专利名称:一种活性小分子阿胶的混合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种活性小分子的混合物及其制备方法和应用，特别涉及一种通过酶解阿胶胶汁得到的活性小分子阿胶的混合物及其制备方法和应用。本发明属于食品生物技术领域：
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背景技术：
阿胶乃补血养气圣药，早在东汉时期著名医药著作《神农本草经》中就被列为“上品”，并记载“久服益气轻身”。阿胶性甘，平，其功能主要补血滋阴，润燥、止血。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽唠血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏等。据2010年版的中国药典记载，阿胶本品为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、 浓缩制成的固体胶。但阿胶中的胶原蛋白分子量较大(几万到十几万)，对于脾胃虚弱的人群，吸收较难，导致阿胶的功效无法得到充分发挥。同时，近些年驴的存栏量不断下降，直接导致了驴皮供应不足，以及阿胶价格的不断上涨，日益紧张的驴皮原料已难以满足现在市场的巨大需求，而阿胶酶解得到小分子阿胶可大幅提高产品生物利用度，为缓解阿胶供需矛盾提供了一种很好的解决方案。
在近几年关于阿胶酶解研究中，取得了一些进展，同时发表了一些专利，主要包括(1)《一种酶水解法制备液体阿胶的方法》，公开号为CN1237421A ； (2)《活性阿胶胶原蛋白肽产品》，公开号为CN1807653A ； (3)《一种低分子量阿胶水解物的制备方法》，公开号为 CN101269090A。此三项发明都报道了采用蛋白酶酶解阿胶制得胶原蛋白肽的方法。本发明在现有技术的基础上，针对阿胶中脯氨酸和羟脯氨酸含量较高的特点，首次采用了脯氨酸蛋白酶酶解阿胶，酶解效果明显好于已报道的专利，上述三项发明中所报道的制备的产品分子量多数分布在5000Da甚至IOOOODa以内，且对包括分子量分布和游离氨基酸含量都未进行准确测定，而本发明产品肽段分布于200-3000Da，且主要分布在200-1000Da内；且专利号分别为CN1237421A和CN1807653A的两项发明都是采用含有辅料的阿胶块作为酶解原料，而本发明采用阿胶胶汁作为酶解原料，可以节约成本，简化工艺，而且制备的产品溶解性好，生物利用度高，对DPPH和ABTS自由基有接近100%的清除率。
已有许多国内外文献报道(Adibi A S. America Nutrition, 1984,25 :1114_1122 ； D.B.A. Silk. Gut, 1974,15 =494-501)分子量居于200_1000Da之间肽段的吸收及功效相对于其他大小的肽段和游离氨基酸都更佳。本发明以未加辅料的阿胶胶汁为原料，准确测定了产品中游离氨基酸含量和分子量分布情况，同时所制备的产品大多为分子量居于 200-1000Da之间的小肽，因此吸收和功效更好。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明的目的之一在于提供一种活性小分子阿胶的混合物。
本发明的目的之二在于提供一种所述的活性小分子阿胶的混合物的制备方法。[0007]本发明的目的之三在于提供所述活性小分子阿胶的混合物在制备阿胶的小分子肽类食品和保健食品中的应用。
为了达到上述的目的，本发明采用了如下的技术手段
本发明的一种活性小分子阿胶的混合物，其特征在于产品重均分子量为 580-1300Da，肽段分布于200_3000Da之间，主要分布在200_1000Da之间。
在本发明中，所述的活性小分子阿胶的混合物可由不含辅料的阿胶胶汁通过复合蛋白酶水解后得到。
所述的复合蛋白酶中包括木瓜蛋白酶和脯氨酸蛋白酶，优选的，所述的复合蛋白酶中还可以包括菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或风味蛋白酶中的任一种或几种或全部。
在本发明中，所述的一种活性小分子阿胶的混合物可制成为粉剂或液体制剂。
本发明的一种活性小分子阿胶的混合物的特点为(1)可制成粉剂或液体制剂用于口服；(2)溶解性能很好，即使在冷水中也有很高的溶解速率；(3)游离氨基酸含量低 (仅占4%)，分子量介于200-IOOODa的小肽占比达81 %，介于1000-3000Da的肽段占比 14% (见图1)，重均分子量为765Da;(4)生物利用度方面，小分子阿胶是普通阿胶的3. 5 倍，是仿生消化阿胶的2. 2倍(见图2) ； (5)在抗氧化功效方面，小分子阿胶具有很好的清除包括ABTS和DPPH自由基的功效，在10mg/ml浓度时清除率都可接近100% (见图3和 4)。
本发明还提供了一种制备所述的活性小分子阿胶混合物的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)将不含辅料的阿胶胶汁于室温冷却至30-55度，pH控制为5-8，加入复合蛋白酶进行水解反应0. 5-2小时，得到阿胶胶汁水解液；
(2)将经步骤(1)水解后得到的阿胶胶汁水解液加热煮沸，维持10-30分钟，使酶灭活，得到灭活液；
(3)灭活液离心去除杂质，得到活性小分子阿胶的混合物液体制剂。
本发明的一种制备所述的活性小分子阿胶混合物的方法还可进一步包括将得到的活性小分子阿胶的混合物液体制剂经喷雾干燥后制成活性小分子阿胶的混合物粉剂。
在本发明所述的方法中，所述的辅料包括黄酒、冰糖和豆油；所述的不含辅料的阿胶胶汁即为不含包括黄酒、冰糖和豆油在内的阿胶胶汁。
在本发明的具体实施例中，步骤(1)中所述的阿胶胶汁的浓度(w/w)为 10% -50%。
在本发明的具体实施例中，所述的复合蛋白酶中包括木瓜蛋白酶和脯氨酸蛋白酶，优选的，所述的复合蛋白酶中还可以包括菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或风味蛋白酶中的任一种或几种或全部。
在本发明的具体实施例中，其特征在于步骤(1)所述的复合蛋白酶的添加量为阿胶胶汁重量的5%。-3% (w/w)，所述的复合蛋白酶加入顺序为几种酶按先后顺序每隔一定时间依次加入，或几种酶在酶解起始阶段同时加入。
在本发明的具体实施例中，按重量计，所述的复合蛋白酶中各酶的添加比例为木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶=2 1 ；或木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或风味蛋白酶中任一种=5 2 1，其他比例不再详述，本领域技术人员可以根据实际使用情况在不进行任何创造性劳动的前提下做出多种选择。
本发明进一步提供了所述的活性小分子阿胶混合物在制备阿胶的小分子肽类食品和保健食品中的应用吸收更好，溶解性很好，抗氧化效果很好，利于粉剂或口服液类食品和抗氧化延缓衰老类保健食品的开发。
相较于现有技术，本发明的优点在于
1、采用未添加任何辅料的阿胶胶汁作为原料，工艺简化、高节能、低成本、高水解效率，且保证喷雾干燥所得产品的结构和性能的稳定良好。
2、通过离心去脂除杂，保证产品溶解性好、无脂肪，利于相关食品和保健食品的开发。
3、喷雾干燥制得粉状原料，储藏成本低，且易于胶囊和冲剂产品的开发。
4、产品检测技术先进，准确确定了产品中游离氨基酸含量及肽段分布情况。
5、酶解工艺先进，产品肽段主要分布在200_1000Da之间，分子量较已报道工艺所制得的产品更低，吸收效果和功能效果更好。
6、产品生产工艺先进、实用性强，小分子阿胶得率很高，以40%的IL阿胶胶汁原料为例，酶解并后续生产得到的粉状产品约360g，得率达90%。
7、对制得的原料的生物利用度和抗氧化功效进行了初步的测定，效果都十分好。
图1为采用高效凝胶色谱技术结合氨基酸分析技术确定的活性小分子阿胶的混合物分子量分布图；
图2为通过小鼠灌胃取血，检测血中羟脯氨酸含量以确定的产品生物利用度的比较图；
普通阿胶即未经处理的普通阿胶样品；
仿生消化阿胶模仿人体胃肠道消化系统，采用胃蛋白酶和肠胰酶酶解阿胶；
小分子阿胶即通过本发明的活性小分子阿胶混合物；
图3为本发明的活性小分子阿胶混合物的DPPH自由基清除实验结果图；
图4为本发明的活性小分子阿胶混合物的ABTS自由基清除实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明具体实施例中所涉及的实验材料来源
1、阿胶胶汁(不含有黄酒、冰糖和豆油。)购自山东东阿阿胶股份有限公司；
2、各种酶
风味蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司；
木瓜蛋白酶、胃蛋白酶购自上海柯原实业有限公司；[0046]脯氨酸蛋白酶购自上海远大商务有限公司；
3、ABTS和DPPH自由基购自上海西格玛奥德里奇有限公司。
实施例1
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至35度，pH控制为6. 5，加入5%。(w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶=2 1)进行水解反应2小时，后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，得到活性小分子阿胶的混合物液体制剂。经测定产品分子量大多居于200-3000Da， 占比为83%。
实施例2
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至35度，pH 控制为6. 5，加入5%0 (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶=2 1)进行水解反应2小时，后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da,占比为83%。
实施例3
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至40度，pH 控制为5. 5，加入(w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶胃蛋白酶=5 2 1)进行水解反应2小时，后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为86%。
实施例4
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为10% )于室温下冷却至35度，pH 控制为6，加入2% (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶=6 3 1 1 1)进行水解反应2小时， 后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g 粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为75%。
实施例5
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至50度，pH 控制为6. 5，加入3% (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶=6 2 2 1 1)进行水解反应2小时， 后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g 粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为95%。
实施例6
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至40度，pH 控制为6. 5，加入3% (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶=6 2 2 1 1)进行水解反应0.5小时，后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为83%。
实施例7[0061]将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至40度，pH 控制为6. 5，加入5%0 (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶=6 2 2 1 1)进行水解反应2小时， 后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g 粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为71%。
实施例8
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至40度，pH 控制为6. 5，加入1. 5% (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶=2 1)进行水解反应0.5小时，后加入5%。胃蛋白酶继续水解反应0.5小时，后加入5%。(w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(中性蛋白酶风味蛋白酶=1 1)继续水解反应1小时，后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为 87%。
实施例9
将IL未加辅料的阿胶胶汁(胶汁浓度(w/w)为40% )于室温下冷却至50度，pH 控制为6. 5，加入3% (w/w)阿胶胶汁重量的复合蛋白酶(按重量计，木瓜蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶菠萝蛋白酶=6 2 2 1 1)进行水解反应2小时， 后加热煮沸维持20分钟灭酶活，离心去除不溶性杂质与脂肪，最后通过喷雾干燥制得360g 粉状活性小分子阿胶的混合物。经测定产品分子量大多居于200-3000Da，占比为65%。
将实施例5制备得到的粉状阿胶胶原蛋白小肽的混合物用于以下试验分析。
实施例10活性小分子阿胶混合物肽段分布测试
1. 1高效凝胶色谱测试
测试仪器
液相系统Agilent1100 ；高效凝胶色谱柱TSK-G2000 SKwl (300mm*7. 8mm，平均孔径500 A)。
测试步骤
取Iml酶解后样品，10，OOOg离心2分钟，取上清通过0.45 μ m—次性过滤器过滤，滤液加入进样瓶中。柱温为27°C，流动相为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 2)，流速为 0. 5ml/min,检测波长280nm，进样体积20 μ 1。
1. 2游离氨基酸含量测试
测试仪器
质谱仪3200 Q Trap ；液相系统岛津UFLC系统；分析柱氨基酸专用柱，AB Sceix ；保护柱C18 (4. 0X3. 0mm, 5 μ m) Phenomenex 公司。
测试步骤
取20 μ L混勻后的液体样品，加入5 μ L沉淀剂，混勻，10，OOOg离心2分钟，吸取上清液5 μ L力口入20 μ L标记缓冲液，混勻，取上清夜5 μ L力口入2. 5 μ L标记试剂，混勻，室温反应30min，反应30min后加入2. 5 μ L羟胺，混勻，40°C氮气吹干，加入16 μ L内标液重组， 混勻，吸取16 μ L至进样瓶中，进样5 μ L测氨基酸浓度。
1. 3测试结果
7[0079]实验结果如图1所示。从图1可以看出，分子量介于200-1000Da的小肽含量很高，达到81%，介于1000-3000Da的肽段占14%，游离氨基酸含量很低，只有4%，重均分子量为765Da。结合背景中所述分子量居于200-1000Da之间肽段的吸收及功效相对于其他大小的肽段和游离氨基酸都更佳。可以认为，本发明的产品相对其他胶原蛋白肽产品有更快的吸收速率以及更好的功能效果。
实施例11、生物利用度测试
测试材料
普通阿胶即未经处理的普通阿胶样品；
仿生消化阿胶模仿人体胃肠道消化系统，采用胃蛋白酶和肠胰酶酶解阿胶；
小分子阿胶即本发明的活性小分子阿胶混合物；
取健康小鼠24只，雌雄各半，体重200_250g之间，随机分为A组、B组和C组。服药前禁食12h，次日晨A组、B组和C组分别空腹灌胃阿胶、仿生消化阿胶和小分子阿胶(Img 样品 /IOg 体重)，给药 4h 后统一进食，于给药 Oh,0. 25h、0. 5h、lh、2h、3h、4h、6h、8h、10h、 12h、18h、24h眼眶取血，后经处理采用氨基酸分析方法分析血中羟脯氨酸含量用以标定样品生物利用度(羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性氨基酸)。
结果如图2所示，从图2中可以看出，在生物利用度方面，本发明的阿胶胶原蛋白小肽混合物是普通阿胶的3. 5倍，是仿生消化阿胶的2. 2倍。此数据证明了本发明的活性小分子阿胶混合物具有分子小、高吸收的特点。
实施例12抗氧化效果测试
1. 1应用于DPPH自由基清除效果考察
测试步骤
在具塞试管中加入样品溶液1. 5mL和DPPH溶液1. 5mL，摇勻后避光反应30min，于 517nm波长处测定吸光度(AS)，同时测定1. 5mL 0. lmmol/L DPPH溶液与1. 5mL乙醇混合液的吸光度(AC)，以及1. 5mL样品溶液与1. 5mL乙醇混合液的吸光度(AB)，计算公式
权利要求
1.一种活性小分子阿胶的混合物，其特征在于所述的混合物重均分子量为 580-1300Da，肽段分布于200_3000Da之间，主要分布在200_1000Da之间。
2.根据权利要求
1所述的活性小分子阿胶的混合物，其特征在于所述的混合物由不含辅料的阿胶胶汁通过复合蛋白酶水解后得到。
3.根据权利要求
1或2所述的活性小分子阿胶的混合物，其特征在于所述的混合物为粉剂或液体制剂。
4.一种制备权利要求
1-3任一项所述的活性小分子阿胶的混合物的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将不含辅料的阿胶胶汁于室温冷却至30-55度，pH控制为5-8，加入复合蛋白酶进行水解反应0. 5-2小时，得到阿胶胶汁水解液；(2)将经步骤(1)水解后得到的阿胶胶汁水解液加热煮沸，维持10-30分钟，使酶灭活， 得到灭活液；(3)灭活液离心去除杂质，得到活性小分子阿胶的混合物液体制剂。
5.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于进一步包括将得到活性小分子阿胶的混合物液体制剂喷雾干燥后制得活性小分子阿胶的混合物粉剂。
6.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于所述的辅料包括黄酒、冰糖和豆油。
7.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的阿胶胶汁的浓度为 10% -50%。
8.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于所述的复合蛋白酶包括木瓜蛋白酶和脯氨酸蛋白酶，优选的，所述的复合蛋白酶还包括菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或风味蛋白酶中的任一种或几种或全部。
9.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的复合蛋白酶的添加量为阿胶胶汁重量的5%0 _3%，所述的复合蛋白酶加入顺序为几种酶按先后顺序每隔一定时间依次加入，或几种酶在酶解起始阶段同时加入。
10.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于，按重量计，所述的复合蛋白酶中各酶的添加比例为木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶=2 1 ；或木瓜蛋白酶脯氨酸蛋白酶菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶或风味蛋白酶中的任一种蛋白酶=5 2 1。
11.权利要求
1-3任一项所述的活性小分子阿胶的混合物在制备阿胶的小分子肽类食品或保健食品中的应用。
专利摘要
本发明公开了一种活性小分子阿胶的混合物及其制备方法和应用。本发明采用未加辅料的阿胶胶汁为酶解原料，并首次采用包括脯氨酸蛋白酶在内的复合蛋白酶对阿胶胶汁进行酶解，制得的产品纯度高，小肽含量高，游离氨基酸含量低(仅占4％)，分子量介于200-1000Da的小肽占比达81％，介于1000-3000Da的肽段占14％，重均分子量为765Da；对制得的原料的溶解性能、生物利用度和抗氧化功效进行了初步的测定，结果显示溶解性很好，生物利用度较普通阿胶提高2.5倍，对DPPH和ABTS自由基有接近100％的清除率。本发明对于具有千年历史的中药——阿胶的小分子肽类食品和保健食品的开发具有十分重要的意义。
文档编号A23L1/29GKCN102499376SQ201110450564
公开日2012年6月20日 申请日期2011年12月29日
发明者周祥山, 尤金花, 方喆, 秦玉峰 申请人:山东东阿阿胶股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan