度不够高，以及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好、反应时间短、无需额外添加辅酶的羰基还原酶，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该羰基还原酶在催化还原其他酮类底物中的用途。特别地，将该酶用于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备中，不仅催化反应时间短，而且不需要额外添加昂贵的辅酶NADP+或NADPH。
本发明通过下述技术方案以解决现有的生物法不对称合成(R)-2_羟基-4-苯基丁酸乙酯中存在的技术问题:
本发明提供一种羰基还原酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质:
(a)由序列表中SEQ ID N0.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
该羰基还原酶来源于光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234。该还原酶通过基因组挖掘的方法获得，所设计的挖掘方法具体为，以来自Saccharomycescerevisiae的三个还原酶YDL124w，YDR368w, YGL185c (均对2-羰基-4-苯基丁酸乙酯具有出色的立体选择性)的氨基酸序列做探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，选定一批预测的羰基还原酶，将所选的羰基还原酶进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过测定羰基还原酶活力和酶对2-羰基-4-苯基丁酸乙酯的立体选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的羰基还原酶。
根据本发明，SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的I个氨基酸残基的突变，如第220位的Asn突变为Asp所得的突变蛋白质具有羰基还原酶活性。
`[0012]本发明提供一种羰基还原酶基因，其是如下⑴或(2)的基因:
(I)由序列表中SEQ ID N0.1所示核苷酸序列组成的基因；
(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因:
(a)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明的羰基还原酶基因来源于光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC
2.234,具体制备方法可为:根据Genbank中收录的预测为还原酶的光滑假丝酵母(Candidaglabrata)基因(Genebank登录号:CAG61069.1)序列设计合成引物,较佳的,上游引物为:CGCGGATCCATGGTTAAGCAAGAATTCTTT ;下游引物为:GTGAAGCTTTTAGGCCTTCTGGGACTCTGA ；然后以光滑假丝酵母(Candida glabrata) CGMCC 2.234的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的还原酶全长基因序列。
本发明中，碱基序列如序列表中SEQ ID N0.1所示的基因，命名为CgKR2，全长936bp。其中，其编码序列(⑶S)从第I个碱基起至第933个碱基止，起始密码子为ATGj*止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
由于密码子的简并性，编码SEQ ID N0.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID N0.1。另外,还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID N0.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
SEQ ID N0.1的同系物也指启动子变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提闻目标蛋白的表达水平。
SEQ ID N0.1的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQ ID N0.1所示序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2
8X SSC0 20 X SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50 70°C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6XSSC+0.1wt% SDS溶液，更优选为5XSSC+0.1wt% SDS0当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明提供一种包含本发明的还原酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组 表达载体:将通过PCR扩增所得的还原酶基因产物用限制性内切酶BamHI和Hindi 11双酶切，形成互补的粘性末端，同时将克隆载体和表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的还原酶基因的重组表达质粒pET-CgKR2。
本发明提供一种包含本发明的还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5a。将前述重组表达质粒pET_CgKR2转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-CgKR2。
本发明提供一种重组还原酶的制备方法，其包括如下步骤:培养本发明的重组表达转化体，获得重组还原酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可本领域任何可使转化体生长并产生本发明的还原酶的培养基，对于菌株，优选LB培养基:蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于菌株，优选下述方法:将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coliBL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD6tltl达到0.5-0.7 (优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L (优选0.5mmol/L)的异丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组羰基还原酶。
本发明提供一种新型的羰基还原酶作为催化剂，应用在不对称还原潜手性羰基化合物以制备光学活性手性醇。
较佳的，所述的应用按下述方法进行:在pH 5.5-7.0的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在本发明的还原酶或重组还原酶的作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。
上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下:所述的前手性羰基化合物较佳的为α -酮酯或β -酮酯或芳基酮类化合物。本发明优选如式1、2、3所示的前手性羰基化合物:
权利要求
1.一种如序列表中SEQ ID N0.2所示氨基酸组成的羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，其特征在于，所述的前手性羰基化合物为如式1、2或3所示的前手性羰基化合物:
2.如权利要求
1所述的应用，其特征在于，所述的应用按下述方法进行:在PH5.5-7.0的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在如序列表中SEQ ID N0.2所示氨基酸序列组成的羰基还原酶作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。
专利摘要
本发明公开了一种新的羰基还原酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯等前手性羰基化合物制备手性醇中的应用。本发明的羰基还原酶基因来源于光滑假丝酵母，可作为催化剂应用于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯等多种光学活性手性醇的制备。与其他制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法相比，本方法催化制备的产物浓度高，不需要额外添加昂贵的辅酶，且产物光学纯度高，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在普利类降压药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。
文档编号C12N15/53GKCN102492668 B发布类型授权 专利申请号CN 201110387573
公开日2013年6月26日 申请日期2011年11月29日
发明者许建和, 沈乃东, 钱小龙, 张 杰, 郑高伟, 李春秀, 潘江 申请人:华东理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),