专利名称:卡特拉链霉菌nb20及其培养方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物保护(微生物农药)领域，具体涉及一种卡特拉链霉菌NB20及其培养方法和应用。
背景技术：
植物病原菌(包括真菌、细菌、病毒等)引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。香蕉是世界著名的热带水果，也是华南地区四大名果之一，香蕉产业在华南地区的农业和社会发展中起着重要的作用。香蕉采后果实腐烂一直是制约我国香蕉产业发展的重要因素之一，腐烂损失高达15% 30%,而由香蕉炭疽病菌iColletotrichum SMAsae)引起的炭疽病(anthracnose)是导致香蕉果实腐烂的重要原因之一，严重影响着我国香蕉的北运和出口。目前多采用杀菌剂浸果防治香蕉果实腐烂，以延长货架期。随着人们环保意识的增强和病原菌抗药性的出现，生物防治已经成为控制香蕉果实采后病害的研究热点。
植物周围不仅存在病原菌，而且还存在着大量的非病原菌，其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单。因此，利用拮抗微生物来防治植物病害的研究正越来越受到国内外的重视。目前，人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己经进入实际应用阶段，产生了相当的社会效益和环境效益。
除了运用化学农药和植物提取物防控植物病害外，在微生物方面，也有关于利用枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等拮抗微生物进行植物病害防治的报道，如中国专利文献:一种植物内生枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，
公开日:2004/06/23,公开号为:1506455 ;—株可产生铁载体的植物病原真菌拮抗菌及其应用，
公开日:2008/07/30，公开号为:101230327 ;—株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用，
公开日:2008/08/27，公开号为:101250495 ;—种铜绿假单胞菌DlO及其制备方法与应用，
公开日:2010/04/28，公开号为:101698828A ;—种枯草芽孢杆菌A16及其制备方法与应用，
公开日:2010/04/28，公开号为:101698829A。其它文献:罗萍等.香蕉炭疽菌拮抗生防菌株的筛选及鉴定.现代食品科技，2011-4-19 ;陈旭玉等.香蕉炭疽病拮抗细菌的分离和初步鉴定.微生物学杂志，2011-01-18 ;许曼琳等.芽孢杆菌两菌株对香蕉炭疽病菌的抑制作用及其机制.云南农业大学学报，2009-08-21 ;赵志颖等.香蕉炭疽病生防拮抗菌筛选及其作用机制.福建农业大学学报，1998-06-12 ;何红 等.辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病.福建农业大学学报，2002-12-30。未见有关于卡特拉链霉菌在植物病害防治方面的报道。
发明内容
[0005]本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一株具有可抑制包括香蕉炭疽病菌在内的多种植物病原菌的放线菌菌株。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
卡特拉链霉菌NB20,分类命名为:卡特拉链霉菌Sirepio焊Ce1S Aairae,于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.5382。本发明中对上述菌株简称为卡特拉链霉菌ΝΒ20。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种生物菌剂，该生物菌剂含有卡特拉链霉菌NB20或含有卡特拉链霉菌NB20发酵液(即培养液)经过滤后的无菌滤液，所述无菌滤液优选用卡特拉链霉菌NB20培养液经过离心取得的上清再经过细菌过滤器过滤获得。
该卡特拉链霉菌NB20的培养方法,培养条件如下:以大豆粉发酵液(大豆粉10.0g, NaCl 2.5 g，CaCO3 2.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混匀至I L)为培养基，在28 °C、转速180 r/min条件下培养4 d，即得到可直接应用的菌液。
卡特拉链霉菌NB2O在制备防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。所述植物病原菌为香蕉炭疽病菌iCoIletotrichum musae)>稻痕病菌iPyriculariaoryzae )、小麦赤霉病菌(bberella zeae )、香蕉枯萎病菌 iFusari um oxysporum f.sp.cMeflse)、蒸枝霜疫霉菌iPeronophythora Iitchii)、甘鹿黑腐病菌iCeratocystisadiposum)、番爺叶霉病菌iFulvia fulKa)、水稻白叶枯病菌iXanthomonas oryzae pv.和/或水稻细菌性条斑病菌Cf.0ryzae pv.0ryzicola)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
经过实验证实 ，本发明的卡特拉链霉菌NB20发酵液(菌剂)对香蕉炭疽病菌菌丝的抑制率为91.57%。室内生防试验结果表明，该菌株的发酵液(菌剂)对香蕉果实炭疽病具有较好的防治效果，达50.90%。此外，该生防菌株对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌等重要经济作物病原菌也具有强烈的抑制作用。因此，该菌株是一种对多种植物病原真菌和细菌都具有抑制作用的广谱的生防菌株，且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点，能够进行商业开发，应用前景广阔。
图1.菌株NB20的培养形态，A为培养形态，a为高氏一号培养基上的培养结果，b为LB培养基上的培养结果，B为菌株NB20的孢子丝形态。
图2.菌株NB的16S rDNA序列与相近菌株序列的系统发育树。
图3.卡特拉链霉菌NB20对香蕉果实炭疽病的防治效果，I为CKl ;2 5为菌株NB20实验组；6 7为CK2。
具体实施方式
实施例1卡特拉链霉菌NB20的筛选及鉴定
1、菌株的筛选
(I) 土壤样品的采集[0019]本实验从华南农业大学农场果园采集土样，根据采集地的地形等采用5点取样，取样深度为耕作层或地表以下15 cm，取量200 250 g，每个地点采集的5个样本均匀混合，装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室马上分离。
(2)样品悬浮液的制备
将土壤样品加入灭菌水中激烈震荡。样品:水=1:9 (质量与体积比)，如:10 g 土壤加入装有90 mL灭菌水的三角瓶中所得悬浮液浓度为10_/每种样品各准备5支装有9 mL灭菌水的试管按10倍梯度稀·释法，将上述浓度为KT1的悬浮液稀释成10_2 10_6的系列浓度悬浮液，即从I号试管中吸取1 mL悬浮液放入2号试管(盛有9 mL灭菌水)中，充分震荡混匀，再从2号试管中吸取1 mL悬浮液放入3号试管(盛有9 mL灭菌水)中，依此类推，直至第6支试管为止，得到系列稀释浓度的土样悬浮液。
(3)分离方法
采用高氏I号培养基(加入重铬酸钾，终浓度为0.05 g/1000 mL)和低稀释度土样悬浮液(10_2 10_4)进行实验。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.5 mL，滴加于培养基平板上(3平板/稀释度)，用灭菌的L型玻棒涂布均匀，稍晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，于25 28°C温箱中培养2 3 d，根据平板上长出的单菌落挑出到新的含重铬酸钾的高氏I号培养基上纯化培养，对全部分离到的菌株(称为待测菌株)进行编号，然后对其拮抗活性进行初筛和复筛，以获得本专利菌株。
(4)拮抗菌的初筛和复筛
采用平板对峙培养法，检测上述各种待测菌株对香蕉炭疽病菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培养好的香蕉炭疽病菌等病原菌的菌落边缘打取直径5 _的菌丝块，接种在PDA平板中央，再将已经活化的各种待测菌株接种在香蕉炭疽病菌等病原菌的菌丝块四周2 3cm处，每个PDA平板接种4个待测菌株，设置不接种待测菌株的对照，每处理3次重复。在25 28°C下培养:T5 d，然后测量待测菌株与香蕉炭疽病菌等病原菌之间的抑菌带宽度，作为拮抗活性强弱的指标。
经过上述初筛和复筛，获得一株对香蕉炭疽病菌等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株，编号为NB20，保存备用。
、鉴定过程实验数据
( 1)形态学观察
在高氏I号培养基上培养，NB20菌株的菌丝浓密，生长初其为乳白色，后变为紫红色。基内菌丝发育良好，交织紧密，有大量分枝，无横隔膜，不断裂；气生菌丝生长良好，多分支，可形成孢子链，孢子丝直形或波曲，顶端卷曲，孢子圆柱形、表面光滑；在LB培养基上，菌落近圆形，乳黄色，边缘较整齐，菌体表面有褶皱，产生黑褐色可溶性色素(图1)。
(2)培养性状观察
菌株NB20在所选的8种培养基上，其气生菌丝和基内菌丝的颜色有一定变化，气生菌丝的颜色多为灰白至牵牛紫色。另外，该菌株只在马铃薯块上形成黑色可溶性色素，在其它培养基上都均不形成可溶性色素。详细结果见表I。
表1菌株NB20的培养性状
权利要求
1.卡特拉链霉菌(5 /.<9/7 ο /^ 5.)ΝΒ20,于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.5382。
2.权利要求
1所述卡特拉链霉菌ΝΒ20，其特征在于该菌株的16SrDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
3.—种生物菌剂，其特征在于含有权利要求
1或2所述卡特拉链霉菌NB20或含有卡特拉链霉菌NB20发酵液经过滤后的无菌滤液。
4.权利要求
1或2所述 卡特拉链霉菌NB20的扩大培养方法，其特征在于培养条件如下:以大豆粉发酵液为培养基，在28 °C、转速180 r/min条件下培养4 d； 其中大豆粉发酵液配方为:大豆粉10.0 g，NaCl 2.5 g，CaCO3 2.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混匀至I L。
5.权利要求
1或2所述卡特拉链霉菌NB20在制备防治植物病原真菌和/或植物病原细菌引起的植物病害菌剂中的应用，所述植物病原真菌为香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌；所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
专利摘要
本发明公开了卡特拉链霉菌NB20及其培养方法和应用，该菌株于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5382。经研究发现，该菌株对香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌均具有强烈的抑制作用，为广谱拮抗菌，可用于多种植物病害的防治，尤其是对香蕉果实炭疽病的防治效果较好，且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点，应用前景广阔。
文档编号C12N1/20GKCN102433281 B发布类型授权 专利申请号CN 201110423430
公开日2013年5月1日 申请日期2011年12月16日
发明者杨媚, 舒灿伟, 周而勋, 高艳丽, 张德涛, 范家平 申请人:华南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (1),